任卫青[1]2012年在《昆明小鼠胚胎干细胞分离培养及其向原始生殖细胞诱导分化的研究》文中进行了进一步梳理目前，已建立的小鼠ES细胞系大多来源于129、C57BL/6J和BALB/C品系的小鼠，昆明小鼠作为我国科研工作中常用的实验动物，其建系的报道较少，因此建立昆明小鼠胚胎干细胞系对我国深入而便利地开展ES细胞以及其它生命科学领域的研究具有重要意义。SC1是一种小分子化学物，可以双重抑制Ras-GAP和ERK1，维持胚胎干细胞未分化状态。另外，近几年，已有多篇关于胚胎干细胞（Embryonic stem cells，ES细胞）在体外诱导条件下分化为原始生殖细胞（Primordial germ cells，PGCs），并进一步生成成熟配子的报道，但ES细胞向生殖细胞的诱导效率很低。本研究用昆明小鼠胚胎作为试验对象，比较了不同培养条件对昆明小鼠ES细胞分离培养的影响，研究了小分子化学物（Pluripotin，SC1）对昆明小鼠ES细胞未分化状态的维持作用，并用视黄酸（Retinoic acid，RA）对分离到的ES细胞向PGCs诱导分化进行了初步研究，为昆明小鼠ES细胞建系及向生殖细胞的体外分化研究提供参考。1.利用MTT法检测丝裂霉素C（10μg/mL）处理不同时间后小鼠胎儿成纤维细胞（Mouseembryonic fibroblast, MEF）活力变化情况。结果表明，以3代以内MEF制备饲养层，用浓度为10μg/mL的丝裂霉素C处理2~2.5h，MEF活力最稳定，可以维持小鼠胎儿成纤维细胞7d以上不增殖也不死亡，是制备饲养层的适宜条件。2.将见栓后3.5~4d的胚胎分别接种于密度为1×104、1×105、1×106/mL的饲养层上，比较胚胎在不同密度饲养层上贴壁、内细胞团（Inner cell mass，ICM）集落形成及ES细胞的克隆生长情况。同时，以无血清培养基为基础培养液，研究胚胎发育阶段和培养液中添加不同生长因子对昆明小鼠ES细胞增殖的影响。结果显示，胚胎在密度为1×105/mL的饲养层上，F1代和F2代ES细胞集落出现率均显着高于其他2组(P<0.05)。囊胚的F2代ES细胞克隆出现率显着高于桑葚胚(P<0.05)，培养液中同时添加干细胞因子（Stem cell factor，SCF）和胰岛素的胚胎贴壁率及F1、F2代ES细胞集落出现率显着高于其他2组(P<0.05)。对分离的ES细胞进行形态观察、碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，AKP）染色，免疫荧光染色检测小鼠ES细胞全能性特异标志物的表达，证实所分离的ES细胞符合小鼠ES的一系列特征。由此认为，发育至囊胚的胚胎在饲养层密度为1×105/mL上，培养液中同时添加胰岛素和SCF适合昆明小鼠ES细胞的分离培养。3.比较了在含血清替代品（Knockout serum replacement，KSR）的高糖DMEM培养液中（H-DMEM）分别添加SC1和白血病抑制因子（Leukemia inhibitory factor，LIF）对昆明小鼠ES细胞未分化状态的维持作用，并探讨了SC1在培养液中的最佳浓度。以MEF为饲养层，以含LIF的无血清胚胎干细胞培养液为对照，分别用浓度为300nM、1μM、3μM的SC1代替LIF对昆明小鼠胚胎进行分离培养。结果显示，胚胎在添加3μmSC1的培养液中ICM集落形成率显着高于对照组（P<0.05），形成的ES集落与对照组形态差异不明显，最高传至第7代，并且在无饲养层条件下可以传至第6代而保持未分化状态。不同浓度SC1培养液中，胚胎在SC1浓度为300nM组的F2代ES细胞集落出现率显着高于1μM和3μM组（P<0.05），所分离的ES细胞AKP染色呈阳性，Oct4、Nanog、Sox2的免疫荧光染色均显阳性，具有ES细胞的特点。这一结果表明无血清培养液中SC1可以替代LIF用于昆明小鼠ES细胞未分化状态的维持，并且可以在无饲养层条件下进行昆明小鼠ES细胞的培养。4.探讨了RA诱导昆明小鼠ES细胞向PGCs分化的能力及适宜浓度。采用悬滴培养法使分离到的第3代ES细胞形成类胚体（Embryonic bodys，EBs），将第3d形成的EBs，接在铺有0.1%明胶的48孔板中，5个EB/孔，分别用浓度为0.2μM、1μM、5μM的RA和不加RA的培养液进行培养。第10d免疫荧光染色的结果表明，浓度为1μM的RA诱导小鼠ES细胞分化为PGCs的效率显着高于其它组（P<0.05），SCP3和VASA的阳性率表达率分别是31.8%和30.4%，均高于其它组，表明RA可以诱导昆明小鼠ES细胞向PGCs分化，最佳浓度为1μM。
宋晓平[2]2003年在《小鼠胚胎干细胞定向诱导分化成骨细胞研究》文中提出胚胎干细胞(ES细胞)，是存在于早期胚胎内细胞团(ICM)的一种多潜能细胞。在体外抑制分化培养时，ES细胞可无限增殖并保持正常的二倍体核型，一旦撤除分化抑制因素，或添加适当诱导剂，ES细胞可发生谱系分化或定向分化。本研究在回顾ES细胞研究文献的基础上，进行了小鼠ES细胞的分离与克隆、ES-D3细胞系的扩增和分化能力检测，以及应用成骨细胞条件培养基、维生素C、β-磷酸甘油和地塞米松进行了定向诱导ES-D3细胞系向成骨细胞的分化。 1．MEF的分离与生长曲线 小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)在24孔培养板内以密度5.0×10~3/mL，每孔接种1mL，间隔2d或4d换液1次，细胞增殖缓慢，倍增时间(Td)分别为47.13和47.96h，细胞活力较差。以密度5.0×10~4／mL，每孔接种1mL，每间隔2d换液1次，MEF增殖较快，Td为53.12h，第2～3d时需及时传代，否则细胞易出现老化卷层，间隔4d换液时细胞增殖速度减慢，Td为57.80h。以密度2.0×10~4／mL，每孔接种1mL，间隔4d换液1次，MEF增殖速度快，Td为35.38h，第3～5d时传代较适宜，间隔2d换液时MEF增殖减慢，Td延长至41.56h。 2．丝裂霉素C对MEF的影响 MEF以密度3×10~4／mL接种24孔培养板，在24h后分别经10μg／mL丝裂霉素C处理30、90和180min。在培养的第3，5，7，9，11d时，MEF增殖抑制与未经丝裂霉素C处理比较，均存在极显着差异(P＜0.01)，但叁种不同的处理时间组间均无显着性差异(P＞0.05)。这说明，丝裂霉素C处理30min即可极显着抑制MEF的增殖，并可至少维持11d。 3．小鼠ES细胞的分离培养 应用MEF饲养层，以DMEM培养基添加15％FBS、10ng／mL rmLIF、0.1mmol／L2-Me、80U／mL青霉素、100U／mL链霉素，3.5dpc昆明系小鼠囊胚24h后脱去透明带，但极少有囊胚贴壁，48h时囊胚贴壁率为39％，72h贴壁率达74％，ES细胞集落形成率为8％，体外最高传5代。 4．ES-D3细胞系的扩增 以MEF为饲养层，DMEM培养基(含0.1mmol／L 2-Me+80U／mL青霉素+100U／mL链霉素)中添加15％KSR或15％FBS，，ES-D3细胞扩增培养48h时具有典型的集落形态，ES细胞增殖速度快，每天换液1次，间隔48h传代1次；添加15％NBS，维持ES细胞的有效增殖和存活效果较差，传第3代时消失。以STO细胞作饲养层，添加15％FBS，在倒置显微镜下观察，ES-D3细胞不易与周围的STO饲养层细胞区别，形成的集落较平坦，生长状态不如MEF饲养层好。 5.ES一D3细胞系的自主分化 ES一D3细胞悬浮培养，24h后可聚集成小的细胞团，第2~3d时形成大量的类胚体(EBs)。继续悬浮培养第6~8d时，EBs外围细胞开始脱落，延长悬浮培养时间至第10d时EBs大量死亡。悬浮培养的ES细胞及EBs易贴壁生长，特别是培养的第1~Zd，贴壁细胞较多，用吸头轻轻吹打可使贴壁的细胞和EBs重新悬浮。悬浮培养过程中未观察到囊状胚体的形成，但当EBs贴壁培养至第6d后出现囊状类胚体。ES一D3源的EBs在贴壁培养第9一1 Od时出现神经样细胞、成纤维样细胞，第14d时，EBs生长晕周围重新出现ES细胞集落，这些集落可存在较长时间。第23d后出现典型的长扁平状血管内皮细胞，并可排列成索状且形成血管样结构，随后血管内皮细胞逐渐消失。第3ld时，HE染色还显示存在一些多角形细胞。 6.小鼠成骨细胞条件培养基的制备 小鼠头顶骨经0.25%胰蛋白酶和0.04%EDI’A充分除去骨片周围及骨缝处的结缔组织，再按常规植块法培养，骨片周围出现典型的成骨细胞的时间较早，原代培养24h后即出现梭状、叁角形或多边形细胞，BCIP加BT液体底物系统染色显淡蓝紫色。随培养时间的延长，细胞数量逐渐增多，8一IOd后相邻骨片间细胞汇合，密度较大处呈现重迭生长现象。传代培养后细胞生长速度明显加快，3~4d即可铺满皿底，差速豁附传代培养可获得较纯的成骨细胞。收集传代培养48h的成骨细胞培养液，4000r/m离心20min，0.22娜滤膜过滤，可制得成骨细胞条件培养基。 7.Es一D3细胞系的成骨细胞诱导分化 在EBs单细胞贴壁培养的第14~2 ld，在DMEM培养基(15%FBS+0.1~of几2一Me+80U/mL青霉素+looU/mL链霉素)中，添加60%成骨细胞条件培养基，第22d时1%茜素红染色钙结节呈鲜红色，成骨细胞诱导形成率为 10.04%，与对照组比较，差异极显着(P<0.01)。首次证明，条件培养液具有诱导ES细胞向成骨细胞分化的作用。 添加50林创mL维生素C+50~。比p一磷酸甘油，诱导分化的细胞分泌物形成网状结构，茜素红染色阳性细胞分布在这些网状结构中，成骨细胞诱导形成率为7.43%，与对照组比较差异显着(P<0.05);添加50林留mL维生素C+50~ol几日-磷酸甘油+1林mol/L地塞米松，茜素红染色阳性细胞分散而均匀，但未出现网状结构，成骨细胞诱导形成率提高至27.57%，与对照组比较差异极显着(P<0.01)，与添加50林创mL_维生素C+50~ol几p一磷酸甘油比较，差异极显着(P<0.01)。在国内，首次证明维生素C和p一磷酸甘油具有诱导ES细胞向成骨细胞分化的作用，地塞米松能促进维生素C和p一磷酸甘油的这种诱导作用。
秦茂林[3]2001年在《小鼠胚胎干细胞的分离、鉴定和神经定向诱导分化》文中指出胚胎干细胞是从哺乳类动物的囊胚内细胞群或原始生殖嵴细胞分离、体外培养（抑制其分化）获得的具有发育全能性的细胞。ES细胞是研究哺乳动物胚胎早期发生、细胞分化、基因调控等发育生物学基本问题的理想模型，也是组织工程、药理学和临床医学研究的重要工具。昆明小鼠是我国最常用的实验小鼠。建立昆明小鼠的ES细胞系有利于其转基因动物的获得，能够为我国的科研工作更好的服务。胚胎干细胞神经定向分化能够有效地修复中枢神经系统的损伤。由此可见，分离昆明小鼠的胚胎干细胞，掌握其生物学特性，并了解胚胎干细胞神经定向分化机制是完全有必要的。 本实验利用小鼠胚胎成纤维细胞为饲养层，收集昆明小鼠孕3.5d的囊胚进行培养，采用二次亚克隆法筛选纯化ES细胞集落，使其稳定传代后对其生物学性状进行初步鉴定；4-/4+法利用维甲酸、雌激素及它们联合诱导MESPU35胚胎干细胞系体外分化，免疫细胞化学、免疫荧光双标和流式细胞仪对分化细胞进行分析，研究上述诱导剂对MESPU35细胞系神经定向分化的诱导作用，为进一步进行移植学实践打下基础。 结果： 1．培养了95个昆明小鼠囊胚，13例内细胞群离散后出现了胚胎干细胞样集落，这些集落经过两次亚克隆纯化后，获得两个昆明小鼠胚胎干细胞株，即KMMES1和KMMES2。 2．KMMES1和KMMES2细胞株具有典型的胚胎干细胞形态，AKP染色强阳性和全能性；然而两个细胞株生长速度、体外分化能力和正常核型比例等生物学性状存在一定的差异。 3．相差显微镜观察RA诱导MESPU35细胞系形成神经样细胞拟胚体百分率随分化时相点和RA浓度升高而升高，与对照组相差显着；雌激素诱导组与对照组无显着差别：RA联合雌激素诱导组与对照组差别显着，然而和RA诱导组差别不显着。 4．免疫细胞化学观察RA诱导MESPU35细胞系分化形成的NF200阳性细胞和 GFAP阳性细胞数随分化时相点和 RA浓度升高而升高；NF200阳性细胞形态由无突起变为多极细胞，GFAP阳性细胞突起由短变长，最后联结成网状；分化过程中未见Gale染色阳性细胞出现。 5．免疫细胞化学观察RA联合雌激素诱导MESPU35细胞系分化形成的NF200阳性细胞和GFAP阳性细胞数随分化时相点和RA浓度升高而升高；NF200阳性细胞形态多为双极细胞，GFAP阳性细胞形成的突起细长，两者与 RA诱导组比较细胞体积较小；分化过程中未见 GalC染色阳性细胞出现。 6．流式细胞仪检测RA诱导MESPU35细胞系分化形成的NF200阳性细胞和 GFAP阳性细胞的比例，GFAP阳性细胞和 NF200阳性细胞数随分化时相点和 RA浓度升高而升高，与自然分化 14天的细胞比较相差显着。 结论： 1．我们成功分离了昆明小鼠 ES细胞株，KMME SI和 KMMESZ，通过观察昆明小鼠ES细胞的生物学性状，为转基因动物的建立打下基础。 2．RA是有效的ES细胞神经定向分化诱导剂，对MESPU35细胞系神经定向分化的调节以浓度和时间依赖模式进行。ES细胞神经定向分化是研究神经细胞发育的体外模型。 3．雌激素联合RA诱导后产生的细胞在形态学上有一定变化，提示可能雌激素激活某些调控神经分化的基因表达，改变神经细胞发育的一般过程。 4．Gal．c染色始终无阳性细胞出现，此结果可能提示MESPU35细胞系缺乏生成少突胶质细胞的能力，也可能由于Gal－c是成熟少突胶质细胞的标志物，而诱导分化时间还不够长。
杨艳[4]2016年在《小鼠胚胎干细胞和成纤维细胞诱导分化为类睾丸间质细胞研究》文中认为雄激素主要由睾丸间质细胞(leydig Cell,LC)合成和分泌的。雄激素缺乏会导致男性外生殖器畸形、第一和第二性征发育迟缓、少精或无精症及性功能障碍等疾病,严重影响人类的生活质量和生殖健康。近年来,由于先天性疾病、环境污染、工作压力日益增大以及人口老龄化等原因导致睾丸间质细胞功能障碍,进而诱发雄激素缺乏相关疾病呈逐年上升的趋势,并已成为当前受到普遍关注的社会问题。尽管临床上可通过补充雄性激素进行替代治疗,但使用者容易出现情绪不稳、肝功能损害、高血脂等并发症及诱发前列腺癌等风险,因而大大限制其广泛应用。为此,本研究利用转录因子诱导胚胎干细胞和成体细胞分化为具雄激素合成分泌功能的类Leydig细胞,为治疗男性雄激素缺乏症提供新方法。在小鼠胚胎干细胞定向分化为类Leydig细胞方面,本研究首先利用小分子化合物8-溴-环腺苷酸(8-Br-cAMP)和毛猴素(FSK)在体外将过表达类固醇生成因子(SF-1)的小鼠胚胎干细胞(mESC-SF-1)定向诱导分化为未成熟Leydig细胞。然后,再将这些细胞移植至EDS造模“敲除”内源性Leydig细胞的大鼠睾丸内,利用睾丸内环境促进其发育为成熟Leydig细胞。实验结果表明,8-溴-环腺苷酸(8-Br-cAMP)和毛猴素(FSK)联合使用可以显着提高mESC-SF-1定向分化为Leydig前体细胞的效率,并促进这些前体细胞表达雄激素合成通路中的关键酶(St AR、CYP11A1、HSD3B1、CYP17A1和INSL3)和合成雄激素。将这些Leydig前体细胞移植至雄激素缺乏的大鼠睾丸内,其能进一步发育为成熟的类Leydig细胞,促进雄激素缺乏大鼠血清睾酮含量恢复到正常水平。为了规避干细胞引起的伦理问题,本研究利用生物信息学分析了参与Leydig细胞谱系发育的转录因子,筛选出11个可能调控成纤维细胞转分化为Leydig细胞的转录因子并克隆至慢病毒载体中。将筛选获得的转录因子分成不同的组合,分别感染稳定表达CYP11A1-promoter-mCherry的胚胎成纤维细胞,再利用流式分析细胞术以及酶联免疫方法分析不同组合诱导CYP11A1阳性表达细胞的比例及其表达雄激素的能力,最后获得最佳诱导成纤维细胞转分化成具雄激素合成功能的类Leydig细胞的转录因子组合Dmrt1、Gata4和Nr5a1(简称DGN)。这3个因子组合可诱导小鼠成纤维细胞转分化为类Leydig细胞,表达Leydig细胞特异蛋白及合成睾酮。将其移植至雄激素低下模型鼠睾丸中,可恢复模型鼠血清睾酮含量至正常水平。转分化前后细胞增殖及表达谱分析结果表明,DGN组合介导的转分化过程并不依赖有丝分裂,而是通过上调甲基化调控基因Gadd45a的表达量进而降低细胞基因组DNA甲基化水平来实现的。此外,DGN组合同样可以诱导终末端分化的成纤维细胞转分化为具雄激素合成功能的类Leydig细胞。本研究利用诱导干细胞定向分化及成体细胞转分化为具雄激素合成分泌功能的类Leydig细胞,为男性不育和性功能低下等生殖系统疾病的药物开发及分子机制研究提供细胞模型和理论基础,促进个体化细胞治疗的进一步发展。
徐秋勤[5]2014年在《兔类ES细胞的分离培养及定向分化的研究》文中认为本研究采用兔胚胎作为试验对象，从中分离克隆出兔类ES细胞，而且系统地比较了不同的培养条件对兔类ES细胞分离培养的影响，并对其进行了传代培养及鉴定；采用不同浓度的视黄酸（retinoic acid, RA）对分离到的兔类ES细胞向原始生殖细胞（primordial germ cells,PGCs）诱导分化效果进行了初步探讨，为兔胚胎干细胞的建系及向原始生殖细胞的体外分化研究奠定了基础。试验主要结果如下：1.探讨超数排卵对兔胚胎体外发育能力的影响，收集自然发情和超数排卵处理配种后4d的胚胎，接种于MEF饲养层上培养，以自然发情交配所得兔囊胚作为对照。结果如下：超数排卵组的胚胎贴壁率、ICM形成率和F1代形成率高于自然发情组，但没有显着差异（P>0.05），兔超数排卵对兔胚胎的体外发育能力没有显着影响。但在干细胞克隆传代方面差异显着（P<0.05）。因此，为保证试验的效率，尤其在严寒和酷热的环境下，兔子自然交配不易成功，对母兔采取超排方式可获得足够的胚胎，但在春秋季节时获得胚胎以自然发情交配为好，其胚胎更适宜分离胚胎干细胞。2.探讨兔胚胎的不同处理对兔胚胎克隆、传代的影响。将自然发情获得的挑破透明带胚、离散胚和未处理胚分别置MEF饲养层上培养。结果显示：挑破透明带法和胚胎分割法较对照组得到的胚胎更容易贴壁和增殖，有显着差异（P<0.05），虽然离散胚组的胚胎贴壁率（85.7%）显着高于挑破透明带组（70.0%）（P<0.05），但挑破透明带组的ICM形成率（53.3%）高于离散胚组（40.0%）（P<0.05），挑破透明带组F1、F2代兔类ES细胞的克隆率分别为34.7%和25.7%，均显着高于其他两组（P<0.05），最高传至30代。因此，挑破透明带有利于提高从兔胚胎中分离胚胎干细胞的效率，能更好的支持兔类ES细胞的培养与增殖。3.探讨不同培养基对兔胚胎克隆和传代的影响。结果显示：胚胎在含15%FBS的培养液中ICM集落形成率以及1~5代类ES细胞传代过程中均显着高于其他两组含15%KSR和7.5%FBS+7.5%KSR的培养液（P<0.05），培养液为高糖-DMEM+2mmol/L L-谷氨酰胺+0.1mmol/Lβ-巯基乙醇+1%NEAA+15%FBS+100IU/mL双抗时改善了兔类ES细胞的体外培养环境，有利于兔类ES细胞集落的形成，能够进行稳定的传代。4.探讨了机械消化传代、胰酶消化传代和“机械+胰酶”消化传代3种不同的传代方法对兔类ES细胞分离培养传代的影响，结果发现“机械+胰酶”消化传代法最有利于兔类ES细胞传代和集落的形成，细胞克隆形态最佳，为理想的ES细胞分离传代方法。5.将分离克隆得到的兔类ES细胞进行鉴定，结果显示，碱性磷酸酶染色和Oct-4、Nanog免疫荧光鉴定兔类ES细胞集落均呈阳性；提取兔类ES细胞集落的RNA，扩增多能性基因Sox2、Nanog和GAPDH经RT-PCR检测，得到了与预期大小一致的目的片段。体外分化形成具有叁个胚层构成的类胚体（embryoid bodies, EBs）。6.探讨不同浓度的RA对兔类ES细胞向原始生殖细胞诱导分化的能力。采用不同浓度RA（0.2μM、2μM、20μM）诱导液和不加RA的培养液对兔类ES细胞进行诱导，用流式细胞仪进行DNA倍体分析，结果显示：0.2μM浓度RA诱导21d经DNA倍体分析单倍体含量达54.4%，诱导效率最高，2μM浓度RA诱导14d经DNA倍体分析单倍体含量达12.6%，而其他浓度在诱导了相同天数则不含单倍体，说明兔类ES细胞可以用RA向原始生殖细胞诱导，0.2μM浓度的RA诱导效率要比其他浓度高，表明RA的较佳浓度为0.2μM。
马岚[6]2002年在《猕猴胚胎干细胞的分离、鉴定、培养及应用研究》文中认为本论文以猕猴胚胎干细胞为主要研究对象,在猕猴胚胎干细胞的分离、培养及鉴定方面、猕猴胚胎干细胞体外持续培养体系的建立及优化方面、应用猕猴胚胎干细胞为细胞模型研究LIF对介导胚胎着床的滋养层细胞分化的影响效应方面、以及应用猕猴胚胎干细胞为细胞模型研究叁种光敏药物的光敏毒性以及光敏生物活性方面进行了研究。研究主要获得了以下结果:1、通过猕猴卵母细胞体外成熟培养、体外受精和早期胚胎体外培养技术,由4只超排的成年猕猴中共取得92个处于GV期的猕猴卵母细胞,选取其中的22个于HECM-10培养体系培养后,获得了6个高质量的猕猴囊胚,由此自然孵出的囊胚中分离得到6个内细胞团,并由此最终获得1株具有高核仁/胞质比,具有明显的核仁,集落边界清楚,其内的细胞明晰的,具有胚胎干细胞特征的猕猴类ES细胞——RS5细胞。经5个月的连续传代后,RS5细胞仍保持了正常二倍体的核型,其染色体数目与正常猕猴的一样,均为42条。碱性磷酸酶组织化学染色,结果表明为阳性,说明此细胞为未分化态的原始类胚胎干细胞。由胚胎干细胞多能性分化的初步研究结果来看,在高密度和解除抑止的状态下,此RS5细胞是能进一步发展为多种分化细胞的。2、建立了猕猴胚胎干细胞RS366.4体外持续培养、扩增及冻存培养体系。3、白血病抑制因子(LIF)在胚胎着床中起着重要作用??LIF可通过参与人滋养层细胞分化而介导胚泡着床。已有的关于LIF与滋养层细胞分化间关系的研究结果是相互矛盾的。为避免由早期胚胎标本或胎盘来源的细胞滋养层细胞模型的不足,本实验选用由猕猴RS366.4 ES细胞来源的早期分化滋养层细胞为模型进行研究。细胞流式仪结果表明低浓度的LIF可促进绒毛合胞体滋养层的分化,高浓度的LIF可促进绒毛外侵入性滋养层细胞的分化。细胞免疫组化结果则显示经LIF处理后,侵入性绒毛滋养层细胞的标志物之一?? Fibronectin呈阳性。4、北醌化合物为性能优良的光敏剂。本研究首次以R366.4 ES细胞为模型,测试了EA的光敏毒性,并首次报道了EA的光敏生物活性。经不同光照时间处理后,低浓度的光敏化的EA对R366.4细胞均无细胞毒性作用。在此浓度范围内,对于Hce-8693细胞,EA,HA及HB则均以浓度依赖的方式引起其细胞凋亡,其光敏抑制效应顺序为HA > EA > HB。对于B16细胞,EA也以浓度依赖的方式引起其细胞凋亡。这些结果表明EA、HA及HB均有较显着的光敏抑癌生物活性。
黄林[7]2010年在《小鼠胚胎干细胞诱导分化为肾脏样细胞的实验研究》文中研究说明背景及目的：胚胎干细胞(embryonic stem cell, ESC)是指从早期胚胎内细胞团或原始生殖细胞分离出来的一种具有无限增殖能力和全方向分化能力的一种多潜能细胞,具有修复甚至替换丧失功能的组织和器官的潜在应用价值。如何诱导胚胎干细胞向特定细胞类型的分化是其基础研究和临床治疗应用的关键点。胚胎干细胞的这种定向分化能力除了细胞内各种转录因子的内在决定因素外,细胞间因子的分化诱导、抑制作用及细胞外物质的介导作用等外源性因素也是必不可少的。目前,在胚胎干细胞的众多诱导分化方式中,采用共培养的方式来诱导其定向分化已经成为组织工程领域一种新兴而很有发展前景的技术,在很多医学领域都有成功的报道,如心血管、呼吸系统和肝脏等领域。在泌尿系统领域,既往研究发现胚胎干细胞与离体的胎肾器官共培养能成功诱导其向肾系细胞分化。但是有关胚胎干细胞在体外能否通过和一种特定的细胞相互作用继而定向分化成肾系细胞并未见报道。为此本实验尝试体外通过Transwell双层培养皿将胚胎干细胞同大鼠胚胎后肾间充质细胞(metanephric mesenchymal cells MMCs)进行共培养的方法,观察共培养条件下,胚胎干细胞能否定向分化成肾脏样细胞,期望为下一步应用于急慢性肾功能衰竭的动物实验模型的治疗奠定基础。方法：1.取妊娠13.5d的胎鼠,采用组织消化法分离培养出小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse Embryonic Fibroblasts MEFs),对MEFs的生长形态、生长曲线及分裂指数进行观察,MTT法筛选丝裂霉素C (Mytomycin C, MMC)作用的最佳浓度和时间。2.收集昆明系小鼠3.5d的囊胚,培养在经MMC处理的第叁代小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上,对分离克隆出的胚胎干细胞集落的形态学、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase, AKP)、全能型因子(OCT-4,NANOG)的表达、核型分析以及体内外分化能力加以鉴定。3.从孕12.5-14.5d的SD胎鼠中分离培养出后肾间充质细胞,并对其进行形态学、细胞免疫学和电镜的鉴定。4.采用直接悬浮培养法使小鼠胚胎干细胞形成拟胚体(EBs)后,将拟胚体细胞与胚胎后肾间充质细胞通过Transwell培养系统共培养7d,RT-PCR检测共培养的拟胚体细胞是否表达肾脏发育相关的特征基因(WT-1,Wnt-4, pax-2,c-Ret)和终末分化的肾细胞标志物(podocalyxin, Nephrin)。结果：1.MEFs为一种贴壁生长且增殖速度较快的细胞,第叁代细胞增殖旺盛,第5代以后细胞开始变形并趋于衰老。MMC能抑制胚胎成纤维细胞的增殖,最佳的作用浓度和时间是10ug／ml作用2.5-4.0h,20ug/ml作用1.0-2.5h。2.分离得到的ES细胞有典型的形态学特征：集落呈鸟巢状,边缘清楚结构致密,隆起生长；碱性磷酸酶染色呈强阳性；RT-PCR分析显示OCT-4,NANOG等全能性因子表达阳性；具有正常的二倍体核型；可形成拟胚体；皮下注射到免疫缺陷小鼠可形成包括叁个胚层的畸胎瘤。3.SD大鼠胚胎后肾间充质细胞为一种贴壁生长、生长速度较快、呈漩涡样生长的细胞。细胞体积较小,胞浆少、胞核大、核仁明显。间质细胞标志物波形蛋白阳性,而上皮细胞标志物角蛋白为阴性。电镜下细胞呈不规形,胞核大,内有细胞器,细胞表面有微绒毛。4.拟胚体细胞与胚胎后肾间充质细胞共培养7d后,通过RT-PCR检测到共培养后的胚胎干细胞表达肾脏发育相关标志物(WT-1, Wnt-4,pax-2, c-Ret)和终末分化的肾细胞标志物(podocalyxin, Nephrin)。结论：采用共培养模型,大鼠胚胎后肾间充质细胞可以诱导昆明小鼠胚胎干细胞定向分化为肾脏样细胞。但是,分化得到的这种细胞仅仅是一种前祖细胞,而非一种特定的肾脏细胞。因此如何得到一种特定的肾脏细胞,以及任何将分化后的细胞从未分化的胚胎干细胞分离出来进行纯化从而应用于急慢性肾功能衰竭动物实验模型的治疗中将是我们下一步要研究的关键问题。
华进联[8]2005年在《人类胚胎生殖细胞的分离克隆及生物学特性研究》文中研究说明原始生殖细胞(PGCs)是各级生殖细胞和成熟配子的共同祖先。在体外适宜的培养条件下,PGCs 大量增殖形成与ESCs 高度类似的多能性细胞,称作EG 细胞。目前,小鼠和其他哺乳动物及人类:EG 细胞的分离培养均取得一些重要的进展,但有关人类PGCs 发育分化、体外分离培养体系及影响因素、无血清培养及检测、人类EGCs 的诱导分化特性等尚未见到系统的研究报道,本研究对上述4 个方面展开研究,以期探索出人类胚胎性腺生殖细胞发育分化规律;建立优化的人类EGCs 无血清分离培养体系;检测人类EGCs 的多向分化潜能,并在人类:EGCs 分离培养的基础上,向hEGCs 转染人类心肌α-actin 启动子,以探索人类心肌α-actin 启动子在人类心肌细胞分化中的作用。1 人胚胎性腺生殖细胞发育分化的研究组织学观察人胚胎睾丸和卵巢,Ki67 在10 w 胚胎睾丸表达最强,卵巢则在20 w 强表达。Bcl-2 在11.5 w 胚胎睾丸强表达,而在胚胎卵巢发育中一直表达较弱。在5～12 w 的睾丸,PGCs 强表达AKP、Oct4、SSEA-1;13 w 后,随胎龄增大,Oct4、AKP、SSEAl 表达减少。在5～32 w 的卵巢内,Oct4、AKP、SSEAl 在8 w 内的生殖细胞强表达;但在14 w 以后卵巢,Oct4、AKP、SSEAl 表达逐渐减少。透射电镜观察,早期胚胎的生殖嵴/腺见到大量的PGCs,一般为圆形或椭圆形,细胞核大,核质比高,细胞器较少。在出现性别分化后,雄性可见有间质细胞和支持细胞,细胞器较为丰富。雌性可见较大的卵母细胞和颗粒细胞。2 人类胚胎生殖细胞分离克隆体系的建立5%～15%NBS 均可以满足HEF、MEF 生长,以8%～10%NBS 为宜。对H=EF 的培养, 以}tDMEM 和α-MEM 效果较好。对MEF 的培养,HDMEM 效果最好。MEF、STO、HEF 等制作好的饲养层细胞维持时间不能超过7 d , 一般为5 ～7 d 。研究了流产胎儿对hEGCs 分离克隆的影响,表明7～12 w 最适于hEGCs 分离克隆, 自雄性胎儿分离hEGCs 的成功率明显高于雌性。筛选了几种细胞因子对hEGCs 生长增殖的最佳剂量,表明RA 和Forskolin 的最佳剂量分别为10-6mol/L 和10 u mol/L;LIF 为5 ng/mL:bFGF 为10 ng/mL;TNFa 为25 ng/mL;TGFB 的添加不利于hEGCs 克隆增殖;进一步将各种细胞因子组合能提高hPGCs 克隆增殖率,以此提出hEGCs 的最优培养基为:HDMEM+15%KSR+0.1 mmol/L 2Me +O.1 mmol/L 非必需氨基酸+2 mmol/L 谷氨酰胺+100 u/mL 青霉素+100 u/mL 链霉素,
吴娟利[9]2006年在《体外诱导小鼠胚胎干细胞分化为胰岛素分泌细胞》文中认为近年来，糖尿病是全世界公众健康所关注的疾病，其发病率呈明显地上升趋势，而且发病更趋年轻化。20世纪70年代，胰岛移植首次在大鼠体内取得了成功，随后又在糖尿病患者治疗中取得了一定成效。2000年，Shapiro等从成人捐献者的胰腺分离出以β细胞为主的胰岛细胞，然后移植到糖尿病患者体内，使这些患者不需要终身注射胰岛素，取得了惊人的成功。这就是国际上著名的“埃德蒙顿草案”(Edmonton Protocol)。根据“埃德蒙顿草案”，糖尿病患者胰岛β细胞的移植治疗至少需要2个供体胰腺；加之移植细胞受到患者体内的免疫攻击，有些患者往往需要2-4次细胞移植，因此寻找胰岛β细胞的新来源已成为关注的焦点。 胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESC)是从囊胚期的内细胞团(inner cell mass，ICM)和早期胚胎的原始生殖细胞(primordial germ cell，PGCs)中分离到一类具有自我更新能力的多潜能性细胞。自胚胎干细胞建系成功以来，人们对干细胞的生物学特性(如：具有自我更新能力及多向分化潜能)有了深入的了解。到目前为止，干细胞(包括胚胎干细胞)已被广泛应用于生物医学工程各个领域，包括作为细胞治疗和药物筛选的模型，研究哺乳动物早期发育过程中基因的表达及其功能，探索细胞分化的机制，用作组织工程中的种子细胞，以及制作各种转基因动物等。人类胚胎干细胞还可以作为胚胎发育过程中的研究模型，探索不同发育时期和分化过程中的基因表达；在细胞疗法中，被定向诱导形成神经细胞、造血细胞、胰岛细胞和心肌细胞等用于治疗如帕金森氏病、癌症、糖尿病等无法用药物根治的绝症；还可以作为药物筛选的模型，治疗胚胎发育过程中的疾病；其应用前景十分广阔。 胚胎干细胞体外诱导分化未胰岛细胞的研究起步比较晚，仍然存在很多争议。本实验期望通过胚胎干细胞的体外诱导探讨出获得胰岛细胞的最佳途径。 实验首先是进行小鼠胰岛细胞的分离纯化与鉴定。分离成年小鼠的胰腺组织，用淋巴细胞分离液Ficoll或培养48小时进行纯化后，再进行双硫腙(diphenylthiocarbazone，DTZ)进行染色。该实验的目的是给诱导后的实验结果提供阳性参照。 实验第二部分是小鼠胚胎干细胞滋养层细胞的制备以及小鼠胚胎干细胞的培养与传代。小鼠胚胎干细胞滋养层细胞使用的是经过丝裂霉素C处理的小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse Embryonic Fibroblast，MEF)，其制备包括原代小鼠胚胎成纤维细胞的制备以及传代和培养。这些都是为小鼠胚胎干细胞的培养做准备工作。
刘雨潇[10]2005年在《昆白小鼠胚胎干细胞分离克隆及向心肌细胞定向诱导分化的研究》文中指出本研究从昆白小鼠胚胎中分离克隆出小鼠ES 细胞,并对其进行了传代培养和鉴定;并以ES-D3 为材料,采用不同的诱导物将小鼠胚胎干细胞向心肌细胞定向诱导分化。对影响小鼠ES 细胞分离与克隆及向心肌细胞定向诱导分化的的影响因素进行了探讨,为进一步建立昆白小鼠ES 细胞系及建立稳定的心肌细胞诱导体系奠定了基础。实验主要结果如下: 1. 从1678 枚昆白小鼠胚胎中分离培养ES 细胞,ICM 形成率为70%(1167/1678),有3 株传至第8 代。 2. 分别比较了桑椹胚,早期囊胚,扩张囊胚,孵化囊胚的贴壁率,生长行为和原代集落出现个数。结果表明孵化囊胚是最理想的ICM 分离材料。 3. 分别比较了全胚法,免疫外科法,酸处理法,酶消化对ES 细胞分离克隆的影响。发现利用全胚法培养孵化囊胚,是一种可行的ICM 分离方法,该方法操作简单,且能很好的保持ICM 的活力,利于传代。 4. MEF、STO、 HEF 及Sertoli 在小鼠胚胎贴壁率无显着差异(P>0.05);但在原代集落出现率及传代率上4 者有明显差异。MEF 最好,Sertoli 和STO 次之,HEF 效果最差。 5. 不同培养液对小鼠胚胎贴壁率及ICM 集落形成率无明显影响, ES 细胞培养液在ES 细胞分离传代上明显好于大鼠心肌细胞及肝脏细胞条件培养基(P<0.05);大鼠心肌及肝脏条件培养基可用于小鼠ES 细胞分离培养; LIF 对昆白小鼠ES 细胞的分离与克隆具有至关重要的作用。 6. 0.1% 胶原酶是较好的ES 细胞消化液,对细胞损伤力小,且传代后ES 细胞集落形成能力也较高(P<0.05)。0.25%胰酶+1%鸡血清与0.05%胰酶+0.008% EDTA 也可用于ES细胞传代; 0.25%胰酶+0.04% EDTA 对ES 细胞的损伤较大,不适于小鼠ES 细胞的分离与克隆。 7.分离得到的小鼠ES 细胞, AKP 染色阳性。Oct-4,SSEA-1 染色阳性。体外可自发分化为上皮样、神经样、成纤维样、表明提外培养的ES 细胞具有多能性。8.比较了小鼠ES 细胞在不同条件下分化为心肌的效率。结果表明单独使用5-氮胞苷或联合使用二甲基亚砜(DMSO)与维甲酸(RA)诱导均可促进ES 细胞分化为心肌细胞。其中5-氮胞苷的最佳浓度为15μmol/L,RA 的浓度为10-8～10-9mol/L。
参考文献：
[1]. 昆明小鼠胚胎干细胞分离培养及其向原始生殖细胞诱导分化的研究[D]. 任卫青. 河南农业大学. 2012
[2]. 小鼠胚胎干细胞定向诱导分化成骨细胞研究[D]. 宋晓平. 西北农林科技大学. 2003
[3]. 小鼠胚胎干细胞的分离、鉴定和神经定向诱导分化[D]. 秦茂林. 第叁军医大学. 2001
[4]. 小鼠胚胎干细胞和成纤维细胞诱导分化为类睾丸间质细胞研究[D]. 杨艳. 暨南大学. 2016
[5]. 兔类ES细胞的分离培养及定向分化的研究[D]. 徐秋勤. 河南农业大学. 2014
[6]. 猕猴胚胎干细胞的分离、鉴定、培养及应用研究[D]. 马岚. 中国科学院研究生院（昆明动物研究所）. 2002
[7]. 小鼠胚胎干细胞诱导分化为肾脏样细胞的实验研究[D]. 黄林. 广西医科大学. 2010
[8]. 人类胚胎生殖细胞的分离克隆及生物学特性研究[D]. 华进联. 西北农林科技大学. 2005
[9]. 体外诱导小鼠胚胎干细胞分化为胰岛素分泌细胞[D]. 吴娟利. 浙江大学. 2006
[10]. 昆白小鼠胚胎干细胞分离克隆及向心肌细胞定向诱导分化的研究[D]. 刘雨潇. 西北农林科技大学. 2005
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