4种不同拭子释放人细胞DNA效果的研究论文

4种不同拭子释放人细胞DNA效果的研究

高林林，周志全，李佑英

（杭州市公安局刑事科学技术研究所，杭州 310000）

摘要: 目的比较4种不同拭子上附着的细胞释放DNA的效果。方法在4N6FLOQSwabs^TM植绒拭子、生物检材采集与保存套管、生物物证提取专用棉签拭子以及普通医用棉签拭子上分别滴加5µL全血，制备成原始有核细胞含量基本一致的拭子各40份，将上述拭子根据保存时间不同分为A组（室温1d，4×20根）与B组（室温30d，4×20根），采用改良硅珠法提取DNA后应用定量PCR仪检测所提取的模板DNA量，最后用SPSS统计学软件对数据进行分析。结果 4N6FLOQSwabs^TM植绒拭子所释放的模板DNA量最高，可提高后续DNA检验的成功率；放置30d后虽然模板DNA量有所下降，但所释放的DNA量仍优于其他3种拭子。结论在法医实际案件检验中，尤其对载体上极微量人体细胞的收集应优先选择植绒拭子进行收集及保存，并尽快检验。

关键词: 法医物证学；拭子；DNA释放能力

两步擦拭法常用于采集犯罪现场发现的血痕、精斑以及人体脱落细胞等生物样本。附着在不同拭子上的人体细胞释放DNA的量有无差异，拭子上附着的人体细胞DNA保存的时效性如何，未见有详细报道。为进一步研究现场生物检材采集中常用的拭子释放模板DNA的效率，本文以5 µL全血为研究对象，选取DNA实验室常用的4N6FLOQSwabs^TM植绒拭子、生物检材采集与保存套管、生物物证提取专用棉签拭子以及普通医用棉签等共4种不同拭子，制备成人体有核细胞数量基本一致的血痕拭子，应用同一种提取方法提取DNA模板，采用定量分析法比较不同拭子所释放出的模板DNA量，并比较同一种血痕拭子随保存时间的延长释放的DNA量有无明显下降。

1 材料与方法

1.1 主要仪器及试剂

4N6FLOQSwabs^TM植绒拭子（LT，美国），生物检材采集与保存套管（广州浩源实验器材有限公司），生物物证专用棉签拭子（公安部物证鉴定中心），普通医用棉签拭子（宁波华成药棉有限公司）。

7500荧光定量仪（LT，美国），恒温混匀仪（Eppendorf，德国），Quantifiler^® Trio PCR Reagents（LT，美国），Lysis Buffer（Promega，美国），15% 硅珠悬液，Elution Buffer（Promega，美国）。

1.2 血痕拭子制备

1.2.1 实验样本的编号与分组

踝关节是人体的负重关节之一，易发生踝关节骨折脱位，外伤后应立即与积极的治疗，以重建关节的正常解剖结构，恢复关节功能，获得一个良好的无痛的踝关节[1] 。踝关节骨折脱位的治疗以手术为主，但手术的时机，目前尚无统一的标准和定论[2] 。本研究即通过回顾性分析，比较踝关节骨折脱位实施急诊手术和择期手术的效果，现报道如下。

所以l1(t)≥0，对于t≥0，0≤u≤t，Y服从指数分布，则又h(1-α)≤1，显然e-λ(t-u+h(1-α)u)为增函数，因此l2(t)≥0，即

准备4N6FLOQSwabs^TM植绒拭子（尖头带套管）、生物检材采集与保存套管、生物物证提取专用棉签拭子以及普通医用棉签拭子各40根。每种拭子均分为A组与B组（各20根）。A组编号规则为4N6FLOQSwabs^TM植绒拭子（尖头带套管）编为A1-1至A1-20号，生物检材采集与保存套管编为A2-1至A2-20号，生物物证提取专用棉签拭子编为A3-1至A3-20号，普通医用棉签拭子编为A4-1至A4-20号；同样规则对B组编号。

1.3.1 样本的DNA 提取

1.3.2 样本的DNA 定量

A组样本中4种不同的拭子释放血痕DNA的结果见表1。4N6FLOQSwabs^TM拭子得到的DNA含量最高，均值为（2.253±0.775）ng/μL。其他3种拭子所获得的DNA含量相差不大，与4N6FLOQSwabs^TM拭子相比，均具有统计学差异（P ＜0.05）。

1.3 方法

1.2.2 实验样本的制备

样本置于1.5 mL离心管内，加入Lysis Buffer裂解液400 µL，95 ℃裂解30 min，离心，将上清液转移至另一干净离心管内，加入15%硅珠悬液40 µL后置于恒温混匀仪（25 ℃，900 r/min）上放置30 min，70%冷乙醇洗涤2次后挥干残余乙醇，之后加入Elution Buffer洗脱液30 µL在56 ℃洗脱10 min，离心取上清液备用。

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图2表示的是β-葡聚糖酶与葡萄糖之间的相关关系，从图2中可以看出，随着β-葡聚糖酶添加量的增加，酶解液中葡萄糖的含量先提高后降低，当β-葡聚糖酶添加量为0.005 mg/g时，葡萄糖含量最高，因此β-葡聚糖酶的最适添加量为0.005 mg/g。

1.4 统计学分析

采用SPSS 19.0软件，应用方差分析对不同种类拭子间数据进行统计学处理，同种拭子组间比较用配对t 检验，数据应用s 表示，检验水准α=0.05。

采用 Quantifiler^® Trio PCR Reagents试剂盒在7500荧光定量仪上对DNA模板进行定量。体系为20 µL，其中 Mix 10 µL、Primer 8 µL、DNA 模板2 µL。荧光定量程序按照 Quantifiler^® Trio PCR Reagents试剂盒推荐的程序进行。

2 结果

2.1 A组样本检验结果定量比较

采集20名志愿者的静脉血制成EDTA抗凝血，标记为个体1号至个体20号。在A1-1号拭子、A2-1号拭子、A3-1号拭子、A4-1号拭子、B1-1号拭子、B2-1号拭子、B3-1号拭子及B4-1号拭子的头部各滴1号个体全血5 µL，以此类推，共制备血痕拭子160份。将生物物证提取专用棉签血痕拭子以及普通医用棉签血痕拭子均封装于纸质物证袋内，另外2种血痕拭子用拭子自带的套管密封封装。制备好的A组样本在室温（25 ℃左右）放置1 d后进行DNA提取；制备好的B组样本在室温（25 ℃左右）放置30 d后进行DNA提取。

1.2 领导层自身思想政治觉悟并不高。很多国有企业领导层，特别是中层、基层领导大部分都是从基层晋升而来，往往对技术的熟知度，远远对思想政治工作熟悉的多，不少领导层甚至对开展思想政治教育工作认为是无聊之举，颇有微词，觉得是浪费他们为企业谋福利的时间，这是严重的思想政治偏离正轨的表现，思想政治不过硬的领导层，需要及时进行教育辅导、惩戒、对屡次不改者可以撤销相关职务，以彰显思想政治教育的权威性和重要性。

表1 A组样本中4种不同拭子DNA定量结果比较（n =20，

2.2 B组样本检验结果定量比较

制备好的拭子在室温放置30d后B组所有样本的DNA含量均有下降，但普通医用棉签拭子的DNA含量最低，其均值只有（0.812±0.366） ng/µL，差异具有统计学意义（表2）。生物检材采集与保存套管和生物物证提取专用棉签拭子所提取的DNA含量居中，二者之间未表现出统计学差异。

表2 B组样本中4种不同拭子DNA定量结果比较（n =20，

2.3 两组中同一种拭子检验结果定量比较

4N6FLOQSwabs^TM植绒拭子（尖头）、生物检材采集与保存套管、生物物证提取专用棉签拭子以及普通医用棉签拭子中的每一种拭子均随存放时间的延长而呈现DNA含量的下降，B组样本与A组样本相比，其DNA含量的下降具有统计学差异（表3）。

表3 同种拭子2次检验DNA定量结果比较（n =20，

3 讨论

传统的棉签拭子采用两步擦拭法,在刑事案件现场生物检材提取中占据重要地位。有研究发现采用尼龙植绒阴道拭子能够提高强奸案中精子DNA的检出成功率^[1]，也有报道4N6FLOQSwabs^TM植绒拭子对脱落细胞的提取效果优于复合纳米棉签拭子^[2]。不同品牌及不同材质制成的拭子对微量生物检材的提取效率成为DNA工作者关注的热点问题。

本研究显示，生物检材采集与保存套管、生物物证提取专用棉签拭子以及普通医用棉签，这3种拭子释放的DNA量基本持平，而由4N6FLOQSwabs^TM植绒拭子（尖头带套管）所获得的模板DNA量显著提高。产生这些差异的主要原因可能是4N6FLOQSwabs^TM植绒拭子为尼龙短纤维，以垂直方式喷涂覆盖固定于拭子尖端，因而血痕可紧贴于拭子的短纤维表面上，在裂解过程中细胞就能够更充分完全地被裂解液浸润裂解，细胞内的DNA可最大化地被释放出来，从而显著提高了模板DNA的量，而其他3种拭子均为棉纤维，是相互缠绕形成的纤维团，故细胞易被包裹于纤维团内部，在裂解过程中这些相互缠绕的棉纤维就会阻碍其内部所吸附细胞DNA的有效释放。检验结果提示随着保存时间的延长，拭子上附着的人体细胞释放模板DNA的得率都显著下降。在4种不同的拭子中，生物检材采集与保存套管拭子上的DNA含量下降幅度最小，普通医用棉签拭子上的DNA含量下降最大，仅余（0.812±0.366） ng/µL。4N6FLOQSwabs^TM植绒拭子（尖头）在B组拭子中仍表现为DNA含量最高，但是其DNA量下降的幅度也不可忽视。上述结果表明在现场提取生物检材后及时进行检验可提高DNA的检出率。上述现象或有以下原因:1)生物检材采集与保存套管内含变色硅胶和干燥片2种干燥剂^[3]，其将湿润的血痕拭子晾干所用的时间较短，故可有效防止生物检材的腐败降解；而普通医用棉签拭子仅被置于普通的纸质物证袋内，且由于其松散的纤维结构易受外界环境的影响。2)血痕拭子放置30 d后，红细胞与其他有核细胞在棉纤维或尼龙纤维上粘附的更加牢固，从纤维上释放的细胞数量就有所下降，从而导致获得的DNA模板量下降。3)生物物证提取专用棉签拭子与普通医用棉签拭子表面与物证封装袋内部会直接接触，长时间放置后，棉签拭子与物证袋表面粘附，棉签表面的细胞二次转移而造成了拭子上附着细胞的损失。4N6FLOQSwabs^TM植绒拭子（尖头）在拭子头部与杆部有一折痕，不需要剪刀或镊子就能轻松地使拭子头部脱落于离心管内，而且尖头的植绒拭子头部设计也能够减少裂解液的使用量。生物检材采集与保存套管虽然拭子头部悬空于套管内，但需要借助于剪刀将拭子头部棉纤维表面剪取到离心管内，其操作步骤略显繁琐。生物物证提取专用棉签拭子与普通医用棉签拭子也需要剪取棉签表面，而若剪刀清洗或消毒不干净，则还有可能造成检材间的交叉污染。虽然有研究表明不管是植绒拭子还是棉签拭子，都需要采用适当的提取方法^[4]来提高检出率,但本文采用对微量及疑难生物检材提取都具有优势的硅珠法^[5-7]进行DNA提取，也仍发现在原始细胞数量基本一致的状态下，4N6FLOQSwabs^TM植绒拭子上附着的人体细胞释放的模板DNA得率最高，故其在微量生物检材的检验中可显著提高成功率。对于其它3种拭子，宜根据现场生物检材情况灵活选用（性价比，方便性等原则）。此外，为获得最好的检出效果，应重视检验的时效性。

参考文献

［1］ BENSCHOP C C, WIEBOSCH D C, KLOOSTERMAN A D, et al. Post-coital vaginal sampling with nylon flocked swabs improves DNA typing［J］. Forensic Science International Genetics,2010, 4(2): 115-121.

［2］徐海军，叶志鹏，徐姚力，等. 植绒和棉签拭子对不同载体微量生物物证的提取研究［J］.刑事技术，2015, 40(5): 373-375.

［3］杨电，刘超，李越，等. 生物检材采集与保存套管的应用［J］.中国法医学杂志，2014, 29(4): 352-354.

［4］ BROWNLOW R J, DAGNALL K E, AMES C E. A comparison of DNA collection and retrieval from two swab types(cotton and nylon flocked swab) when processed using three QIAGEN extraction methods［J］. Journal of Forensic Sciences,2012,57(3): 713-717.

［5］高林林，李佑英，叶家喜，等. 触摸检材DNA的STR检验［J］.刑事技术 , 2009(3): 56-57.

［6］贾东涛，韩海军，张玉红，等. 陈旧骨骼 DNA提取方法的应用研究［J］.中国法医学杂志，2007, 22(4): 260-261．

［7］姚建，贾东涛，张玉红，等. 检材量对硅珠法提取脱落细胞DNA 的影响［J］.中国法医学杂志，2009, 24(5): 333-334.

Effect of Four Different Swabs on DNA Release from the Adhered-toswab Human Cells

GAO Linlin, ZHOU Zhiquan, LI Youying
(Institute of Criminal Science and Technology of Hangzhou Public Security Bureau, Hangzhou 310000, China)

ABSTRACT: Objective To compare the effect of four different swabs on releasing DNA from the adhered-to-swab human cells.Methods 5µL evenly-dispersed whole blood was respectively dropped onto 4N6FLOQSwabs^TM flocking swabs(40 pieces), biological sample collecting-and-preserving casings (40 ones), forensic cotton swabs (40 ones) and common medical cotton swabs (40 ones). All the swabs were divided into group A (placing at room temperature for 1 day, 4×20 pieces) and group B (placing at room temperature for 30 days, 4×20 pieces). The template DNA was extracted with the modified silica bead method, and followed to undergo the quantitative PCR to test the amount of extracted DNA, with thefinal data being analyzed by SPSS statistical software. Results The maximal amount of template DNA was released from the 4N6FLOQSwabs^TM flocking swabs, having the success rate of subsequent DNA test improved. Even after 30 days, the amount of DNA released by the 4N6FLOQSwabs^TM flocking swab, albeit declining, remained higher than the other three handling different swabs. Conclusion For the actual forensic cases, the priority should be given to the 4N6FLOQSwabs^TM flocking swab for sample collection and preservation, especially the tiny quantity of human cells. Additionally, the collected samples ought to be tested as early as possible.

KEY WORDS: forensic evidential material; swab; DNA releasing ability

中图分类号: DF795.2

文献标识码: A

文章编号: 1008-3650(2019)05-0460-03

第一作者简介: 高林林，女，山西吕梁人，硕士，副主任法医师，研究方向为法医DNA检验。E-mail:myhappyfamily_gao@163.com

DOI: 10.16467/j.1008-3650.2019.05.019

收稿日期: 2017-03-16；修回日期:2017-08-02

引用本文格式:高林林，周志全，李佑英. 4种不同拭子释放人细胞DNA效果的研究[J]. 刑事技术，2019,44(5):460-462.

标签：法医物证学论文; 拭子论文; DNA释放能力论文; 杭州市公安局刑事科学技术研究所论文;