李莉[1]2003年在《玉米种子传播甘蔗花叶病毒的研究》文中指出玉米矮花叶病(Haize dwarf mosaic disease)是世界上分布最广，危害最重的玉米病毒病害之一，20世纪90年代以来在我国主要玉米产区连年暴发成灾，已成为生产上急待解决的问题之一，其流行的一个重要原因是种于带毒传播。 本研究通过对提纯病毒的特性研究、CP基因序列的测定及同源性比较确定我们所得到的玉米矮花叶病分离物是甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus，SCMV)。在此基础上，制备了SCMV的特异性多克隆抗血清和地高辛(Digoxigonin，DIG)标记的全长CP基因探针，为快速、准确检测病毒打下了良好的基础。 采用生物学、遗传学、免疫学、电子显微镜观察，组织培养、分子生物学、组织免疫化学和核酸原位杂交组织化学等方法和技术，针对影响种子传毒的因素、病毒在种子上的分布、进入种胚的途径和时期、以及病毒在子房和种子内的定位等方面对玉米自交系Mo17和7922种子传播甘蔗花叶病毒(SCMV)的规律进行了研究，主要结论是： (1)SCMV侵染雌株的时期与种子传毒效率的关系：母株受侵染的时期对种子传播SCMV的效率有显着的影响作用，以7、8叶期侵染植株的种子传毒率最高，(分别为13.88％和11.07％)，14、13叶期次之(分别是9.28％和6.69％)，而在9叶期侵染产生的种子传毒率最低(0.63％)，可能的原因是SCMV侵染母株，影响了母株的生理状态、改变了寄主生长发育与病毒复制、传播间的某种平衡而导致种子传播病毒能力上的差异；另外不同发育阶段的环境温度也是不可忽略的因素之一。 (2)传毒种子在雌穗上的分布：通过对自交系Mo17种子大小与传毒关系的研究发现种子越大传毒率越高。对传毒种子在雌穗上的分布研究表明玉米雌穗各部分均可产生带毒种子，以中部的传毒率最高，为5.7％，其次是中下部，为5.2％，中上部和基部差异不明显，尖部最低，仅为2.6％。一般来说在雌穗中部、中下部籽粒最大，基部和中上部次之，尖部最小，这两个结果正好吻合。 (3)SCMV在玉米种子上的分布：明确SCMV分布在玉米的种皮、胚乳的糊粉层和胚内，在胚乳的淀粉层内未检测到病毒，但只有糊粉层和胚携带侵染性病毒，可能与种子传毒有关，证明玉米Mo17品种成熟种子的胚携带并传播甘蔗花叶病毒。 (4)SCMV进入种胚的途径：通过对花粉带毒与传毒的研究和病、健株间的杂交试验，明确了病毒既可通过花粉带毒传播，也可由雌株直接进入种胚，但传毒效率上的差异表明病毒进入种胚的主要途径是由雌株直接进入。 (5)SCMV进入种胚的时间：通过对授粉前雌穗带毒部位和不同发育阶段种子的带毒研究，发现病毒在种子发育的较早时期进入种子，Mo17品种在授粉后5天以前，7922品种稍晚，在5-10天间进入。胚的离体培养结果表明病毒在授粉后13-15天以前进入胚。 (6)SCMV在子房和种子内的定位：组织免疫化学标记和核酸原位杂交组织化学技术的定位研究发现：病毒存在于子房壁和近珠孔端的维管束组织中，未发现胚珠，大孢子母细胞等生殖细胞携带SCMV。病毒在子房壁内向花粉管伸长方向的相反一侧运输，但也发现一个子房样品内的SCMV并非只向一边扩散，而是有两边扩散的趋势，推测此现象可能与种子传毒有关。 授粉后13、15和30天的种皮、15天的部分上皮细胞携带SCMV，13天和30天胚组织中没有检测到病毒，但幸运的在一粒15天种子的胚组织中检测到病毒信号，从另一个方面证明玉米胚携带SCMV。
饶黎霞[2]2016年在《黄瓜绿斑驳花叶病毒与甘蔗花叶病毒基因组测序及种群遗传结构分析》文中进行了进一步梳理黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus, CGMMV)和甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus, SCMV)是农作物上的两种重要病毒,其分布范围广,危害重,给我国农业生产的发展造成了严重威胁。本论文主要围绕CGMMV 和 SCMV两个病毒的基因组测序及种群遗传结构分析、SCMV单克隆抗体制备及其应用等开展相关研究,取得如下研究结果：1、7个CGMMV浙江分离物基因组测序及种群遗传结构分析利用以CGMMV单抗为核心建立的dot-ELISA方法对采自浙江省不同地方的762份葫芦科作物、4批葫芦科作物种子及60份杂草样品进行CGMMV普查。结果显示,葫芦植株及其种子、西瓜植株及其嫁接苗、甜瓜植株等样品中均检测到CGMMV。另外,在田间杂草碎米芥和空心莲子草中检测到CGMMV的存在,这是CGMMV感染杂草的首次报道。根据CGMMV在浙江省的地理分布及不同作物上的发生情况,从中选取感染CGMMV的4株西瓜植株、2株西瓜嫁接苗和1株甜瓜植株样品进行病毒全基因组克隆和测序,获得了7个CGMMV浙江分离物全基因组序列。测序结果表明,CGMMV台州西瓜分离物和建德西瓜分离物的全基因组序列长度分别为6425 bp和6423 bp,2个东阳西瓜分离物全基因组序列长度分别为6423 bp和6425 bp,萧山西瓜嫁接苗和东阳西瓜嫁接苗分离物全基因组序列长度分别为6423 bp和6424 bp,CGMMV建德甜瓜分离物全基因组序列长度为6423 bp。同源性分析发现这7个分离物全基因组核苷酸同源性在99.2～100%之间。结合GenBank登录的24个CGMMV分离物构建系统进化树。结果显示,除分离物Ec外,其它分离物根据地理来源的不同分为两组,即亚洲分离物聚在组I,欧洲分离物聚在组II,表明CGMMV的种群分化极有可能受地理分布的影响。CGMMV全基因组核苷酸序列位点变异分析发现,其各个位点的变异率均在8%以下,大多集中在2-5%之间,表明CGMMV基因组较保守、变异较少。CGMMV碱基替换突变类型分析显示,其具有转换(AHG和CHT)明显强于颠换(A←→C、A←→T、G←→C 和 G←→T)的偏好性。发生在CGMMV基因组上的大多数变异均导致了非同义突变的产生,且由于碱基替换类型的强烈偏好性,一些氨基酸位点出现了高于30%的非同义替代率。选择压分析结果显示,在复制相关蛋白186 kDa和129 kDa ORF中检测到强烈的负向选择压,这与报道的发生在其它RNA病毒中的情况类似。最后,分离物Ec的重组分析发现,在多个重组检测中分离物Ec作为重组体的可信度均较低。2、SCMV云南分离物的基因组测序及种群遗传结构分析利用RT-PCR的方法检测来自云南田间的1个玉米样品,发现其感染SCMV。随后进行该分离物(命名为SCMV-YN)基因组克隆和测序,得到不含poly (A)长9 598 bp的全基因组序列。这是SCMV云南玉米分离物在全基因组序列上的首次报道。基因组结构预测显示,SCMV-YN分离物的CI蛋白中典型的RNA解旋酶结构域V1215LLLEPTRPL1224突变成了V1215LLIEPTRPL1224, NIb蛋白C末端的原核脂蛋白结构域12554LAFNYTLLSC2564突变成I2554IAFNYAMLSS2564。与GenBank登录的28个SCMV分离物全基因组核苷酸序列进行同源性比对发现,SCMV-YN与河北玉米分离物SCMV-BD8的同源性远远高于其它分离物,达到95.2%,且在这些分离物中,P1变异最大,CI和PIPO相比其它ORFs保守得多。基于全基因组核苷酸序列的系统进化树显示29个SCMV分离物被分为两组,即组Ⅰ和组Ⅱ。且在两大组内部又各分为两小组,分别为组Ⅰ A (Maize)、组Ⅰ B(Maize/Sugarcane)和组ⅡA (Maize/Sugarcane)、组ⅡB (Sugarcane)。且地理分布对分离物亲缘关系的影响有所弱化,寄主来源对分离物亲缘关系的影响依然存在。SCMV全基因组核苷酸位点变异分析发现,其各个位点变异程度存在明显波动,大多集中在15～20%之间,表明SCMV基因组存在高变异率。SCMV碱基替换突变类型与报道的其它RNA病毒类似,呈现转换(AHG和CHT)明显强于颠换(A←→C、A←→T、G←→C和G←→T)的偏好性。遗传差异及基因流分析显示,组I和组11分离物在所有ORFs中均存在显着的遗传差异；同时在P3、NIa-VPg、NIa-Pro 和 NIb-replicase等ORFs中检测到频繁的基因流。选择压分析显示,SCMV分离物编码的所有ORFs均处于负向(净化)选择压下,且CI ORF受到的负向选择压最大。重组分析显示,29个SCMV分离物中7个分离物检测到明显重组。且对这7个分离物的重组区域进行分析发现,除P3 ORF外,其它区域均检测到了重组。3、SCMV-YN分离物单抗的制备及其应用用提纯的SCMV-YN病毒粒子免疫BALB/c小鼠,经细胞融合、筛选与克隆成功获得9株能分泌SCMV单抗的杂交瘤细胞株(6A1、6A12、10B11、12A10、15C12、19F3、21C12、21H3和22A2),并制备单抗腹水。9株单抗腹水的间接ELISA效价在10-6-10-7之间,抗体类型及亚类均为IgG1、kappa轻链。Western blot分析发现,6A1、21H3和22A2这3个单抗对SCMV-YN和SCMV北京分离物均具有免疫反应,说明它识别的是这两个分离物外壳蛋白亚基的共同抗原决定簇；而10B11、12A10、15C12、19F3和21C12这5个单抗仅对SCMV-YN分离物具有免疫反应,说明它识别的是SCMV-YN分离物外壳蛋白亚基的特异性抗原决定簇。6A12单抗在Western blot时不识别SCMV外壳蛋白等病毒结构蛋白,结合其dot-ELISA结果推测该单抗识别的是针对构象型的抗原决定簇。以制备的单抗为核心建立dot-ELISA检测方法,并对其特性进行分析。特异性分析显示,6A1、21H3和22A2这3个单抗及以其为核心建立的dot-ELISA方法在检测SCMV-YN和北京分离物时均呈阳性反应；而6A12、10B11、12A10、15C12、19F3和21C12这6个单抗及以其为核心建立的dot-ELISA方法在检测SCMV-YN和北京分离物时,仅对SCMV-YN分离物呈阳性反应,这说明其可用于SCMV-YN分离物的株系鉴定和检测。dot-ELISA方法分析单抗灵敏度显示,6A1、15C12、10B11和21H3单抗对病叶的检测灵敏度均达到1：10 240倍稀释(w/v,g/mL),12A10和19F3单抗的检测灵敏度均达到1：5 120倍稀释(w/v,g/mL),21C12和22A2单抗的检测灵敏度均达到1：2 560倍稀释(w/v,g/mL),而6A12单抗的检测灵敏度也到达1：1 280倍稀释(w/v,g/mL)。
李莉, 王锡锋, 周广和[3]2003年在《玉米种子传播甘蔗花叶病毒的研究简报》文中进行了进一步梳理甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus,SCMV)侵染玉米引起的矮花叶病(Maize dwarf mosaic)是重要植物种传病毒病害,20世纪90年代以来在我国北方玉米产区(尤其是制种田)连年流行成灾,其中一个很重要原因是种子带毒传播。有报道显示,近年来种子传毒率呈现不断的上升趋势(王海广,马占鸿,2003)。我们于2000～2003年对SCMV在高感自交系Mo17和7922上的种子传毒规律进行了研究,目的在于为抗病育种和制种基地生产无毒、低毒种子提供理论依据,以便控制玉米矮花叶病的流行危害。
甘德芳[4]2011年在《RNAi调控玉米抗甘蔗花叶病毒和粗缩病毒的研究》文中提出玉米是重要的粮食、饲料与工业原料作物。目前我国玉米的种植面积呈逐年增加的趋势,但玉米病害尤其是玉米的矮花叶病和粗缩病成了限制我国玉米生产发展的巨大障碍,造成玉米的大量减产和品质下降。利用基因工程技术培育推广抗病品种和寻找新方法已成为病毒病防治的迫切需求。RNA干涉作为一种特异、高效的反向遗传学手段,在植物的抗病毒育种中表现出了巨大的优势,成为植物抗病毒基因工程的热点。为进一步筛选和建立病毒cp基因dsRNA的原核表达体系和遗传转化体系,探讨RNAi技术在玉米抗病毒基因工程中的应用效果,建立玉米RNAi的分子育种新方法。本文利用大肠杆菌HT115高效表达甘蔗花叶病毒cp基因dsRNA,较系统地研究了外源dsRNA抗甘蔗花叶病毒RNAi调控技术；构建了兼抗甘蔗花叶病毒及粗缩病毒cp基因的RNAi复合表达载体,开展农杆菌介导的玉米原位转化,并对转化株进行了分子确证,在此基础上对转化株RNAi效果和抗病性进行了分析,获得了如下主要结果：1、根据甘蔗花叶病毒cp基因序列设计特异性引物,RT-PCR扩增甘蔗花叶病毒cp基因特异性干涉片段,构建cp基因反向重复原核表达载体LMCP。利用IPTG进行诱导表达并对诱导表达条件进行优化。结果表明,经过IPTG诱导,LMCP在大肠杆菌HT115(DE3)菌株中可表达产生预期大小的片段,经DNase I和RNase A消化处理,证实为dsRNA。同时IPTG浓度为0.4～0.6mmol/L,诱导表达4h,dsRNA的表达量最高。2、利用大肠杆菌表达的dsRNA提取液处理玉米8112植株,并对处理参数进行了优化,结果表明当dsRNA稀释1/5浓度以下时处理效果明显；dsRNA喷洒后3d内接种病毒,抗病毒侵染效果最好；另外,加入适宜浓度的渗透剂能提高dsRNA的抗病效果。3、RT-PCR分别扩增甘蔗花叶病毒和粗缩病毒外壳蛋白基因特异性RNA干扰片段,分别构建成反向重复序列并串联在一起,再与抗除草剂bar基因分别插入到pDTBU的两个T-DNA区段,构建了兼抗甘蔗花叶病毒和粗缩病毒的RNA干涉复合表达载体pDTBU SM。并通过冻融法将该载体直接导入农杆菌,获得了经PCR鉴定的转化子,用于农杆菌介导的玉米原位转化。4、利用农杆菌介导的原位转化技术将cp基因RNA干涉表达载体pDTBU SM转入玉米8112自交系,对T0代植株进行除草剂Basta筛选,结合PCR扩增筛选得到19株共转化植株,对T1代共转化株系进行PCR检测及Southern杂交分析,证明有3个株系发生了分离,且获得了整合有cp基因RNAi片段的转化株。5、提取T1代不同转化株的叶片总RNA以及开花期不同器官的RNA,经反转录反应后,进行荧光定量检测cp基因在不同转基因植株以及在同一转基因植株不同器官中的表达量,结果表明转化的cp基因干涉片段在不同转基因植株中的表达量不同。目的基因在雄花和叶中的表达量最高,而在根中的表达量最低。6、T2代转基因玉米植株4叶期时接种甘蔗花叶病毒,并于接毒后不同时间提取叶片总RNA,荧光定量检测外源病毒诱导对内源cp基因表达的影响,结果表明转化的cp基因干涉片段对甘蔗花叶病毒产生了干涉效应,转入的cp基因RNAi片段在转基因植株中能正确转录,并导致cp基因:mRNA含量的交替变化。7、对T2代4叶期转基因玉米接种甘蔗花叶病毒,于接毒后14d、21d、30d取叶片,ELISA检测植株的发病情况,结果表明,不同转化株株系的感病情况有差异,但抗病性均不同程度地高于对照。综上所述,本文利用细菌高效表达的dsRNA处理玉米8112自交系,通过对处理植株的发病情况进行研究,筛选并建立了外源dsRNA的干扰调控技术体系；成功构建了兼抗两种病毒的无选择标记RNAi复合表达载体,利用农杆菌介导的玉米原位转化技术,获得了整合cp基因的RNAi转化株,其RNAi效果显着,转化植株的抗病性得到了提高。其研究结果对建立RNA干扰调控技术体系在玉米抗病毒基因工程中的应用,开辟玉米抗病毒育种的新方法具有重要意义。
周丰静[5]2015年在《甘蔗花叶病的分子检测及病样生理生化变化》文中提出本研究对甘蔗花叶病在广西蔗区的发生情况进行系统调查,明确引起广西蔗区甘蔗花叶病的病原,并收集不同组合的甘蔗杂交种子,研究甘蔗种子对病毒病的传播性,为甘蔗资源的培育提供科学依据。选择广西蔗区甘蔗花叶病的主要致病原用于研究不同抗性的甘蔗品种受到花叶病胁迫后的生理生化变化；以甘蔗品种粤糖93-159、ROC22和桂糖29为材料,对其进行针刺接种,RT-PCR检测确定侵染成功后,再对甘蔗叶片的相关生理生化指标进行测定。主要研究结果如下：1.对广西蔗区甘蔗花叶病的发生情况进行系统调查,在收集的48份样品中检测出SrMV阳性33份,SCMV阳性2份,SCMV和SrMV复合侵染1份,未检测到MDMV和JGMV。花叶病的发病率为75.0%,主要致病原为SrMV。另外,有显症样品未能检测出致病原,说明广西蔗区可能存在其他病毒。2.在10份杂交种子中没有检测到SCMV和SCYLV,仅有1份样本显示为SrMV阳性,而在实生苗中均未检测到阳性植株。表明甘蔗种子可携带高粱花叶病毒(SrMV),但未能通过种子传播至实生苗。3.甘蔗受SrMV胁迫后,染病蔗株的株高、茎径、锤度和叶绿素含量都比健康对照的低,前叁个指标与对照相比差异不显着。接种45d后,桂糖29和ROC22的叶绿素含量显着高于对照,抗病品种ROC22和桂糖29的这4个指标比感病品种粤糖93-159的要高,但差异不明显。叶绿素含量在染病植株低于健康对照的前提下呈现出波动上升的过程,说明在感病后的较长一段时间内叶绿体存在一个遭到破坏到逐渐恢复的过程。感染花叶病后早期一段时间内,感病材料粤糖93-159的可溶性糖含量急剧降低,抗病材料ROC22和桂糖29则出现上升的现象,其中高抗品种桂糖29的上升幅度最大,可溶性糖含量可以在感病20d之内作为评价不同甘蔗品种抗病性的一个指标。感染SrMV后植株的可溶性蛋白含量比健康对照的低,感病品种粤糖93-159的可溶性蛋白含量在对照和染病蔗株中均高于抗病品种,说明可溶性蛋白含量与品种抗性呈负相关。接种SrMV后3个抗感品种中,感病材料粤糖93-159的SOD和POD活性下降幅度最大,抗病品种ROC22和桂糖29的SOD和POD活性提高：受到SrMV胁迫后,MDA含量上升,抗病甘蔗MDA含量上升早而且快,回落的也快；而感病品种一开始下降之后保持较长时间的上升状态,结合我们测定的SOD、POD活性的变化,可以认为抗病品种较感病品种更能快速的感受到SrMV的侵害并启动相应的防御系统,减少膜脂氧化,抵御病毒胁迫；感染高粱花叶病毒后不同抗性的甘蔗PPO和PAL活性均被激发,在感病严重时期,抗病品种PPO活性高于感病品种,感病品种在整个测试期内波动比较大；PAL的增加幅度开始时感病材料粤糖93-159高于桂糖29和ROC22,之后远低于抗病材料,说明在较长时间里,抗病品种比感病品种能够更加稳定持久的抵御SrMV。
郝兴安[6]2006年在《套袋苹果黑点病初步研究及甘蔗花叶病毒HC-pro基因克隆与蛋白原核表达》文中进行了进一步梳理甘蔗花叶病毒是马铃薯Y病毒属的成员，能够被蚜虫非持久性传播，主要危害玉米和高粱，造成严重的经济损失。甘蔗花叶病毒基因编码的HC-pro是和蚜虫传播相关的一个蛋白因子，并且和病毒自身的许多生命活动相关。本试验通过设计特异性引物，利用RT-PCR技术从陕西玉米病株上克隆了甘蔗花叶病毒中HC-pro基因，并进行了原核表达研究，同时提纯了甘蔗花叶病毒。 分离得到的玉米花叶病原，通过生物学，电镜等方法鉴定为甘蔗花叶病毒；提纯病毒电镜观察表明其大小为720～760×13nm，紫外扫描分析呈典型的核蛋白吸收曲线，OD280／OD260=0.69。以其为材料，接种玉米后，提取病株RNA；优化扩增体系，RT-PCR反转录扩增获得大约1.4kb左右的SCMV的HC-pro基因片断。克隆测序后得到1380bp的甘蔗花叶病毒陕西分离物HC-pro基因序列。将该基因序列登录到GenBank，登录号为DQ667961。该序列与其它株系核苷酸和氨基酸同源性分别为Shandong株系(91.7％／99.3％)、Henan株系(91.6％／99.3％)、Beijing株系(90.9％／98.7％)、Mexico株系(89.0％／98.9％)、Zhejiang株系(88.8％／98.0％)、Guangdong株系(83.3％／96.1％)、Lingpin株系(81.2％／95.4％)、Yuhang株系(81.0％／95.2％)用pET30a构建含HC-Pro的原核表达载体pETHC。转化大肠杆菌BL21诱导表达HC-pro。SDS-PAGE电泳检测表达的HC-pro蛋白大小约57kDa与预测相符合。通过一系列的梯度试验发现，在不同的预培养时间下，原核表达载体pETHC对HC-pro蛋白的表达丰度不同。 本研究提纯了SCMV，克隆了SCMV shaanxi株系HC-pro基因，并首次对SCMVHC-pro进行了原核表达，为进一步的同源性分析和蚜传专化性位点的分析，以及分离提取蚜传受体蛋白，并通过基因工程和分子生物学技术为蚜虫受体蛋白的研究打下了坚实的基础。
刘青青[7]2017年在《玉米抗甘蔗花叶病毒病主效QTL的克隆与抗病机理研究》文中研究说明玉米甘蔗花叶病毒病是由甘蔗花叶病毒(Sugarcan moraic virus,SCMV)引起的病毒病害,对全球玉米生产安全造成严重危害。长期以来对此病的化学防治效果不明显,培育及推广优良玉米抗病品种是防治此病的有效措施。遗传研究表明,玉米抗甘蔗花叶病毒病涉及两个主效QTLs(Quantitative trait loci),Scmv1和Scmv2,分别位于第6和第3号染色体上。其中Scwv1在抗病早期发挥作用,而Scmv2在抗病后期显现功效。本课题组前期利用Scmv2位点固定Scmv1位点分离的F2群体对Scwv1进行了连续的精细定位,将其限定在分子标记R1-2和IDP11之间,物理距离为 112.39kb。本论文针对玉米抗甘蔗花叶病毒病主效QTL-Scmv1,开展精细定位、抗病基因克隆、抗病基因功能分析与抗病机理等研究,主要结果如下:1.在前期定位结果的基础上,利用发展自郑58(感病)×昌7-2(抗病)和黄C(高感)×X178(高抗)的两个RILs(Recombinant inbred lines)群体对Scmv1候选区段进行验证并筛选重组RILs,将Scmv1区段缩短至分子标记579P4和SNP3之间,物理距离为59.21kb。2.利用Scmv1定位区段内的分子标记分别筛选玉米抗病自交系FAP1360A、1145和黄早四的BAC(Bacterial artificial chromosome)文库,构建覆盖Scmv1的BAC重迭群。筛选最少重迭BAC克隆进行测序与基因注释,发现3个可能参与抗病反应的基因,分别为ZmTrxh、ZmCAS和ZmSUS。结合基因表达分析,确定ZmTrxh为抗病候选基因。3.从1145 BAC克隆(ZM579B1)中亚克隆完整ZmTrxh基因片段由农杆菌介导转化受体HiII(高感),获得转基因植株(T2,T3和T1F1)转基因结果显示,ZmTrxr能显着提高玉米在早期对SCMV的抗性,两个主效位点抗病基因均存在的转基因植株对SCMV表现完全抗性。4.ZmTrxh在抗感材料中基因编码区无多态性,启动子区域距ATG上游1.184kb为保守区段,其余部分差异显着。ZmTrxh表达水平与植株抗性表现密切相关。5.ZwTrxh在成熟叶片中表达水平最高。ZwTrxh能够响应SCMV诱导表达,在接种24h后达到表达高峰。在玉米原生质体瞬时表达体系中过表达ZmTrxh,可以抑制SCMV的复制。6.ZmTrxh编码非典型的H-型硫氧还蛋白,分布于细胞质中。抗病蛋白ZmTrxh活性位点处的两个半胱氨酸被天冬酰胺和丝氨酸替代(WNPQS),但仍可正常折迭形成典型的"Trx fold"叁维结构。ZmTrxh蛋白活性位点的变化在玉米基因组中唯一存在,使其与其余典型的硫氧还蛋白相区别。蛋白活性测定表明ZmTrxh丧失氧化还原功能,但具有分子伴侣功能。7.以ZmTrxh作为诱饵蛋白筛选抗病自交系FAP1360A的酵母双杂文库,鉴定出两个互作蛋白 ZmRbcS(Maize ribulose-1,5-bisphosphatecarboxylase/oxygenase small subunit)和 ZmRbcL(Maize ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit)。在 SCMV 编码的 11 个蛋白中,P3和CP蛋白与寄主蛋白ZmRbcS和ZmRbcL互作。抗病蛋白ZmTrxh与SCMV编码的P3,CP,6K1,6K2,VPg 和 P3-PIPO 均存在互作。综合实验结果表明,ZmTrxh是玉米长期与病毒的抵抗反应中特异分化出来的抗病蛋白,编码非典型的氧化还原蛋白,利用自身分子伴侣的功能,通过保护寄主蛋白免受病毒蛋白袭击以及削弱病毒蛋白功能,从而抑制SCMV的复制,提高病毒对SCMV的抗性。
高波[8]2012年在《甘蔗花叶病毒种群遗传结构分析》文中指出甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus, SCMV)是引起中国玉米矮花叶病的主要病毒。本研究从2009年到2011年连续叁年对该病进行了跟踪调查研究,明确了我国导致玉米矮花叶病的病毒株系情况及其种群结构。2009年从保定表现矮花叶症状的玉米上得到一个SCMV分离物BD8,通过RT-PCR和5RACE扩增了其全基因组,并测定了其核苷酸(nt)序列。除poly(A)外,BD8基因组RNA长9576nt,其中5'-UTR和3'-UTR分别为148nt和236nt,ORF9192nt,编码一个含3063个氨基酸的多聚蛋白。BD8与GenBank中另外13个SCMV分离物全基因组序列的一致率在79.1%-80.8%之间,CP的核苷酸和氨基酸序列一致率分别为76.9%～82.6%和82.8%～86.9%。在利用全基因组核苷酸序列构建的系统发育树中,SCMV分为4个组：第1组来自玉米,第Ⅱ组来自甘蔗,来自澳洲的分离物和BD8分别单独聚为一簇,说明BD8是SCMV的一个新株系。在利用CP基因核苷酸序列构建的系统发育树中,BD8与泰国和越南的分离物分在了一组,说明该株系在南亚有分布。在温室内接种BD8的20个玉米品种均表现高感,显示该分离物的致病力较强。测定了黄淮海地区山东、河北、河南、山西和陕西51个SCMV分离物的全序列。结合GenBank中的14个全序列和92个CP基因序列分析了SCMV的种群遗传结构分析发现：1)65个具基因组全序列的分离物中有25个发生明显的重组,其中12个存在组间重组,13个发生了组内重组。2)基于全基因组序列,SCMV分离物可分成四个组,其中Ⅰ和Ⅳ组的分离物来源于玉米,Ⅱ组包括玉米和甘蔗分离物,而Ⅲ组分离物来源于甘蔗。本研究获得的分离物大部分属于Ⅰ组和Ⅳ组。而基于CP基因序列可分成5个组：A (MZ group)、B (NSCE group、C (MZ/SCE group)、D (SCE group)和E(SO group)。其中A组分离物的分布最广,C组分离物目前仅在中国和南亚有发现。我国同时存在这5个组的病毒株系,而本论文采集的SCMV分离物分别聚类到A组和C组。3)SCMV的11个基因中有10个基因处于负向(或净化)选择,只有NIb基因处于正向(或多样化)选择。4)山西、山东和河北叁省分离物间的基因交流频繁,而山西和河北的分离物与陕西分离物间的基因交流不频繁,山东和陕西的分离物间在某些基因区域存在一定的基因交流。5)中国的A组病毒种群正处于一个爆发的状态,而C组病毒种群处于一个动态平衡状态,并有进一步扩张的趋势。
党明青[9]2017年在《玉米褪绿斑驳病毒致病性分析及与甘蔗花叶病毒协同侵染机制研究》文中认为玉米褪绿斑驳病毒(Maize chlorotic mottle virus,MCMV)与甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus,SCMV)协同侵染可以引起玉米致死性坏死病(Maize Lethal Necrosis Disease,MLND);该病害近些年来流行爆发,成为玉米生产上的主要病毒病害之一,对生产造成了极大的危害。为研究MCMV与SCMV协同侵染导致MLND的分子机制以及为防治该病害提供指导,本研究分别从蛋白质组和病毒群体水平进行探索和研究。首先,我们用 iTRAQ(isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation)技术分别分析了玉米(B73)响应MCMV单独侵染以及和SCMV协同侵染引起MLND的相关寄主因子表达量变化。通过使用病毒诱导的基因沉默(Virus Induced Gene Silencing,VIGS)技术对若干差异表达蛋白进行了验证。iTRAQ共发现605个蛋白响应MCMV侵染,其中407个为上调表达,198个为下调表达。从中挑选20个进行转录水平分析,发现16个差异表达蛋白在蛋白水平与转录水平应答MCMV侵染的模式一致。KEGG pathway注释及富集分析发现核糖体和光合作用通路发生极显着富集。从差异表达蛋白中选择蛋白质二硫键异构酶PDIL1-1(protein disulfide isomeraselikeprotein 1-1)、过氧化物还原酶PRX5(peroxiredoxin5)和蔗糖合酶SUS1(sucrose synthase 1)进行进一步的研究。使用黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)诱导的玉米基因沉默系统成功使它们的表达量分别降低,然后摩擦接种MCMV。发现沉默PPDIL1-1和PRX5后MCMV的积累量受到显着抑制;同时MCMV侵染引起的症状也有所减轻。另一方面,研究发现沉默SUS1后对MCMV侵染B73没有显着影响。以MCMV单独侵染作为对照,MCMV和SCMV协同侵染共鉴定到723个差异表达蛋白。对所有的差异表达蛋白进行GO功能注释和富集分析,发现57个极显着富集的GO条目。对差异表达蛋白进行KEGG pathway注释及富集分析,发现有5个通路为极显着富集。在协同侵染诱发MLND的过程中TCA循环、γ-氨基丁酸代谢、植物激素等途径发生显着变化。两个与磷酸盐(phosphates,Pi)同化有关的蛋白在协同侵染时表达量发生显着上调,即玉米磷转运蛋白 ZmPHT3;3/4(Zea mays phosphate transporter 3;3/4)和玉米紫色酸性磷酸酶 ZmPAP(Zeamays purple acid phosphatase)。运用 CMV诱导的玉米基因沉默系统分别对它们进行沉默,并摩擦接种MCMV和SCMV,发现它们对协同侵染有着不同的影响。沉默ZmPHT3;3/4后协同侵染中MCMV和SMCV的积累量显着降低;而沉默ZmPAP后,协同侵染中MCMV和SMCV的积累量却显着提高。推测降低ZmPHT3;3/4的表达量可能会打破Pi在细胞内不同亚细胞结构中的分配平衡,从而诱导ZmPAP的表达;ZmPAP是MLND的负调控因子,过表达该蛋白能够抑制协同侵染病毒的积累。MCMV和SCMV除了通过调控影响寄主因子的表达进行协同作用外,病毒的基因组之间也存在相互作用。研究两个病毒在协同侵染选择压下病毒基因组的相互作用有助于更加深入地了解MCMV与SCMV协同作用的分子机制。本研究中我们使用高通量测序技术分别研究了 MCMV、SCMV单独侵染以及协同侵染时病毒群体的变异情况,提供了两种病毒在协同侵染压力下病毒群体的变异信息。通过对高质量二代测序结果进行病毒SNV(Single Nucleotide Variants)分析,发现第一代MCMV单独侵染时(M1)非编码区变异程度略高于编码区,MCMV单独连续传代至第九代(M9)后,SNVs在编码区和非编码区均匀分布。分别对协同侵染中MCMV和SCMV的变异情况进行统计,发现MCMV的变异程度在协同侵染时略有下降;SCMV的总体变异程度在协同侵染时显着下降。进一步分析SNVs碱基替换类型发现协同侵染和单独连续传代都造成MCMV中颠换(transversions)的比例有所增加,主要的颠换类型倾向性于T→G。MCMV和SCMV中发生频率最高的转换(transitions)类型都是A→G。SCMV单独侵染第一代(S1)和第九代(S9)中转换和颠换比例分别为3.3、3.9。选取变异频较大(>1%)的SNV热点进行进一步的统计和分析。发现在MCMV第一代、第九代以及与SCMV协同侵染第一代(MS1)和第九代(MS9)存在六个一致的SNV热点,但是在不同样品中突变频率有所不同,暗示这些位点是MCMV自身突变的热点。进一步分析发现,在第一代MCMV基因组中叁个SNV热点在其单独摩擦传代过程或者协同侵染中都发生变化。单独摩擦MCMV传播到第九代后,发现有十个比较明显的SNV热点,其中五个热点位于P32 ORF内,造成P32蛋白中四个氨基酸的改变。在协同侵染摩擦传播至第九代后MCMV中存在七个SNV热点,值得注意的是位于P32 ORF内的叁个SNVs都造成氨基酸的突变。无论是在单独侵染还是协同侵染中,P32 ORF都在连续传代过程中有比较大的变异,暗示该基因在实验处理下处于较大的选择压力下。研究发现,CP蛋白在MCMV编码的所有蛋白中是最保守的,所有位于CP ORF内的SNVs都没有造成氨基酸的改变;而3'UTR则是变异最高的区域。与MCMV相比,SCMV的3'UTR在协同侵染中趋向于变异程度降低;SCMV CP蛋白中的一些氨基酸在单独摩擦传代中也发生了变化,第一代S1中CP ORF内只有一个SNV热点,而在第九代S9中则有位五个SNV热点,这六个位点都造成CP蛋白氨基酸的改变。我们还发现,MS1中SCMVCPORF内有8631、9324位两个SNV热点;在MS9中只有8631位一个SNV热点。以上结果暗示在单独连续传代过程中SCMV的CP蛋白倾向于积累更多的变异,而在协同侵染中位于CP蛋白内的变异被有效抑制,这种差异可能与SCMV在自然界中的传播方式密切相关。病毒能够编码一个或多个RNA沉默抑制子来抑制植物的RNA沉默。本研究通过GFP瞬时表达系统发现MCMV编码的P7a、CP具有弱的抑制局部基因沉默的能力,进一步研究表明P7a、CP具有明显的抑制系统基因沉默和抑制系统沉默信号传导的能力。BiFC(Biomolecular Fluorescence Complementation)结果表明 P7a、CP 与 SGS3(Suppressor of Gene Silencing 3)存在互作关系。推测P7a、CP可能通过与SGS3互作结合,影响SGS3的功能,从而抑制基因沉默。
吴丽莉[10]2012年在《叁种蚜传病毒外壳蛋白叶绿体离体跨膜运输研究》文中研究表明芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus, TuMV)、大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus, SMV)和甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus, SCMV)均为世界性分布病毒,属于马铃薯Y病毒组(Potatovirus Y group),在自然条件下主要靠蚜虫以非持久性方式传播,分别是危害十字花科蔬菜、豆科作物和禾本科植物的主要病毒。本文利用RT-PCR、序列测定及分析的方法对采自南京、洪泽、姜堰自然发生的具有典型症状的青菜、大豆和玉米病样进行鉴定,南京地区青菜病样分离物NJ-TuMV-CP核苷酸序列与国内外报道的TuMV不同地区的病原分离物相比较,与印度、河北和北京地区病原分离物的同源性较低,与其他地区TuMV病原分离物同源性均在90%以上,洪泽地区大豆病样分离物HZ-SMV-CP核苷酸序列与国内外报道的SMV不同地区的病原分离物相比较,与中国的SMV-BZ病原分离物序列同源性较低,与SMV其他地区病原分离物核苷酸序列的同源性均在90%以上,姜堰地区玉米病样分离物分别扩增到其JY-SCMV-CP、 JY-HC-Pro、JY-Vpg和JY-Nib四个基因,并分别与与国内外报道的SCMV不同地区的病原分离物相比较,姜堰地区玉米病样分离物各基因的核苷酸序列MDMV、SrMV和JGMV对应的序列同源性较低,且SCMV-CP基因与泰国和美国的病原分离物的同源性较低,其余各基因与GenBank中已经登录的SCMV不同地区病原分离物的CP、HC-Pro、Vpg和NIb基因的同源性均在90%以上,证实分别为TuMV、SMV和SCMV侵染。并提纯病毒,得到TuMV、SMV和SCMV的浓度分别为：13.7mg/mL、11.68mg/mL和2.51mg/mL,病毒紫外扫描呈典型病毒核蛋白吸收峰,A260/A280值分别为1.17,1.30和1.15。利用提纯的叁种病毒分别制备了3株抗血清Tul1、S21和SC31,效价各为1：512000,1：204800和1：25600。根据Banerjee等的方法,本研究建立了TuMV、SMV和SCMV的外壳蛋白叶绿体离体跨膜运输体系,分别研究了跨膜时间、外壳蛋白浓度对跨膜运输效率的影响以及CP跨膜的种属选择性。结果表明,TuMV-CP、SMV-CP和SCMV-CP分别可以快速地进入离体的青菜、大豆和玉米叶绿体中,叁种病毒外壳蛋白的跨膜时间均不低于5min,跨膜时间超过15min对进入叶绿体中CP的浓度没有影响；加入跨膜体系中的外壳蛋白浓度与跨膜后进入叶绿体的外壳蛋白浓度呈正相关。参照本实验室对TMV-CP以及两种麦类土传花叶病毒CWMV-CP和BaYMV-CP勺叶绿体离体跨膜运输结果,我们发现孵育时间对叶绿体跨膜效率的影响是相同的,即超过15min,跨膜时间对进入叶绿体中CP的量没有影响；加入跨膜体系中的CP浓度与跨膜后进入叶绿体的CP量呈正相关,3种病毒能够实现跨膜的外壳蛋白最低浓度分别为54.80μg/mL,49.05μg/mL和50.20μg/mL。此研究结果为探索此类病毒的致病机制提供理论依据。
参考文献：
[1]. 玉米种子传播甘蔗花叶病毒的研究[D]. 李莉. 中国农业科学院. 2003
[2]. 黄瓜绿斑驳花叶病毒与甘蔗花叶病毒基因组测序及种群遗传结构分析[D]. 饶黎霞. 浙江大学. 2016
[3]. 玉米种子传播甘蔗花叶病毒的研究简报[C]. 李莉, 王锡锋, 周广和. 第叁次全国植物病毒和病毒防治学术研讨会论文集. 2003
[4]. RNAi调控玉米抗甘蔗花叶病毒和粗缩病毒的研究[D]. 甘德芳. 安徽农业大学. 2011
[5]. 甘蔗花叶病的分子检测及病样生理生化变化[D]. 周丰静. 广西大学. 2015
[6]. 套袋苹果黑点病初步研究及甘蔗花叶病毒HC-pro基因克隆与蛋白原核表达[D]. 郝兴安. 西北农林科技大学. 2006
[7]. 玉米抗甘蔗花叶病毒病主效QTL的克隆与抗病机理研究[D]. 刘青青. 中国农业大学. 2017
[8]. 甘蔗花叶病毒种群遗传结构分析[D]. 高波. 山东农业大学. 2012
[9]. 玉米褪绿斑驳病毒致病性分析及与甘蔗花叶病毒协同侵染机制研究[D]. 党明青. 浙江大学. 2017
[10]. 叁种蚜传病毒外壳蛋白叶绿体离体跨膜运输研究[D]. 吴丽莉. 扬州大学. 2012
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