杨晓玲[1]2003年在《ALS体外实验模型的建立及脊髓运动神经元损伤保护因素的研究》文中研究指明第一部分 脊髓运动神经元的体外培养与鉴定 目的：探索脊髓运动神经元的分离、纯化及体外培养方法，寻找有效的鉴定途径，为ALS运动神经元变性、死亡影响因素的研究提供一种工具。 方法：取材于胚胎16天的SD大鼠的脊髓组织，先经胰酶消化，离解成单细胞悬液，以6.8％的Metrizamide密度梯度离心，收获离心介质上方的细胞即为脊髓运动神经元，然后差速贴壁，将所得细胞进一步纯化，最后以4×10~5／ml密度接种于24孔培养板，24小时后加入阿糖胞苷抑制非神经元细胞的分裂增殖，前两天采用L-15有血清培养基，48小时后改用无血清培养基，以后每隔两天半量换液一次。本实验应用ABC免疫细胞化学技术以胆碱乙酰转移酶(ChAT)多克隆抗体特异性标记脊髓运动神经元。 结果：ChAT阳性细胞即脊髓运动神经元占所培养细胞的85％以上，脊髓运动神经元不能分裂增殖，只能短暂培养，体外培养存活7～9天左右，结合应用有血清和无血清两种培养基最大程度地保证了运动神经元的纯度和存活时间。 结论：体外培养的脊髓运动神经元可以作为研究运动神经元损伤保护因素的理想模型，ChAT能够特异性标记脊髓运动神经元。 第二部分 脊髓运动神经元的形态学分析 目的：通过不同培养时间细胞的存活率和形态学特征了解体外培养的脊髓运动神经元的生长规律，选择施加干预因素及观测结果的最佳时间。 方法：在倒置显微镜(×250)下，计数培养0、1、3、5、7、9天细胞的存活数目，以第0天的细胞计数作为基数100％，其它组的计数除以第0天的细胞计数，以百分比表示该组的细胞存活率。在高倍镜视野(×400)下，利用图像分析系统测量户JJS体外实验模型的建立及脊髓运动神经元损伤保护因素的研究中文提要培养1、3、5、7、9天ChAT阳性细胞的轴突长度、树突数目、树突总长度、树突分叉点数目和胞体面积五个形态学指标。 结果:随时间的延长，脊髓运动神经元存活率呈下降趋势。第一天存活率为59%，第叁到五天维持在50%左右，第七天缓慢下降至37%，九天以后，大部分细胞己经死亡。从形态学来看，无论是突起长度、突起数目还是胞体面积在前叁天增长幅度最快，四到七天这段时间各项指标缓慢上升，生长稳定，七天后各项指标又快速下降，第九天神经元胞体萎缩，突起断裂，濒临死亡。 结论:原代培养的脊髓运动神经元的存活率、突起长度、分叉点数目和胞体面积等指标可以反映细胞的生长状况，培养叁到五天时生长状态最佳，适宜于实验中各项指标的观测。第叁部分还原型谷肤甘肤和L一NAME对体外培养的脊髓运动神经元的影响 目的:探讨氧化损伤是否参与了运动神经元的变性与死亡，还原型谷肤甘肤和L一NAME对培养的脊髓运动神经元有否保护作用。 方法:将脊髓运动神经元分成九个小组:对照组(不加入任何药物);0.1 mM、lmM、10mM、20mM4种不同浓度的GSH处理组;10一M、10一SM、104M、10一3M4种不同浓度的L一NAME处理组。接种后即给予以上药物，每隔12小时重复给药一次，叁天后计数每组细胞存活数目，计算存活率。对GSH 10 mM和L一AME10一3M生长状态最好的两处理组培养叁天后的免疫细胞化学标本进行图像分析，测量每组形态学指标。采用Stata 6.0软件对结果进行统计处理。 结果:GSH浓度在1 mM一1 omM之间时，随浓度升高，细胞存活率有所提高，1 omM的GSH细胞存活率最高，达到66%，当浓度高于1 OmM时，存活率反而下降。L一NAME在10一M一10一3M浓度范围内，神经元的存活率也有升高。从形态学角度看，两实验组只有树突数目与对照组比较差异无显着性(P>0.05)，其它各项指标均高于对照组，ALS体外实验模型的建立及脊髓运动神经元损伤保护因素的研究中文提要统计学有意义。 结论:抗氧化剂和NOS抑制剂可以提高脊髓运动神经元的存活率，促进神经元生长，提示氧化自由基加重了脊髓运动神经元的损伤，ALS运动神经元变性过程中可能存在氧化损伤。
许蕾[2]2006年在《氧化应激在免疫介导的脊髓运动神经元损伤过程中意义的探讨》文中研究说明肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis, ALS )也称Lou Gehrig氏病,早在1869年由Charcot首先报道,是中枢神经系统的一种慢性进行性变性疾病,以脊髓、脑干和大脑选择性的运动神经元变性为特征,临床表现为缓慢起病、进行性发展的肌肉无力、萎缩。ALS是一种致死性疾病,患者多在首次出现症状后的3-5年内死于呼吸衰竭。根据其发病和遗传特点可分为家族型肌萎缩侧索硬化(Familial Amyotrophic Lateral Sclerosis,FALS)和散发型肌萎缩侧索硬化(Sporadic Amyotrophic Lateral Sclerosis,SALS),其中FALS不足10%,而SALS则占整体ALS的90%以上。FALS主要是由于编码Cu/Zn超氧化物歧化酶(SOD1)的基因突变引起,其突变位点在21号染色体长臂Cu/Zn SOD基因内,即21q22.1-22.2。SALS目前病因不清,其发病机制可能主要集中在以下几个方面:①谷氨酸的兴奋毒作用和钙离子超载;②自由基的毒性作用;③自身免疫机制;④线粒体功能异常;⑤神经丝的过度磷酸化;⑥神经营养因子缺乏等。尽管对运动神经元变性的机制,有了一些了解。随着人口社会的老龄化,ALS仍是最严重的致死性疾病之一。美国FDA批准的唯一用于ALS临床的药物—riluzole也只能延缓病程的进展。目前仍无确实有效的治疗方法。由于尸体解剖资料为终末期改变,无法对该病的早期干预进行深入研究,这些都局限了ALS的深入研究。因此实验模型的建立至关重要。目前,ALS的实验模型主要集中在体外培养模型和转基因模型上。传统的运动神经元单细胞培养优点是干扰因素少,能直观、动态地观察神经元的形态和功能变化以及对药物的反应;其缺点是操作复杂,技术要求极高,且细胞存活时间太短,不适合研究像ALS这样的慢性进行性变性疾病,且纯运动神经元培养不能模拟体内复杂的生理环境,不能反应神经元与胶质细胞的相互作用,因此不是研究ALS的理想的实验模型。脑片和脊髓片的器官型培养,可以长时间地存活,并可维持相对完整的形态,保持神经元与神经元之间以及神经元与胶质细胞间的突触联系,
李哲[3]2007年在《Nrf2/ARE信号通路激活剂对选择性运动神经元损伤保护作用的研究》文中提出肌萎缩侧索硬化(Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS)是选择性侵犯上、下运动神经元的慢性进行性变性疾病。患者多在首次出现症状后的3-5年内死亡。ALS的发病机制主要集中在以下几个方面:1)Cu/Zn SOD基因突变;2)谷氨酸的兴奋毒作用;3)线粒体功能异常;4)氧化应激;5)外源性毒素或病毒感染;6)免疫炎症等等。对ALS发病机制及其治疗方法的探讨一直是神经科领域的研究热点,多数学者认为谷氨酸的兴奋毒作用和氧化应激在ALS的发病机制中发挥重要作用,其中氧化应激被认为是各种原因诱发的神经变性疾病的最终通路。目前ALS尚无有效治疗方法,ALS治疗方向主要包括兴奋性氨基酸拮抗剂、抗氧化剂、神经营养因子、基因治疗、免疫治疗、以及干细胞移植治疗等方面。针对氧化应激这一发病环节,在ALS的治疗中开始应用一些外源性抗氧化剂如N-乙酰半胱氨酸、维生素E、褪黑素等。这些外源性抗氧化剂在体外或体内实验中表现出了一定程度的神经保护作用,但疗效并不满意。另一个可能抵抗氧化应激的有效治疗策略,就是通过化学诱导剂诱导一系列内源性抗氧化酶、抗氧化蛋白的表达,发挥协同的强大的抗氧化作用。近来文献报道,Nrf2/ARE信号通路的激活可在多种组织中诱导一系列内源性的细胞保护基因上调,其中包括抗氧化酶、抗氧化蛋白、抗炎和解毒的蛋白。这些抗氧化酶和抗氧化蛋白在神经组织中的表达增加,可对抗由谷氨酸、过氧化氢及多巴胺引起的氧化损伤。因此Nrf2/ARE信号通路的激活有望成为神经变性疾病治疗的新靶点。二噻环戊二烯硫酮类化合物可以在多种组织中激活Nrf2/ARE通路,诱导一系列抗氧化酶、抗氧化蛋白的表达。CPDT和D3T即是此类化合物中的两种强效的诱导剂。另外,二者还具有小分子和相对亲脂的特点,从而具有潜在的治疗神经变性疾病的作用,值得研究推广。ALS脊髓器官型培养模型作为ALS的一种体外研究方式,它是利用脊髓器官型培养技术,在培养液中加入谷氨酸转运体抑制剂,造成突触间隙谷氨酸浓度的增高,根据谷氨酸的兴奋毒性机制,造成腹角运动神经元选择性损伤。它可以作为一种良好的模型去筛选有效的神经保护剂,为临床前使用某些药物治疗ALS提供重要实验基础。因此,该课题根据谷氨酸的兴奋毒性作用机制,利用脊髓的器官型培养技术,建立肌萎缩侧索硬化脊髓器官型培养模型;在腹角α运动神经元选择性损伤的基础上,在培养液中加入不同浓度的Nrf2/ARE通路激活剂,观察其对选择性运动神经元损伤的保护作用。课题研究分四部分:第一部分根据谷氨酸的兴奋毒性作用机制,建立肌萎缩侧索硬化器官型培养模型,在此基础上,筛选有效的Nrf2/ARE通路激活剂,为进一步研究其保护作用奠定基础;第二部分根据筛选结果,在培养液中加入不同浓度的CPDT,利用透射电镜和流式细胞仪等,从不同角度观察CPDT对选择性运动神经元损伤的保护作用;第叁部分以Nrf2/ARE通路下游经典抗氧化酶NQO1和抗氧化蛋白铁蛋白为代表,利用逆转录多聚酶链反应、免疫印迹等分子生物学方法,观察CPDT是否诱导了二者的功能性表达,探讨CPDT对选择性运动神经元损伤保护作用的机制。第四部分在肌萎缩侧索硬化转基因小鼠模型的基础上,利用原子吸收光谱和分子生物学方法,观察转基因小鼠疾病终末期脊髓腰膨大部位铁蛋白表达情况及铁含量的改变,初步探讨铁代谢在ALS发病机制中的作用,为进一步在转基因小鼠上进行CPDT干预打下前期基础。一、在脊髓器官型培养水平对Nrf2/ARE通路激活剂的筛选目的:在肌萎缩侧索硬化器官型培养模型的基础上,通过对脊髓片的形态学观察及计数腹角α运动神经元数目,筛选有效的Nrf2/ARE通路激活剂,为进一步研究其保护作用奠定基础。方法:8日龄SD乳大鼠在无菌条件下迅速取出脊髓,用活组织切片机切成350μm厚的薄片,放置于6孔培养板内的Millipore Millicell-CM insert上,每个insert上放5片,入CO2培养箱(37℃,5% CO2、95%空气)。经过1周的损伤恢复期后,加入100μmol/L的谷氨酸转运体抑制剂苏-羟天冬氨酸(THA),使细胞外谷氨酸堆积,对运动神经元造成损伤、而感觉神经元豁免,制备选择性运动神经元死亡的ALS体外培养模型。在此模型的基础上以Nrf2/ARE通路激活剂CPDT和D3T分别干预。将脊髓片随机分为5组,经过1周的损伤恢复期后开始干预:①正常对照组;②THA模型组;③CPDT或D3T预处理组(CPDT,D3T预处理48h+THA);④CPDT或D3T同时干预组(CPDT,D3T+THA);⑤溶剂DMSO对照组。每天在倒置显微镜下观察脊髓片的生长状态。于培养4周后取出各组脊髓片,用神经元特异性SMI-32免疫组化染色对α运动神经元进行鉴定、计数。结果:正常对照组脊髓片体外生长良好,面积逐渐增大,两侧腹角共有15-20个左右的α运动神经元;THA模型组脊髓片在体外生长不良,与对照组相比,腹角α运动神经元数明显减少(P<0.05),而脊髓背角的中间神经元数目无显着差异;经15、30μmol/LCPDT或D3T提前干预,脊髓片生长与正常对照组相近,与模型组相比腹角α运动神经元数明显增加(P<0.05); CPDT预处理组(15、30μmol/L)与D3T预处理组(15、30μmol/L)相比,α运动神经元存活数量稍有增多,但无统计学差异(P>0.05);而5μmol/LCPDT或D3T预处理组以及CPDT、D3T同时干预组脊髓片生长与模型组相近,与模型组相比腹角α运动神经元数无明显差异(P>0.05)。结论:本实验在肌萎缩侧索硬化器官型培养模型的基础上,对Nrf2/ARE通路激活剂进行筛选,发现经15μmol/LCPDT或D3T提前干预就可以完全抑制THA引起的选择性运动神经元的丢失;CPDT和D3T的效果相近,CPDT效果略优于D3T;Nrf2/ARE信号通路的激活有可能成为抗谷氨酸兴奋毒的新策略,CPDT和D3T是非常有前途的神经保护剂。二、Nrf2/ARE信号通路激活剂CPDT对选择性运动神经元损伤保护作用的研究目的:在肌萎缩侧索硬化器官型培养模型的基础上,在培养液中加入不同浓度的Nrf2/ARE通路激活剂CPDT,利用透射电镜、流式细胞仪以及生化方法,观察经CPDT干预脊髓组织超微结构的改变、组织线粒体膜电位的变化及培养液中乳酸脱氢酶和脂质过氧化产物丙二醛的含量,从不同角度观察CPDT在脊髓的器官型培养水平对腹角α运动神经元的保护作用。方法:在脊髓器官型培养基础上,将脊髓片随机分为4组,经过1周的损伤恢复期后开始干预:①正常对照组;②THA模型组;③15μmol/L CPDT预处理组(CPDT预处理48h+THA);④30μmol/L CPDT预处理组(CPDT预处理48h+THA);每周以相应的培养液换液两次,并收集各时间点的培养液。于培养4周后取出脊髓片,透射电镜观察超微结构改变、流式细胞术检测线粒体膜电位;并测定不同时间点培养液中乳酸脱氢酶(LDH)及丙二醛(MDA)含量,与模型组做比较。结果:透射电镜观察,正常对照组脊髓片腹角运动神经元形态正常;THA模型组主要的病理改变为神经元呈中至重度变性,胞内线粒体空泡化;而在15、30μmol·L CPDT预处理组腹角运动神经元基本正常,线粒体空泡变性明显改善。THA模型组与对照组相比线粒体膜电位降低,差异有统计学意义(P<0.01);15或30μmol/ L CPDT提前干预,可明显抑制线粒体膜电位的丢失(P<0.05)。与对照组相比,THA使培养液中LDH的逸漏增加、MDA含量升高;与模型组相比,经15或30μmol/ L CPDT提前干预,可使培养液中LDH、MDA含量明显下降(P<0.05)。结论:从不同角度证实CPDT对THA所致的选择性运动神经元慢性损伤具有显着的保护作用,CPDT通过保护线粒体、加强了自由基清除能力而使运动神经元免于THA所致的慢性损伤,推测其保护作用可能与诱导Nrf2/ARE通路下游靶基因的表达有关,Nrf2/ARE通路激活剂CPDT对于临床神经变性疾病的防治可能具有良好的应用前景。叁、Nrf2/ARE信号通路激活剂CPDT对运动神经元保护作用的机理研究目的:以Nrf2/ARE通路下游经典抗氧化酶:醌氧化还原酶1(NQO1)和抗氧化蛋白:铁蛋白(Ferritin)为代表,从基因水平、蛋白水平以及酶活性上观察CPDT是否诱导了二者的功能性表达,探讨Nrf2/ARE通路激活剂CPDT对运动神经元保护作用的机理。方法:在脊髓器官型培养基础上,以Nrf2/ARE通路激活剂CPDT干预,分为两个时间点。CPDT干预48小时:脊髓片经过1周的损伤恢复期后开始干预,分3组①对照组;②15μmol/L CPDT干预组;③30μmol/L CPDT干预组;培养48小时后取出。CPDT干预3周:经过1周的损伤恢复期后开始干预,分4组①正常对照组;②THA模型组;③15μmol/L CPDT预处理组(CPDT预处理48h+THA);④30μmol/L CPDT预处理组(CPDT预处理48h+THA)。于培养4周后取出脊髓片。将两个时间点的各组脊髓片分别提取总RNA和总蛋白,通过RT-PCR和Western blotting方法,从基因水平、蛋白水平观察各组NQO1和Ferritin-H的表达差异;并检测各组NQO1酶活性的改变。结果:在CPDT干预48小时这一时间点,经15μmolCPDT和30μmolCPDT干预,NQO1和Ferritin-H mRNA和蛋白表达较对照组明显升高(P<0.01);经15、30μmol/L CPDT干预,NQO1酶活性也呈剂量依赖性升高;30μmol/L CPDT干预组与15μmol/L CPDT干预组相比,NQO1和Ferritin-H的表达升高更为明显(P<0.05,P<0.01)。在CPDT干预3周这一时间点,15μmol/L CPDT预处理组和30μmol/L CPDT预处理组与模型组相比NQO1和Ferritin-H mRNA、蛋白的表达明显升高(P<0.05,P<0.01);NQO1酶活性较模型组也有所升高(P<0.01)。模型组与对照组相比,NQO1mRNA、蛋白表达以及酶活性也有所升高(P<0.01)。结论:在脊髓组织中CPDT可明显诱导Nrf2/ARE通路下游的抗氧化酶NQO1和抗氧化蛋白Ferritin重链的表达;由CPDT引起的NQO1和Ferritin表达上调,在抵抗选择性运动神经元损伤中发挥了一定程度的保护作用,推测Nrf2/ARE通路激活后诱导了下游一系列靶基因的表达上调,它们协同起来加强了组织的抗氧化能力,发挥了神经保护作用; CPDT与利鲁唑针对发病机制的不同环节,有望在临床上协同加强利鲁唑的治疗效果,Nrf2/ARE信号通路的激活有可能成为抗谷氨酸兴奋毒的新策略。四、ALS转基因小鼠模型中铁代谢的初探目的:探讨疾病终末期B6SJL-TgN (SOD1G93A)1Gur转基因小鼠(携带人突变的SOD1G93A基因)与同窝野生型小鼠和B6SJL-TgN (SOD1)2 Gur转基因小鼠(携带正常人SOD1基因)相比,脊髓组织中是否存在铁过载和铁蛋白表达的差异,为进一步在转基因小鼠上进行CPDT干预提供实验依据。方法:实验共分3组,模型组:B6SJL-TgN (SOD1G93A)1Gur转基因小鼠5只;对照组1:同窝野生型小鼠5只,对照组2:B6SJL-TgN (SOD1)2 Gur转基因小鼠3只。模型组于症状晚期取材,对照组于相应时间点同时取材。留取脊髓腰膨大将其分为两部分,一部分用于原子吸收光谱法测铁含量,另一部分用于提取总蛋白,免疫印迹法分析Ferritin-H蛋白表达情况。结果:在模型组小鼠疾病终末期腰膨大的铁含量(42.20±3.74μg/g),与对照组1小鼠(33.35±3.67μg/g)和对照组2小鼠(30.74±2.82μg/g)相比明显增加(P<0.01)。与对照组1和对照组2相比,模型组小鼠疾病终末期腰膨大内Ferrintin-H蛋白表达增加(P<0.01)。对照组1与对照组2之间并无铁含量和Ferrintin-H蛋白表达差异(P>0.05)。结论:与对照组1和对照组2相比,模型组小鼠疾病终末期脊髓腰膨大部位,存在着铁过载和Ferrintin-H蛋白表达上调的现象。在脊髓腰膨大内过多积聚的铁可能参与了ALS转基因小鼠的发病过程,推测Ferrintin-H蛋白表达上调是机体对铁过载的保护性反应,为进一步在转基因小鼠上进行CPDT干预提供了实验依据。
刘晓云[4]2007年在《运动神经元损伤机制及保护对策研究》文中指出运动神经元变性是多种神经系统疾病的重要病理过程,由于运动神经元的不可再生性,严重的运动神经元损伤造成的运动功能丧失带来永久的痛苦和家庭负担。运动神经元损伤有急性损伤和慢性损伤两种。脊髓损伤(SCI)是急性损伤的代表性疾病,运动神经元疾病尤其是肌萎缩侧索硬化(ALS)则以慢性进行性运动神经元变性为主要病理特点。急性创伤性脊髓损伤的病理过程包括两方面:一是最初的机械损伤,二是创伤后继发的迟发性损害。包括血管的异常、缺血再灌注、谷氨酸兴奋毒、氧化应激和炎症反应等。肌萎缩侧索硬化(ALS)的病因推测有以下几方面:1)遗传环境因素。2)谷氨酸兴奋毒作用。3)氧化应激。4)免疫因素。5)营养因子失衡。但何为ALS发病的启动因素尚不明确。纵观运动神经元急、慢性变性的病理过程,我们看到,尽管不同疾病造成的运动神经元损伤的直接致病因素不同,但谷氨酸的兴奋毒作用和氧化应激的作用都不容忽视。对运动神经元急、慢性变性的体外研究主要应用运动神经元单细胞培养(包括纯化的原代运动神经元培养、运动神经元样的细胞株(NSC34)培养)、器官型脊髓、脑薄片培养模型。对运动神经元急、慢性变性的在体研究,不同的损伤因素造成不同的动物模型,压迫、轴索断伤等都能在动物体内模拟急性运动神经元变性。因为携带突变的人的SOD1(hmSOD1)基因的G93A鼠运动行为及病理变化与人类ALS极为相似,所以针对运动神经元慢性变性的研究主要聚焦在G93A转基因小鼠模型上。对运动神经元损伤的研究最根本的目的是能阻止其变性的过程,最大可能地保存运动功能。然而因为运动神经元在体内的不可代替性和不可再生性,使对运动神经元的研究步履维艰。本论文共分七部分:第一部分,建立大鼠脊髓薄片的培养方法,判断SMI-32对体内、外运动神经元标记的特异性。第二部分,寻找由切割造成的脊髓运动神经元丢失的原因,应用二相酶诱导剂干预,观察其有无保护作用并探讨机制。第叁部分利用脊髓片的器官培养技术,用谷氨酸转运体抑制剂苏-羟天冬氨酸(THA)制作选择型脊髓前角运动神经元损伤的器官型培养模型,应用二相酶诱导剂干预,观察其有无保护作用并探讨机制。第四部分,根据谷氨酸的兴奋毒机制,利用谷氨酸转运体抑制剂苏-羟天冬氨酸(THA)制作运动皮层大锥体细胞损伤的脑片培养模型,应用二相酶诱导剂干预,观察其有无保护作用并探讨机制。第五部分,根据谷氨酸的兴奋毒机制,利用谷氨酸转运体抑制剂苏-羟天冬氨酸(THA)制作运动皮层大锥体细胞和脊髓运动神经元损伤模型,应用头孢曲松(Cef)干预,观察其有无保护作用。第六部分,根据谷氨酸的兴奋毒机制,利用谷氨酸转运体抑制剂苏-羟天冬氨酸(THA)制作运动皮层大锥体细胞和脊髓运动神经元损伤模型,应用胰岛素样生长因子(IGF-1)干预,观察其有无保护作用。第七部分,对引进的G93A转基因小鼠进行饲养、繁殖、鉴定和行为学评测。通过以上实验,我们试图揭示急、慢性运动神经元变性的一些相关因素,探讨谷氨酸兴奋毒作用和氧化应激在运动神经元损伤中的作用和相互影响,观察二相酶诱导剂和其它化合物对运动神经元损伤的保护作用并深入阐明其作用机制。并对引进的G93A转基因小鼠饲养、繁殖、鉴定和行为学评测,为今后对慢性进行性运动神经元变性疾病—ALS的治疗研究做好铺垫。第一部分脊髓运动神经元的生长发育及器官型体外培养模型的建立目的:建立了能在体外长期存活的稳定的脊髓器官型培养模型,判断SMI-32作为运动神经元标记物的特异性和灵敏性。方法:取生后1天、7天、1月龄、2月龄的SD鼠,切取腰膨大浸入4%多聚甲醛固定24小时。震荡切片机切片,片厚30μm。置于0.1M PB中漂洗后进行免疫组织化学染色。取出生后7天乳鼠的腰段脊髓组织切片做脊髓器官型培养,培养第叁天更换培养液一次,取培养1天、7天、1月的脊髓片用SMI-32进行免疫组化染色,对脊髓前角运动神经元进行记数。结果:用SMI-32能够标记不同月龄SD大鼠腰膨大脊髓运动神经元,我们发现尽管由于发育阶段的不同SMI-32阳性运动神经元以及突起、纤维的分布有所改变,但不同月龄SD大鼠腰膨大脊髓运动神经元都可以用SMI-32标记。体外培养的脊髓薄片的运动神经元也可以用SMI-32标记,由于切割等因素会造成培养一周内运动神经元的数量下降,但一周后乃至培养四周运动神经元数量和形态相对稳定,是进行实验干预的最佳时间。结论:脊髓薄片的体外培养技术是研究运动神经元病理生理机制尤其是慢性损伤的理想模型。SMI-32是标记运动神经元的理想Marker。第二部分二相酶诱导剂对创伤导致的脊髓运动神经元损伤的保护作用目的:探讨二相酶诱导剂能否对创伤引起的脊髓运动神经元损伤有保护作用。方法:取出生后7天乳鼠的腰段脊髓组织切片做脊髓器官型培养,在培养液中分别加入二相酶诱导剂t-BHQ, D3T, CPDT(溶于0.1%的DMSO中,30μmol/L),溶剂对照组加入0.1%的DMSO,正常对照组培养液中不加任何药物,培养第叁天更换培养液一次,培养7天后,用运动神经元的标记物SMI-32进行免疫组化染色,对脊髓前角运动神经元进行记数,各组留取培养两天的培养液检测谷氨酸的变化。各组留取培养两天脊髓片进行电镜观察和Nrf2和HO-1mRNA的检测。结果:在体外培养的脊髓片中观察到运动神经元由于切割造成的损伤数目会有所减少,经过一周的修复,运动神经元的数目趋于稳定,培养四周与培养一周运动神经元的数目没有明显的改变。在此基础上,我们检测了培养液中谷氨酸水平,发现新鲜配制的正常培养液的谷氨酸浓度是17μmol/L,脊髓片培养48小时后脊髓片的培养液的谷氨酸浓度明显升高,培养一周后下降。在电镜下观察到切割后造成运动神经元变性坏死,线粒体嵴断裂、肿胀等现象。在脊髓片培养液中加入二相酶诱导剂:t-BHQ, D3T, CPDT,我们发现运动神经元存活数目明显增加,电镜下,运动神经元线粒体损害明显减轻。进一步通过RT-PCR检测发现Nrf2和HO-1mRNA表达明显升高。结论:通过以上实验,我们认为,脊髓片体外培养最初一周的运动神经元减少主要是由于切割造成的,这一修复过程类似于严重的脊髓外伤。谷氨酸升高造成的兴奋毒作用和线粒体损害参与了外伤性运动神经元损伤的病理过程。而二相酶诱导剂通过激活Nrf2和血红素加氧酶1(HO-1),能够提高了脊髓薄片的抗氧化能力,降低了脊髓运动神经元线粒体损害的程度,增加了运动神经元的存活。第叁部分二相酶诱导剂对谷氨酸转运体抑制剂(THA)诱导的脊髓运动神经元损伤的保护作用目的:研究二相酶诱导剂—t-BHQ(Tert-butylhydroguinone), D3T(3H-1,2-dithiole-3-thione), CPDT对THA诱导的慢性运动神经元变性的保护作用。方法:选用生后7天的SD乳鼠腰段脊髓组织切成薄片进行体外培养,正常培养一周后,二相酶诱导剂组在培养液中分别加入t-BHQ, D3T, CPDT(浓度为15、30μmol/L,用DMSO溶解,DMSO在培养液中的终浓度为0.1%)。THA组加入100μmol/L的THA,溶剂对照组在培养液中加入DMSO,终浓度为0.1%。正常对照组培养液中不加任何药物。4周后应用免疫组织化学方法显示运动神经元数量变化并在电镜下观察其超微结构的变化,并对Nrf2/HO-1的mRNA、蛋白、及酶活性进行了检测,同时检测了培养液中谷氨酸的浓度和谷氨酸转运体—GLT1的表达改变,深入探讨二相酶诱导剂的作用机制。结果:谷氨酸转运体抑制剂(THA)能够造成选择性运动神经元损伤,二相酶诱导剂对THA引起的运动神经元的丢失有保护作用,且能够减轻THA引起运动神经元超微结构尤其是线粒体损害。并进一步证实THA由于抑制了谷氨酸的转运导致胞外谷氨酸增加,引起谷氨酸兴奋毒作用,造成运动神经元死亡。CPDT对细胞外谷氨酸水平没有影响,也不影响GLT1的表达,而是通过激活Nrf2/HO-1信号通路提高了脊髓的抗氧化能力,减少了运动神经元的丢失。结论:应用谷氨酸转运体抑制剂(THA)造成细胞外谷氨酸增高,引起谷氨酸兴奋毒造成运动神经元的丢失。二相酶诱导剂虽然不能影响谷氨酸的转运,但能通过激活Nrf2/HO-1信号通路提高了脊髓的抗氧化能力,减少了运动神经元的丢失,二相酶诱导剂有望成为ALS治疗的新切入点。第四部分二相酶诱导剂CPDT对谷氨酸转运体抑制剂(THA)诱导的运动皮层大锥体细胞损伤的保护作用目的:研究二相酶诱导剂—CPDT对THA诱导的皮层锥体细胞损伤的保护作用。方法:选用1日龄SD大鼠将其包含运动皮层的脑组织切成薄片进行体外培养,正常培养两周后,二相酶诱导剂组在培养液中加入CPDT(浓度为15、30μmol/L,用DMSO溶解,DMSO在培养液中的终浓度为0.1%)。溶剂对照组在培养液中加入DMSO,终浓度为0.1%。THA组加入100μmol/L的THA,正常对照组培养液中不加任何药物。药物干预3周后应用免疫组织化学方法显示运动神经元数量变化,并对Nrf2/HO-1蛋白进行了检测,深入探讨二相酶诱导剂的作用机制。结果:谷氨酸转运体抑制剂(THA)能够造成慢性皮层锥体细胞损伤,二相酶诱导剂对THA引起的皮层锥体细胞的丢失有保护作用。并进一步证实CPDT是通过激活Nrf2/HO-1信号通路提高了皮层的抗氧化能力,减少了皮层锥体细胞的丢失。结论:本实验研究成功地建立了运动区脑片的培养方法,应用谷氨酸转运体抑制剂苏-羟天冬氨酸(THA)引起皮层运动神经元数目的减少。证实二相酶诱导剂通过激活Nrf2/HO-1信号通路对THA引起的皮层运动神经元的丢失发挥保护作用。第五部分头孢曲松对THA诱导的大鼠运动神经元损伤的保护作用目的:研究β内酰胺类抗生素-头孢曲松对THA诱导的运动神经元损伤的保护作用。方法:选用生后7天的SD大鼠和1日龄SD大鼠,7日龄大鼠用于脊髓片培养,1日龄大鼠用于脑片培养。在无菌的条件下断头取脊髓腰膨大部分和脑组织,将脊髓腰膨大部分和包含运动皮层的脑组织切成薄片进行体外培养2周后进行干预,对照组加入正常培养基,模型组给予谷氨酸转运体抑制剂-THA(100μmol/L)进行干预,头孢曲松组于培养液中同时加入THA和头孢曲松(100μmol/L)。药物干预3周后,应用免疫组织化学方法显示运动神经元,计数其数量变化。结果:THA能够诱导脊髓前角运动神经元和皮层运动神经元死亡,头孢曲松能够提高运动神经元的存活数量。结论:头孢曲松对THA诱导的运动神经元损伤具有保护作用,β内酰胺类抗生素有益于ALS的治疗。第六部分胰岛素样生长因子(IGF-1)对THA诱导的大鼠运动神经元损伤的保护作用目的:研究胰岛素样生长因子(IGF-1)对THA诱导的运动神经元损伤的保护作用。方法:选用生后7天的SD大鼠和1日龄SD大鼠,7日龄大鼠用于脊髓片培养,1日龄大鼠用于脑片培养。在无菌的条件下断头取脊髓腰膨大部分和脑组织,将脊髓腰膨大部分和包含运动皮层的脑组织切成薄片进行体外培养,对照组加入正常培养基,模型组给予谷氨酸转运体抑制剂-THA进行干预,IGF-1组于培养液中同时加入THA和不同浓度的IGF-1。药物干预3周后,应用免疫组织化学方法显示运动神经元,计数其数量变化。结果:THA能够诱导脊髓前角运动神经元和皮层运动神经元死亡,IGF-1能提高运动神经元的存活。结论: IGF-1对THA诱导的慢性运动神经元损伤具有保护作用,IGF-1有益于ALS的治疗。第七部分SOD1基因突变对运动神经元的影响目的:将由Jackson Lab引进的B6SJL-Tg(SOD1-G93A)1Gur/J鼠和用于繁殖hmSOD1(G93A)基因阳性的半合子(hemizygote)鼠进行鉴定、繁殖和观察。为ALS的实验研究的深入进行奠定基础。方法:将B6SJL-Tg(SOD1-G93A)1Gur/J鼠和hmSOD1(G93A)基因阳性的半合子(hemizygote)鼠交配,留取子代鼠的鼠尾和血液,提取组织和血液DNA进行PCR反应以鉴定携带hmSOD1的阳性鼠。并对子代鼠进行行为学观察。结果:所有存活的子代鼠发育情况良好,活动力强。hmSOD1基因阳性鼠在15周左右逐渐有行动缓慢伴肢体震颤,伸展困难。随后出现一侧后肢行走时的拖拽现象和萎缩,另一侧后肢也继之受累,整个后肢和后半身逐渐萎缩消瘦,双侧后肢呈伸直样,终末期的转基因鼠因进食困难而衰竭死亡,存活时间约19-20周。hmSOD1基因阴性鼠无上述表现,生命周期与其他正常小鼠一样。应用PCR进行测序,阳性率高,特异性强。测序结果通过PubMed的BlAST检验证实PCR产物来自于hSOD1基因,并存在G93A(在基因上表现为的GCT替代GGT)突变。结论:G93A SOD1转基因小鼠的成功构建,给人类肌萎缩侧索硬化症的深层次研究和治疗策略的摸索提供了几乎全真的疾病模型,本实验通过对G93A SOD1转基因小鼠的引进、鉴定、繁殖和观察,成功的建立了子代鼠的繁育和转基因阳性鼠基因鉴定和行为学观察方法,证实了SOD1基因突变的确造成了运动神经元损伤。为今后研究的深入奠定了实验基础。第八部分脊髓和肌肉共培养方法的建立目的:建立能在体外长期存活的稳定的脊髓和肌肉共培养的器官型培养模型。方法:脊髓和肌肉共培养时,将7日龄SD乳鼠快速在75%乙醇、碘酒、75%乙醇中浸泡消毒,断头,在无菌条件下快速分离、取出整条脊髓,解剖显微镜下分离并剪断腰段脊髓的神经根,用McIIwain组织切片机切成350μm厚的薄片,将腰段脊髓的切片转移到GBSS中。在缓冲液中分辨脊髓的前角和后角,将前角前索的纤维剪除。肌肉组织取自同一只鼠的后肢。沿肌纤维的方向撕成条。将肌肉和脊髓种植在同一个insert中。脊髓单独培养和共培养每组9片,培养4周后取出,4%多聚甲醛固定40分钟后进行免疫组化染色,戊二醛固定备电镜观察。运动神经元用SMI-32进行免疫组化染色,对脊髓前角运动神经元进行记数。结果:共培养的脊髓片上运动神经元数量较脊髓片单独培养多,有显着性差异。用罗丹明-α-金环蛇毒素和乙酰胆碱酯酶两种方法标记神经肌肉接头,在共培养的肌肉上观察到了和在体相似的运动终板,呈棕色或红色荧光,卵圆形。电镜观察体外培养的肌细胞多核,细胞器正常。共培养的标本中,发现有神经深入到肌细胞间。在突触囊泡中可以看到清亮的和致密的递质小泡。结论:本实验对体外培养的器官型脊髓薄片和肌肉共培养,发现二者能够在体外建立联系,而且肌肉组织能够提供脊髓营养成分,提高运动神经元的存活。本实验为进一步研究运动神经元和肌肉之间的相互影响和相互作用提供了一个稳定的体外模型。
肖向建[5]2005年在《肌萎缩侧索硬化体外培养模型的建立》文中提出肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis, ALS )是中枢神经系统常见的一种慢性进行性变性疾病,以脑和脊髓中选择性的运动神经元的变性为特征,临床表现为缓慢起病,进行性发展,逐渐出现四肢肌肉的无力、萎缩,并有锥体束征等。ALS 是一种致死性疾病,患者多在首次出现症状后的3-5 年内死于呼吸衰竭。根据其发病和遗传特点可分为家族型肌萎缩侧索硬化(Familial Amyotrophic Lateral Sclerosis,FALS)和散发型肌萎缩侧索硬化(Sporadic Amyotrophic Lateral Sclerosis,SALS),其中FALS 不足10%,而SALS 则占整体ALS 的90%以上。FALS 主要是由于编码Cu/Zn 超氧化物歧化酶(SOD1)的基因突变引起,其突变位点在21 号染色体长臂Cu/Zn SOD 基因内,即21q22.1-22.2。SALS 目前病因不清,其发病机制可能主要集中在以下几个方面:①谷氨酸的兴奋毒作用和钙离子超载;②自由基的毒性作用;③自身免疫机制;④线粒体功能异常;⑤神经丝的过度磷酸化;⑥神经营养因子缺乏等。目前,ALS 的实验模型主要集中在SOD1 转基因模型和体外培养模型上。转基因动物模型的优点在于能够模拟ALS 慢性进展性疾病病程以及一部分病理和生化表现(包涵体形成、神经丝的聚集以及运动神经元调亡,自由基增多和谷氨酸水平升高等),其缺点在于该模型是根据FALS遗传特点,即SOD1 基因突变制作的,是FALS 的动物模型,而不能代表占所有ALS 病人80%以上的散发性ALS,且转基因的实验技术要求过高,多数实验室不能开展,不利于模型的推广使用。传统的运动神经元单细胞培养优点是干扰因素少,能直观、动态地观察神经元的形态和功能变化以及对药物的反应;其缺点是操作复杂,技术要求极高,且细胞存活时间太短,不适合研究像ALS 这样的慢性进行性变性疾病,且纯运动神经元培养不能模拟体内复杂的生理环境,不能反应神经元与胶质细胞的相互作用,因此也不是研究ALS 的理想的实验模型。脑片和脊髓片的器官型培养,可以长时间地存活,并可维持相对完整的形态,保持神经元与神经元之间以及神经元与胶质细胞间的突触联系,
王晓娟[6]2004年在《肌萎缩侧索硬化脊髓器官型培养模型的研究》文中认为肌萎缩侧索硬化（Amyotrophic Lateral Sclerosis，ALS）是一种支配随意运动的上下运动神经元选择性受累的神经系统变性疾病。它是以进行性的肌肉无力为特点的致死性疾病，患者多在首次出现症状后的3-5年内死于呼吸衰竭。该病的平均发病年龄在59岁，发病率在1/10万-3/10万，患病率多在5/10万-7/10万，是成年人最常见的导致瘫痪的疾病之一。根据其特点本病又可分为家族型肌萎缩侧索硬化（Familial Amyotrophic Lateral Sclerosis，FALS）和散发型肌萎缩侧索硬化（Sporadic Amyotrophic Lateral Sclerosis，SALS），其中FALS 不足10%，而SALS则占整体ALS的90%以上。ALS的典型病理改变为皮层上运动神经元和脑干、脊髓的下运动神经元丧失，锥体束变性，以脊髓的改变最为明显，残留的运动神经元通常也发生萎缩，在胞体和轴突中有神经丝的异常聚集。时至今日，治疗上除仅有的几种（如机械通气、力如太）能在一定程度上延长ALS的病程外，尚无特效的治疗手段，这主要是由于人们对此病运动神经元损伤的原因、机制及转归等了解不清所致。实验模型的建立将有助于人们进一步探讨其发病机制，开发新型神经保护治疗。病因学研究发现10-20%的FALS（约占总的ALS患者的5-10%）有铜/锌超氧化物歧化酶的基因突变，提示FALS可能就是一种基因病，而占ALS绝大多数的SALS病人的病因目前仍不清楚。一些研究显示SALS的发病机理可能集中在以下几个方面：兴奋毒作用、自身免疫异常、氧化应激、神经元调亡及线粒体功能障碍等。其中以兴奋毒机制证据最多。谷氨酸是中枢神经系统内最主要的兴奋性递质，谷氨酸能神经元过度激活及突触间隙中的谷氨酸过多堆积均可通过激活谷氨酸受体对突触后神经元及其周围组织造成兴奋毒性。在胶质细胞和神经元胞体中均存在有谷氨酸转运体，尤其是星形胶质细胞上的高黏附性的谷氨酸转运体，可以转运细胞外的谷氨酸，这是机体避免兴奋毒的主要机制。当谷氨酸转运体功能受到明显抑制时，就会造成细胞外谷氨酸堆积形成兴奋毒性。脊髓的器官型培养可以长时间地进行培养并可维持相对完整的脊髓<WP=5>形态，较单细胞培养更适于研究脊髓病变。我们利用脊髓器官型培养技术，结合谷氨酸兴奋毒机制，慢性阻抑培养脊髓片的谷氨酸转运，可以制备ALS的体外培养模型，进一步探讨选择性运动神经元损伤的部分机制。课题研究分叁部分：第一部分建立脊髓片器官型培养方法，并将培养的脊髓片与体内发育至同时期的脊髓做比较；第二部分依据谷氨酸兴奋毒机制，应用适当浓度的谷氨酸转运体抑制剂苏-羟天冬氨酸抑制谷氨酸转运，使细胞外谷氨酸堆积对运动神经元造成损伤而感觉神经元不受影响，建立ALS的体外培养模型。第叁部分利用体外培养模型观察ALS患者血清对脊髓运动神经元的影响，探讨其选择性运动神经元损伤的部分机制。一、脊髓薄片器官型培养的方法研究目的: 研究脊髓薄片器官型培养的方法并对脊髓腹角α运动神经元和背角中间神经元进行鉴别，建立稳定的脊髓体外培养模型。观察体外大鼠器官型培养的脊髓薄片是否与同龄大鼠体内生长的脊髓具有相似的形态和恒定的腹角α运动神经元数目，建立能模拟体内生长环境的稳定的体外脊髓器官型培养模型。方法：脊髓器官型培养采用8日龄SD大鼠的腰段脊髓，在无菌条件下快速分离、取出整条脊髓，解剖显微镜下分离并剪断腰段脊髓的神经根，用MCIL组织切片机切成350μm厚的薄片，将腰段脊髓的切片转移到GBSS中，在室温下仔细分离成单片，6孔培养板内每孔放入1ml培养基MS，并放置Millipore insert.，将完好的脊髓片转移至insert上，每个insert上放5片，入CO2培养箱（37℃，5% CO2+95%空气），每周换液2次。测定各时点培养液中乳酸脱氢酶（LDH）的含量。用神经元的特异性免疫组化染色SMI-32对脊髓腹角α运动神经元加以鉴定并与同龄大鼠体内生长的脊髓做比较，用抗Calretinin单克隆抗体对脊髓片背角的中间神经元进行鉴别。结果：脊髓片在体外生长良好，形态完整，培养存活率高，达90%以上；存活时间长，可达2个月以上。SMI-32组化染色可见每侧的脊髓腹角均有 5-15个左右的α运动神经元被染成深棕色，其直径均在25μm以上，突起细长，彼此形成突触联系，α运动神经元数目与体内发育至同时期的大鼠比较无显著差异。Calretinin组化染色见双侧脊髓背角有大量Calretinin阳性着色的中、小体积的中间神经元，而脊髓腹角α运动神经<WP=6>元多为阴性。脊髓培养液中LDH的含量较恒定，各时点差异无显着性。结论：本实验研究成功地建立了大鼠腰段脊髓的器官型培养模型，并能以免疫组化方法对腹角α运动神经元和背角感觉神经元进行鉴别。培养的脊髓片存活率高，存活时间长，可维持恒定的α运动神经元数目，与发育至同时期的大鼠体内脊髓切片比较形态、α运动神经元数目均无显着差别，在一定时期内可以模仿体内的生存环境，为研究脊髓生理、病理改变及开发新的神经保护因素提供了有效的实验方法。二、肌萎缩侧索硬化脊髓器官型培养模型的研究目的：越来越多的研究显示谷氨酸的兴奋毒性作用是ALS发病的重要机制之一。人体内最主要的也是含量最高的兴奋性氨基酸是谷氨酸，正常情?
郭艳苏[7]2006年在《免疫介导运动神经元损伤模型的建立及其发病机理》文中提出肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)是一种以选择性运动皮质、脑干及脊髓运动神经元丢失为特征的致死性神经变性疾病。临床上表现为慢性进行性肌无力、肌萎缩及锥体束征等,多于患病后3~5年死于呼吸衰竭。分为家族性ALS(familial ALS, fALS)和散发性ALS (sporadic ALS, sALS),其临床和病理相似。其中fALS仅占5%~10%,而大约20%的fALS与编码Cu/Zn超氧化物歧化酶(Cu/Zn SOD1)的基因突变有关。sALS的发病机理不清,选择性运动神经元丢失的假说主要包括:①自身免疫机制;②氧化损伤;③细胞外谷氨酸失衡导致的兴奋毒性;④神经中丝的过度磷酸化;⑤线粒体功能异常等。目前,大量研究表明自身免疫机制可能参与ALS运动神经元损伤过程。ALS患者尸检的脊髓中发现T淋巴细胞浸润;血清中存在抗钙通道的抗体;ALS IgG被动传输给小鼠,可引起后肢瘫痪及IgG在运动神经元及运动轴索终末沉积等均支持免疫机制可能参与sALS的病理生理过程。因此,建立稳定的免疫介导的运动神经元损伤动物模型,对于ALS发病机制及运动神经元保护研究是非常有帮助的。我们用牛脊髓前角匀浆免疫豚鼠制成免疫介导的运动神经元损伤动物模型。该模型缓慢起病,进行性发展,且具有选择性运动神经元丢失、肌无力和肌肉萎缩、肌电图失神经改变等特点,与人类ALS相似。在此基础上,研究谷氨酸兴奋毒作用、氧化应激、钙超载等几方面在免疫作为始动因素条件下,引起选择性运动神经元损伤过程中的可能作用,从而为进一步开发保护性治疗药物奠定理论基础。实验研究论文由四部分组成:第一部分建立免疫介导的运动神经元损伤动物模型,并对其临床表现、运动神经元变性丢失情况、肌电图、肌肉神经病理、血清抗体及组织内原位IgG沉积进行研究;第二部分研究免疫介导的运动神经元损伤过程中星形胶质细胞形态数量、特异性细胞骨架蛋白GFAP及星形胶质细胞上谷氨酸转运体(GLT-1)的表达变化,分析谷氨酸介导的兴奋毒机制在此模型中的可能作用;第叁部分利用免疫组化和免疫印迹技术研究免疫介导运动神经元损伤过程中核转录因子Nrf2及抗
毛志娟[8]2017年在《肌萎缩侧索硬化患者特异性iPS细胞系的建立及线粒体功能的初步研究》文中提出第一部分 ALS患者特异性i PS细胞系的建立目的利用仙台病毒将ALS患者外周血T细胞重编程为iPSC,建立无外源基因整合的患者特异性的iPS细胞系。方法利用Ficoll离心法分离ALS患者4mL外周血单个核细胞,在CD3和rIL-2的作用下选择性激活并扩增T细胞。培养T细胞5天后用携带OCT3/4,SOX2,Klf4和c-Myc基因的含温度敏感突变的仙台病毒转染T细胞。转染后的T细胞种植在饲养层MEF上培养得到TiPSC。对重编程得到的TiPSC进行碱性磷酸酶染色,多能性标志物鉴定和核型鉴定。用PCR检测不同时期细胞内仙台病毒及4个重编程因子情况。结果iPSC的诱导效率达0.45%。仙台病毒转染T细胞10天左右出现多个细胞聚集,约15天左右出现iPSC克隆。这些iPSC碱性磷酸酶染色阳性,表达多能性标志物,传至30代后仍核型正常,且无外源基因整合。结论仙台病毒可以将ALS病人少量外周血T细胞重编程为iPSC,重编程效率高,且获得的iPSC无外源基因整合。第二部分ALS患者特异性iPSCs定向分化为脊髓运动神经元的研究目的在一系列小分子的作用下将ALS患者特异性的iPSCs定向分化为脊髓运动神经元方法选择生长状态良好的ALS-iPSCs进行分化。第一步:在T-GFβ/BMP信号通路抑制剂 DMH1(2μM)、SB431542(2μM)和 Wnt 信号激动剂 CHIR99021(3μM)的6天诱导下将iPSC分化为神经上皮祖细胞;第二步:加入尾侧化(视黄酸,RA 0.1μM)和腹侧化(SHH激动剂,Purmorphamine0.5μM)分子并降低CHIR99021浓度至3μM,培养6天,将神经上皮祖细胞分化为脊髓运动神经元祖细胞。第叁步:撤掉在T-GFβ/BMP信号通路抑制剂和Wnt信号激动剂,调整RA浓度至0.5μM,Purmorphamine浓度至0.1μM,悬浮培养7天得到有丝分裂后运动神经元;第四步:有丝分裂后运动神经元贴壁培养,在notch信号抑制剂Compound E的作用下10天成熟化为成熟的神经元。同时我们尝试用一种强效的SHH激动剂,Smoothened Agonist(SAG)代替 Purmorphamine 进行诱导分化。结果iPSC分化第6天得到SOX1 +,HOXA3+的神经上皮祖细胞,第12天得到Olig2+,NKX2.2-的脊髓运动神经元祖细胞(效率>95%),第19天得到HB9+,Tuj1+的有丝分裂后运动神经元,第29天得到Map2+,Chat+的成熟运动神经元(效率约90%)。而SAG诱导产生的神经元祖细胞共表达Olig2和NKX2.2,代表的可能是介于运动神经元祖细胞和中间神经元祖细胞的一种中间状态细胞。结论ALS-iPSC在特定浓度,特定顺序T-GFβ/BMP信号通路抑制剂、Wnt信号激动剂,视黄酸,SHH激动剂和notch信号抑制剂的作用下,1个月内即可高效率地分化为脊髓运动神经元。而SAG代替Purmorphamine的浓度尚需进一步摸索。第叁部分ALS患者线粒体功能及相关机制的初步探究目的用ALS患者特异性iPSC分化的脊髓运动神经元对ALS患者线粒体功能及相关机制的初步探究方法将携带SOD1 D90A突变的ALS患者iPSC分化为脊髓运动神经元,选取SOD1 D90A iPSC经TALEN基因矫正后的89 iPSC分化的脊髓运动神经元作为对照组,用透射电镜观察运动神经元内线粒体、内质网等超微结构;用mitotraker green/red荧光染料标记线粒体,测量线粒体数量、长度,观察线粒体运动;用calcein-AM荧光探针标记,观测线粒体膜通道孔开放情况;用Dilc(5)荧光染料标记,测量线粒体膜电势;用荧光蛋白标记内质网,观察内质网和线粒体相互作用情况。结果与89 iPSC分化的运动神经元相比,D90A iPSC分化的运动神经元内线粒体肿胀,结构模糊;线粒体分布异常,数量减少,长度减短,运动减少。线粒体膜通道开放,线粒体电势降低。这可能是由于D90A运动神经元内质网片段化,与线粒体形成复合物,两者之间距离变小,线粒体内钙过度累积所致。结论ALS发病初期甚至潜伏期运动神经元便出现线粒损伤及功能异常,这可能是ALS发病的重要原因之一。
李彬[9]2008年在《脂多糖对脊髓前角运动神经元的损伤作用及机制探讨》文中指出肌萎缩侧索硬化(ALS)是选择性侵犯上、下运动神经元的慢性进行性变性疾病。目前ALS的病因及发病机制尚不十分清楚,推测有以下几种:线粒体功能障碍、蛋白质异常聚集、兴奋毒作用、轴浆运输障碍、氧化应激、生长因子缺乏和炎症等。各种发病因素并非独立存在,而是相互作用、相互影响,共同参与了疾病的发生发展。近年来越来越多的证据显示,运动神经元的选择性丢失并非细胞自主性的(non-cell-autonomous),胶质细胞的功能状态及炎症反应在ALS的疾病进程中发挥着关键作用。研究发现,在ALS病人和转基因动物模型中,存在大量激活的小胶质细胞、反应性星形胶质细胞、炎性细胞因子以及趋化因子等,并且小胶质细胞激活和部分炎症因子的增多出现在大量运动神经元丢失之前。对ALS患者血清、皮肤及肌肉的分析结果显示机体存在广泛的炎症反应。这些证据提示炎症反应是ALS发病过程中的一个重要方面,可能介导了运动神经元的损伤。免疫炎症反应包括天然免疫应答和适应性免疫应答,其中天然免疫应答在神经变性疾病中的重要作用逐渐引起广泛关注。构成中枢神经系统(CNS)天然防御系统的主要成分包括小胶质细胞和星形胶质细胞,在很多神经变性疾病中被激活,释放一系列炎性递质和其它一些损伤反应因子。炎症反应具有双重作用,适当的炎症反应可以促进组织修复,然而,当炎症反应过度或长期持续存在时,则可能加重组织损伤。目前,有关炎症反应在ALS中的确切作用及其机制还存在很多亟待解决的问题,需要深入研究、探讨,为开发新的治疗策略提供理论依据。炎症过程可以参与氧自由基形成,产生氧化应激。在CNS氧自由基的一个重要来源是活化胶质细胞的呼吸爆发系统。在炎症过程中,呼吸爆发系统的功能酶—NADPH氧化酶发生激活,释放大量的超氧阴离子(O2?..),并可进一步反应生成H2O2、HOCl、?OH等其它活性氧(ROS)以及过氧化亚硝酸盐(ONOO?)。另外,NADPH氧化酶来源的ROS可以调控与免疫炎症相关的基因表达,导致神经免疫炎性因子TNF-α等的产生。因此认为NADPH氧化酶在氧化应激和炎症反应中均发挥着关键作用,而这两者又参与了ALS运动神经元损伤的病理过程。由此推测,NADPH氧化酶有可能介导了对运动神经元的毒性作用。机体内的自由基除了ROS外,还有活性氮(RNS),其中最重要的是一氧化氮(NO)。在炎症过程中,神经元和激活的胶质细胞中一氧化氮合酶(NOS)表达或活性增加,导致大量NO产生,并可与O2?.反应生成强氧化剂ONOO?。有关NOS和NO在ALS中的确切作用一直是人们争论的焦点和研究的热点。NO作为一种重要的信使分子,在机体内具有双重功能,既是生物体内多种生理过程所必需的,又参与了多种疾病的病理生理过程。基于NO的这种复杂作用,有必要探讨其在炎症介导的运动神经元损伤中的确切作用。脊髓器官型培养保留有完整的脊髓水平组织结构和细胞间突触联系,较单细胞培养更接近在体生理环境,且运动神经元能够稳定存活较长时间,为研究ALS等慢性疾病提供了重要的技术手段。脂多糖(LPS)通过Toll样受体,激活机体的天然免疫系统(在CNS主要是小胶质细胞和星形胶质细胞),引起炎症反应。因此本研究应用LPS,利用器官型脊髓薄片培养技术建立了炎症介导的运动神经元损伤的体外模型,并以此模型为基础,深入探讨了运动神经元的损伤机制。课题研究分叁部分:第一部分利用脊髓器官型培养,加入合适浓度的LPS,诱导炎症反应,建立运动神经元相对选择性受损的体外培养模型,并对运动神经元的易受损性进行了分析;第二部分以此模型为基础,利用RT-PCR、免疫印迹等方法,研究了NADPH氧化酶在其中的变化规律,并应用相应的抑制剂apocynin证实了NADPH氧化酶在LPS诱导的运动神经元损伤中的关键作用;第叁部分利用分子生物学等技术,证实LPS干预后可引起该培养体系中诱导型NOS (iNOS)和神经型NOS (nNOS)活性增加、NO生成增多,进一步应用NOS选择性和非选择性抑制剂均未能有效对抗运动神经元损伤,提示在该模型体系中,NO可能并未对运动神经元损伤起着决定性作用。一、脂多糖诱导的脊髓前角运动神经元损伤及其易感性研究目的:利用脊髓器官型培养,观察LPS能否诱导该体系炎症反应的发生,寻找合适的剂量建立运动神经元相对选择性受损的体外培养模型,探讨运动神经元易感性的可能原因。方法:选用生后7天的SD乳鼠腰段脊髓组织切片进行体外培养,正常培养1周后,进行干预。对照组为单纯培养液,LPS组加入不同浓度的LPS (1、10、30、60μg/ml),应用SMI-32和calretinin免疫组化染色对培养后2、3、4周时的脊髓薄片腹角运动神经元和背角中间神经元进行计数,透射电镜观察超微结构变化,测定各时点培养液中乳酸脱氢酶(LDH)含量,利用RT-PCR技术观察LPS处理后肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(L-1β) mRNA表达水平。选取30μg/ml LPS处理2周作为进行药物干预实验的剂量和时间。脊髓片体外培养1周后,分别给予单纯培养液、LPS (30μg/ml)、细胞内钙离子螯合剂BAPTA-AM (10μmol/L)加LPS (30μg/ml),干预2周后用免疫组化方法显示运动神经元,计数各组运动神经元数量。结果:⑴正常对照组脊髓薄片在体外存活良好,运动神经元数目恒定,1μg/ml LPS组各时点运动神经元数量无显着变化(P>0.05),10μg/ml LPS组运动神经元数量随时间延长而逐渐减少,处理3周后与对照组比较有显着性差异(P<0.05),而30、60μg/ml LPS组分别在处理2周和1周后出现运动神经元数量的减少(P<0.05, P<0.01)。⑵1、10、30μg/ml LPS处理1~3周以及60μg/ml LPS处理2周内背角中间神经元数量与对照组相比无显着变化(P>0.05),60μg/ml LPS处理3周后中间神经元数量开始减少(P<0.05)。⑶10μg/ml LPS处理3周后出现LDH含量增高(P<0.05),而30、60μg/ml LPS组LDH在LPS处理2周后即开始增高,与对照组比较有显着性差异(P<0.05)。⑷透射电镜观察,对照组神经元和胶质细胞结构基本正常;30μg/ml LPS处理2周后,超微结构显示腹角运动神经元空泡变性,线粒体肿胀、嵴断裂,内质网和高尔基体扩张,脊髓背角中间神经元超微结构改变不明显,小胶质细胞体积明显增大,胞浆内出现大量的脂滴和膜性小体。⑸30、60μg/ml LPS处理1天后,TNF-αmRNA水平较对照组明显增高(P<0.05, P<0.01);处理3天后,IL-1β表达水平也明显升高(P<0.01)。⑹脊髓薄片体外培养1周后,同时应用10μmol/L BAPTA-AM和30μg/ml LPS进行干预,与LPS组相比,运动神经元存活数量明显增加(P<0.01),胞体形态规则,突起增多。结论:在体外脊髓器官型培养体系中加入LPS,可以诱导炎症反应,引起剂量和时间依赖性的运动神经元数量减少和培养液中乳酸脱氢酶含量增高。30μg/ml LPS作用2周后,可引起SMI-32阳性运动神经元减少,超微结构改变,而并不明显影响中间神经元的存活,与ALS的病理特点相一致,可用于制备ALS的脊髓器官型培养模型。运动神经元缺乏钙网膜蛋白表达,而细胞内钙离子螯合剂BAPTA-AM减轻运动神经元损伤,提示钙离子缓冲能力较低是其较易受损的原因之一。该模型的建立,为后续研究ALS的发病机制、探索新的治疗策略提供了实验基础。二、NADPH氧化酶参与脂多糖诱导的运动神经元损伤目的:利用LPS诱导的运动神经元相对选择性受损的脊髓器官型培养模型,研究NADPH氧化酶在其中的变化规律,并应用相应的抑制剂反证其作用,以期阐明炎症过程中运动神经元受损的关键机制,从而为开发新的治疗策略提供理论依据。方法:选用生后7天的SD乳鼠腰段脊髓组织切片进行体外培养,正常培养1周后,分别给予单纯培养液、LPS (30μg/ml)、NADPH氧化酶抑制剂apocynin (0.5、1 mmol/L)加LPS (30μg/ml),干预2周后,用SMI-32免疫组化染色对运动神经元进行鉴定、计数。利用RT-PCR、Western blot等方法,检测NADPH氧化酶亚基gp91phox和p47phox mRNA水平、蛋白含量的变化,并测定各组脊髓薄片组织中脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量和培养液中LDH含量。结果:⑴30、60μg/ml LPS处理3天后,gp91phox mRNA表达水平呈增高趋势,与对照组相比,有显着差异(P<0.05);30μg/ml LPS处理2周后,gp91phox mRNA水平较对照组明显增高(P<0.01);p47phox在各时间点不同处理组间基因转录水平无显着变化(P>0.05)。⑵30μg/ml LPS组,胞膜蛋白p47phox含量较对照组明显增加(P<0.01);0.5、1 mmol/L apocynin和30μg/ml LPS同时干预组,胞膜蛋白p47phox含量与LPS组相比明显减少(P<0.01)。⑶同时应用0.5、1 mmol/L apocynin和LPS组,运动神经元数量较LPS组明显增加(P<0.01),胞体形态良好,突起较丰富。⑷30μg/ml LPS处理2周后培养液中LDH含量较对照组明显升高(P<0.05),0.5、1 mmol/L apocynin和LPS同时干预组,LDH含量较LPS组明显降低(P<0.05)。⑸30μg/ml LPS处理2周后培养脊髓薄片组织中MDA含量较对照组明显增高(P<0.01),0.5、1 mmol/L apocynin和LPS同时干预组,MDA含量较LPS组明显降低(P<0.05, P<0.01)。结论:器官型脊髓培养组织经LPS处理后,胞膜中p47phox含量明显增加,NADPH氧化酶活性增高。给予apocynin干预,可以抑制p47phox亚基从胞浆转位到胞膜,从而抑制NADPH氧化酶激活,进而产生保护运动神经元的作用,培养液中LDH含量和脊髓薄片组织中MDA含量也较LPS组明显下降,从不同角度证实了apocynin的有益作用。本研究证实了NADPH氧化酶在LPS诱导的炎症反应介导的运动神经元损伤中发挥着关键作用,为ALS的治疗提供新策略。叁、一氧化氮在脂多糖诱导的脊髓前角运动神经元损伤中的作用目的:在脊髓器官型培养模型的基础上,观察LPS干预后iNOS和nNOS的表达情况、酶活力变化以及NO水平的改变,并应用NOS相应的选择性或非选择性抑制剂,探讨NO在炎症介导的运动神经元损伤中的确切作用。方法:选用生后7天的SD乳鼠腰段脊髓组织切片进行体外培养,正常培养1周后,分别给予单纯培养液、LPS (30或60μg/ml),处理3天或2周后,收集脊髓薄片组织,检测各组NOS mRNA水平和酶活性改变;并留取处理3天、1周、2周后培养液,测定NO含量变化。药物干预实验时LPS浓度选用30μg/ml,分为以下几组:对照组、LPS组、iNOS选择性抑制剂1400W或AG加LPS组、nNOS选择性抑制剂7-NI加LPS组、NOS非选择性抑制剂L-NAME加LPS组,测定干预后3天、1周、2周后培养液中NO含量,并应用SMI-32免疫组化染色对运动神经元进行鉴定、计数。结果:⑴30、60μg/ml LPS处理3天后,iNOS mRNA表达较对照组明显增强(P<0.01),nNOS mRNA水平与对照组相比无明显变化(P>0.05);30μg/ml LPS处理2周后,iNOS mRNA水平较对照组增加,差异有显着性(P<0.01),nNOS mRNA水平与对照组相比无显着差异(P>0.05)。⑵30μg/ml LPS处理3天后,总NOS、iNOS、nNOS酶活性均明显升高,与对照组相比差异有显着性(P<0.01);处理2周后,总NOS活力较对照组明显升高(P<0.05)。⑶正常对照组各时点培养液中NO含量很低,30μg/ml LPS处理3天或1周后,NO含量较对照组明显增高(P<0.01),2周后NO含量与前相比有所降低,但仍高于对照组,差异有显着性(P<0.01)。⑷1400W或AG干预后,可明显抑制LPS引起的NO水平增高(P<0.01),然而运动神经元数量与LPS组相比并无显着性差异(P>0.05)。⑸7-NI干预后培养液中NO含量较LPS组下降,差异有显着性(P<0.01),但两组间运动神经元数量并无明显差异(P>0.05)。⑹L-NAME干预后,可明显抑制LPS引起的NO水平增高(P<0.01),但运动神经元数量与LPS组相比并无显着性差异(P>0.05)。结论:LPS在脊髓器官型培养体系中可以诱导iNOS mRNA水平和酶活力升高、nNOS活性增加以及NO生成增多,但应用iNOS抑制剂1400W和AG、nNOS抑制剂7-NI、NOS非选择性抑制剂L-NAME均未证实NO在该培养体系中对介导运动神经元损伤具有关键作用,单纯抑制NO生成并不能明显改善运动神经元的存活。鉴于NO来源于叁种不同的NOS及其自身作用的双重性,在疾病的不同阶段调控不同来源NO的生成量比单纯抑制NO生成将可能具有更好的治疗应用前景。
朱晓瓞, 岳茂兴, 郝冬琳, 叶笑寒, 徐君晨[10]2019年在《肌萎缩侧索硬化症临床诊疗新进展》文中指出运动神经元病(motor neuron disease,MND)是一组病因尚不明确,与上、下运动神经元(upper/lower motor neuron,U/LMN)选择性损伤相关的慢性进行性神经退行性疾病~([1]),主要累及脊髓前角细胞、脑干运动神经核和锥体束~([2])。主要疾病类型包括有肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)、进行性肌萎缩(progressive muscular atrophy,PMA)、进行性延髓麻痹(progressive bulbar palsy,PBP)、原发性侧索硬化(primary lateral sclerosis,PLS)~([3])。其特征在于
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[10]. 肌萎缩侧索硬化症临床诊疗新进展[J]. 朱晓瓞, 岳茂兴, 郝冬琳, 叶笑寒, 徐君晨. 中华卫生应急电子杂志. 2019