苗药组方熏蒸疗法对家兔早期膝骨关节炎模型光镜电镜的研究论文_王兴桂1,张力文1,王政2,王贵春2,陈盼碧1,周

（1贵阳中医学院贵州贵阳 550025）

（2凯里市中医院贵州凯里 556000）

【摘要】目的:通过光镜与电镜观察骨性关节炎兔关节软骨改变,深入探讨骨性关节炎发生发展的过程和发病机制。方法:采用兔膝关节腔内注射木瓜蛋白酶的方法复制早期膝骨关节炎（KOA）模型，然后用苗药熏蒸疗法治疗20天后，在肉眼、光镜、扫描电镜下观察软骨组织的病理改变，并用Mankin，s法进行评分，科学评价苗药组方熏蒸疗法对家兔早期膝骨关节炎的疗效。结果:光镜和电镜的检查结果均显示苗药熏蒸疗法可以延缓KOA关节软骨的退变。结论:苗药熏蒸疗法可以延缓KOA关节软骨的退变。

【关键词】苗药熏蒸疗法；膝骨关节炎；家兔；光镜；电镜

【中图分类号】R242 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2017）34-0390-04

祖国医学认为KOA属于“痹症”范畴，主要是因为风寒湿邪侵袭机体，导致血脉痹阻，气血运行不畅，或者是肝肾亏虚，经血不足无以濡养筋骨而发病，病程较长，缠绵不愈。苗药熏蒸疗法治疗KOA具有很好的止痛和改善关节的运动功能、延缓KOA的发展等作用，而且苗药熏蒸疗法作为我国少数民族地区比较普遍的外治疗法，它的治疗途径是经皮直接作用，药气从皮肤及粘膜渗入，可以避免药物经过胃肠道吸收的首过效应，从而降低对人体的损害，操作方法简单易学，这种运用毒性药物外治疾病的方法，是苗医药中独特的“以毒攻毒”方法。

本研究通过在兔膝关节腔内注射木瓜蛋白酶的办法来复制早期KOA模型，选取长期实验及临床验证有效的苗药验方来进行熏蒸治疗，经苗药熏蒸治疗20天后，在肉眼、光镜、扫描电镜下观察软骨组织的病理改变，并用Mankin，s法进行评分。利用现代科学技术对苗药熏蒸治疗早期KOA的关节软骨进行病理学研究与分析，为苗医药治疗KOA提供深层次的理论依据。

1.材料与方法

1.1 模型的制备与鉴定

3月龄新西兰兔40只，雌雄各半，体重（0.50±0.10）Kg,由重庆腾鑫生物技术有限公司提供，将40只新西兰兔随机分为4组，正常对照组、模型对照组、苗药熏蒸组、清水对照组，每组10只，参照日本鬼头康彦等的方法[1]，在兔膝关节腔内注入木瓜蛋白酶的办法来复制早期KOA模型。造模完成后，随机取2只进行模型鉴定。主要通过肉眼的大体观察、HE染色光镜观察和改良的Mankin,s评分进行鉴定。

1.2 光镜的取材及病理观察

将动物处死后以手术刀切取膝关节前正中部分的滑膜组织，矢状位切取股骨内髁内侧约3MM厚带软骨下骨质的软骨标本，置于4％多聚甲醛固定。将置于4℃的4%多聚甲醛的软骨组织备片供观察然后按Mankin’s骨关节病病理组织分类方法（见表）进行评分，并进行相关的统计分析。

1.3 电镜的取材及病理观察

将动物处死后迅速切取实验侧股骨内髁关节软骨，并使其成2mm×1mm全层软骨标本，投入4℃的3%戊二醛酸溶液中固定。将上述置于4℃的3%戊二醛酸溶液中的软骨组织按照扫描电镜要求备片后，在扫描电镜下观察、摄片。

1.4 统计学处理方法

结果以平均值±标准差（x-±s）表示,组间比较采用t检验，不符合正态分布用非参数检验，所有试验数据采用SPSS18.0统计软件进行统计学处理。

2 结果

2.1 大体观察结果

空白对照组：关节软骨外观可见为半透明状，表面比较光滑，且具有一定弹性，呈浅蓝白色；关节表面面比较光滑平整，色泽较明亮，无裂纹及软化；关节面比较规则且整齐，无骨赘生成，关节液比较清凉，滑膜无增生。（见图1a）

模型对照组：关节软骨外观可见色泽变暗，表面粗糙呈灰黄色，有浅表的软骨溃疡缺损，部分区域可有软骨下骨裸露，边缘有较多骨赘形成；关节液中可见滑液量增多且比较混浊，关节囊及滑膜均有不同程度增生、水肿。（见图1b）

苗药熏蒸组：关节软骨外观可见其失去原有光泽，还具有一定的弹性和透明状，颜色呈淡白色、稍有粗糙感，未见明显的软骨缺损；关节中见关节液清，滑膜无增生。（见图1c）

清水熏蒸组：关节软骨外观可见其表面粗糙，无光泽，颜色呈淡黄色，透明程度和弹性均下降，有数量不多的细小裂隙及边缘部分有骨赘生成，可见滑膜部分的充血水肿。（见图1d）

2.2 光镜下观察

2.2.1 HE及阿尔新蓝染色观察（X400）空白对照组：关节软骨正常(Mankin评分0～0.5分)。HE染色可见软骨表面光滑、平整；软骨厚度正常，四层结构清楚，潮线清晰、结构完整；软骨细胞正常，软骨陷窝分布均匀、序列整齐，软骨基质染色正常，阿尔新蓝染色呈深蓝色。（见图2a、3a）

模型对照组：关节软骨为早期软骨组织损害（Mankin评分为4～6分）。HE染色可见软骨表面粗糙、不平；软骨厚度接近正常，四层结构层次紊乱，软骨表层纤维化、糜烂，幅射层和深层软骨基质纤维松散，基质中可见到脂肪的沉积；表层的软骨细胞数目减少，深层可见簇集的软骨细胞增加且排列紊乱，正常的软骨陷窝消失，潮线消失或模糊不清，结构不完整；软骨基质染色减少，阿尔新蓝染色呈浅蓝色。(见图2b、3b)

苗药熏蒸组：关节软骨破坏较轻（Mankin评分为0～2分）。HE染色可见软骨表面稍粗糙；软骨厚度接近正常，四层结构层次清楚，软骨表层稍纤维化，幅射层和深层软骨基质纤维正常；软骨细胞数量与正常软骨相当，但软骨细胞排列稍紊乱，有正常的软骨陷窝；潮线清晰，结构完整；软骨基质染色稍减少，阿尔新蓝染色呈蓝色。（见图2c、3c）

清水熏蒸组：关节软骨破坏稍轻（Mankin评分为2～4分）。HE染色见，软骨表面粗糙、不平；软骨厚度变薄，四层结构层次稍紊乱，软骨表层纤维化，幅射层和深层软骨基质纤维松散，基质中可见到少许的脂肪沉积；表层和辐射层软骨细胞数量稍减少，深层可见部分簇集的软骨细胞，细胞排列稍紊乱，潮线稍模糊，结构欠完整；软骨基质染色轻度减少，阿尔新蓝染色呈淡蓝色。(见图2d、3d)

2.2.2组织学Mankin评分结果各实验组Mankin’s评分结果（见表）示：模型对照组与空白对照组比较具有显著性差异(P＜0.01)；苗药熏蒸组与模型对照组比较具有显著性差(P＜0.01)；清水熏蒸组与模型对照组比较有显著性差异(P＜0.01)，苗药熏蒸组与清水熏蒸组比较具有显著性差异(P＜0.01)。

表病理学分级评分表（x-±s）

注：模型对照组VS空白对照组比较＊P＜0.01；苗药熏蒸组VS模型对照组比较※P＜0.01；清水熏蒸组VS模型对照组比较△P＜0.01。

2.3 扫描电镜下观察

空白对照组：软骨的表面光滑，软骨表面胶原蛋白纤维呈条索状、相互交织呈网。交错排布的胶原纤维蛋白之间具有小的间隙，呈多孔状结构, 孔隙均匀。（图4a）

模型对照组：软骨的表面凹凸不平，软骨表面胶原网架结构紊乱，胶原蛋白纤维表面有大量条絮状物覆盖；大部分胶原纤维出现囊样变，纤维之间的多孔状结构模糊，空隙排列紊乱。胶原蛋白纤维甚至增粗、排列杂乱、甚至断裂呈虫蚀样改变。（图4b）

苗药熏蒸组：软骨的表面尚平整，软骨表面接近正常关节软骨表面，胶原蛋白纤维呈条索状、相互交织呈网。但胶原蛋白纤维表面有条絮状物覆盖，纤维之间的多孔状结构稍模糊。（图4c）

清水熏蒸组：软骨表面欠平整，软骨表面胶原网架结构紊乱，胶原蛋白纤维表面有大量条絮状物覆盖；大部分胶原纤维出现囊样变，圆形突起增多。纤维之间的多孔状结构模糊，空隙排列紊乱。有的胶原蛋白纤维甚至呈虫蚀样改变。（图4d）

3.讨论

膝关节是人体全身最大的负重关节，正常的膝关节在正常活动允许范围内处于自由活动状态。正常的膝关节胫骨关节面类似于平面，而股骨关节面则是类似圆弧状，两关节面之间直接接触的面积很小，因此造成了膝关节的不稳定性。只要相关影响因素造成膝关节的生物力学平衡改变就可以导致关节的应力变化，引起负荷传递的紊乱导致关节软骨损伤、退变，从而使软骨细胞的代谢紊乱，因此发展为KOA[2]。膝关节周围的韧带和软组织是维持其稳定性最重要结构，当关节软骨进一步破坏、骨赘形成时，关节周围的韧带、肌腱等软组织会产生粘连、瘢痕、萎缩等退行性病变，从而限制膝关节的自由活动，使膝关节内的动态平衡失调紊乱，致使膝关节更加不稳，力学结构进一步发生改变，从而加重KOA发展[3]。苗医药熏蒸疗法作为祖国传统医学一种外治疗法，《黄帝内经》曰：“其有邪者，渍形以汗。”苗药熏蒸疗法通过药疗与热疗的协调作用，药物直达患处，改善局部的血液循环，从而达到治疗和预防疾病的目的。它是利用药物的挥发之气或是药物煎煮的蒸汽或药液用来治疗疾病的方法，由于它不经过胃肠道吸收因此可以有效的避免了药物对胃肠道刺激而产生的副作用，而且直接作用于病变局部，尤其对像痹症等风湿痹痛、皮肤疾病等局部病变严重的有很好疗效，因此被医学界誉为“绿色疗法”。

无论是原发性和继发性的OA，其关节损伤的病理都是由于内、外因素的作用引起软骨受损，软骨基质的分解和合成代谢失调造成软骨的进一步破坏[4]，软骨从而发生代偿性增生(骨赘形成)。本研究通过建立动物KOA模型，观察苗药熏蒸疗法对动物KOA模型的影响，从组织学、显微形态学角度探讨KOA的病理变化及苗药熏蒸疗法治疗KOA的作用机理。HE染色和扫描电镜下观察结果显示，苗药熏蒸组在光镜下软骨病理改变明显减轻，Mankin评分明显降低，与模型组比较有显著性差异(P＜O.01)，其作用相比清水组较明显。因此苗药熏蒸疗法可以延缓软骨的退变，对早期KOA具有较好的治疗作用。

【参考文献】

[1]卫小春.关节软骨[M].北京:科学出版社,2007:42.

[2] NAK OSHI Y,HASEG AWAM,S UDO A,et al.Regulati on of tenascin 2C ex pressi on by tumor necr osis fact or 2 al pha in cultured humanosteoarthritis chondr ocytes[J].J Rheumat ol,2008,35(1):147-152.

[3] BOTHA S S,WATT I,S LAGBOOM E,et al.Innate production of tumour necrosis factor alpha and interleukin 10 is ass ociated withradiol ogical p rogression of knee osteoarthritis[J].Ann Rheum Dis,2008,67(8):1165-1169.

[4] Valdes KW,Loughlin J,Meurs JB,et al.Genom-wide association scanidentifies a prostaglandin-endoperoxide synthase 2 variant involved inrisk of knee osteoarthritis[J].Am J Hum Genet,2008,82:12311-240.

附录：实验相关图片