刘扬[1]2016年在《基于MNCC模型的高分辨率遥感影像目标识别》文中进行了进一步梳理高分辨率遥感影像的目标识别问题是海洋交通监视、减灾应急搜救、无人自主系统(UAS)(如无人机、无人车、无人潜航器、无人水面艇等自主机器人)等民用系统的核心技术,也是军事侦察、精确制导、海情监控等军事自动目标识别(ATR)系统的关键技术。伴随着高分辨率对地观测系统的发展,越来越多的行业应用要求从高分辨率影像中提取更多有价值的目标细节信息。然而中低分辨率遥感影像解译体系已无法满足高性能的目标分类与识别(TCR)需求。特别由于背景的复杂性和目标的多样性,目标识别的精度有效性和实时性问题尤为突出。此外由于相关应用蕴含的军事背景、数据获取困难以及技术管制等原因,目前公开报道涉及TCR方法的核心技术相对较少。为解决目标识别的技术瓶颈,本文重点探索高分辨率遥感影像的高精度、高性能TCR的模型构建和算法设计,为相关研究提供基础性的技术支撑。本文研究思路是:(1)分析高分辨率遥感影像TCR问题的技术瓶颈,模拟神经认知理论,建立面向遥感影像TCR应用的层次化媒体神经认知计算(MNCC)模型。(2)基于MNCC模型的处理流程及显着性计算理论,分别设计场景分类和目标检测算法,为目标识别提供上下文先验知识。(3)基于MNCC模型处理框架,设计高分辨率遥感影像目标识别算法。首先构造层次化的集成分类器,实现高精度目标识别;其次设计样本扩增方法,解决小样本复杂对象的目标识别问题。(4)研究并行化目标识别算法提升识别效率,并将相关算法应用于遥感影像处理系统的研发中。本文的主要工作和结论如下:(1)构建了一种面向遥感影像TCR应用的层次化MNCC模型。针对高分辨率遥感影像的TCR核心问题,深入分析了神经系统的结构与信息处理机制,研究认知系统的视觉功能和层次处理架构。构造和设计了面向TCR的仿脑层次化的MNCC模型,并给出了MNCC模型TCR算法的形式化描述。(2)提出了基于脉冲神经网络的遥感目标检测算法。为克服自然图像显着性算法的局限性,在MNCC模型的显着性计算理论指导下,提出一种基于脉冲神经网络和脉冲耦合神经网络的遥感影像视觉显着性计算框架VSF-MNCC,并实现基于脉冲神经网络的遥感影像船舶检测算法SD-SNN。在可见光船舶数据集HRSHTD和高分辨率SAR图像中,船舶目标检测的虚警率和漏检率分别达到9.48%和11.02%,实验表明VSF-MNCC显着图具备较高的分辨率,对于点状和团块的目标检测性能提升具备较好的效果。(3)提出了基于MNCC模型的遥感场景分类算法。作为目标识别的重要环节,提出基于MNCC模型的遥感场景分类算法SC-MNCC,为TCR相关应用的精度提升提供了上下文先验知识。在高分辨率遥感场景分类数据集HRSS和UCMLU的实验中,算法平均分类准确度分别达到84.73%和88.26%,优于常见场景分类算法,初步验证了MNCC模型的可行性。(4)提出了基于MNCC模型的高分辨率遥感影像的高精度目标识别算法。为解决高精度的SAR图像坦克目标分类,设计基于深度脉冲卷积神经网络和层次隐狄利克雷分配模型的混合层次化目标识别分类器,实现了基于多层次集成学习的目标识别算法TCR-EL-MNCC。在公开的MSTAR数据集的实验表明,TCR-EL-MNCC算法在SAR坦克目标的总体分类精度达到99.82%,优于目前常见算法。为进一步解决小样本复杂对象的可见光影像船舶目标识别,基于面向对象多尺度样本扩增技术,提出了目标识别的增量强化学习算法TCR-IREL-OOMS。在HSTCR数据集的实验表明,TCR-IREL-OOMS算法在船舶目标的平均识别率达到97.00%,接近MSTAR数据集的SAR坦克目标的识别率。本研究表明,利用增量、强化和集成的学习机制,构建的面向对象多尺度的层次化计算模型,符合人类对遥感影像的认知特性。基于MNCC模型的目标识别算法可有效实现复杂地物的信息提取工作。(5)提出和验证了并行化TCR的解决方案,并设计和实现了基于构件的遥感影像信息处理和展示平台。深入分析了遥感影像信息处理和展示平台的功能需求,提出一种基于构件模型的遥感影像处理软件的开发方案,设计和实现了遥感应用系统的并行处理架构。并将基于MNCC模型的TCR算法应用于软件的研发中,最后对开发效果进行系统分析和评价。为提升算法运行效率和实用性,采用多机多核并行和GPU异构计算技术,设计了基于MNCC模型的混合异构并行目标识别算法PTCR-MP-MNCC。在HSTCR、MSTAR和MNIST叁个数据集上实验和讨论了相关参数对算法效率的影响。实验结果显示,算法在HSTCR和MSTAR数据集最高加速比可达39.49和73.28。实践表明基于MNCC模型的TCR算法在遥感影像信息提取上具备重要的应用价值。综上所述,遥感影像智能解译涉及复杂的认知过程和专业知识,直接进行复杂的图像语义理解和计算往往存在较大的困难。针对高分辨率遥感影像目标的多尺度认知特性,利用神经认知机制首次构建了一种面向遥感TCR应用的层次化MNCC模型。设计面向对象多尺度的高分辨率遥感影像目标识别算法,可有效提升分类识别的精度需求。针对高分辨率遥感影像处理存在较高的并行特性,合理有效地设计并行TCR算法,能大幅度改善UAS和ATR系统的实时性需求。本文所研究的面向TCR的层次化MNCC模型可有效提升高分辨率遥感影像的目标检测、场景分类和目标识别任务的性能,并为实现高分辨率遥感影像的智能解译和复杂的语义计算提供有益的借鉴和参考。
周超颖[2]2016年在《MTB Ag85B_(199-207)和HIV-1 Env_(120-128)双特异TCR基因修饰CD8~+ T细胞及其活性研究》文中指出结核病和人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1,HIV-1)感染是全球最致命的慢性感染疾病。结核是HIV感染者发病率和死亡率升高的主要原因,也更容易在HIV感染人群中进行播散。据WHO统计报告,2013年全球新增结核病人900万,其中110万(13%)共感染HIV；全球结核死亡人数150万,其中1/4为合并感染HIV致死。在宿主中,结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)和HIV彼此加强相互作用,加快免疫功能的弱化或丧失。结核潜伏感染者,一旦再感染HIV,会加速破坏机体免疫系统,主要使CD4+T淋巴细胞的功能下降和数量减少,激活原本受抑制的MTB,使之更容易发展成活动性结核。同时,MTB通过刺激单核细胞和巨噬细胞大量分泌单核细胞趋化蛋白1 (monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1)促进HIV的转录,加速病毒增殖,促使病情恶化。目前,MTB/HIV双重感染者的治疗主要是异烟肼预防治疗与抗逆转录病毒治疗的结合,其疗程长,多种药物相互作用,药物重迭的毒副作用大,易产生耐药性,病人服药依从性差,对这两种疾病同时有效的药物稀缺,整合异烟肼预防治疗与抗逆转录病毒治疗存在时间和药物选择的巨大挑战,以及出现免疫重建炎症综合症等问题。因此,亟需开发针对MTB/HIV共感染行之有效的治疗方法。抗MTB/HIV共感染的主要免疫机制是以T细胞介导的细胞免疫为主。已有大量实验证据表明,抗原特异性CD8+T细胞在控制MTB和HIV感染中发挥着至关重要的作用。效应CD8+T细胞通过以下两种途径来发挥作用：1)发挥细胞毒作用,通过穿孔素和颗粒酶B (granzyme B, GrB)途径直接杀伤感染靶细胞；2)释放Thl型细胞因子,如干扰素-γ (interferon-γ, IFN-γ)、肿瘤坏死因子-a (tumor necrosis factor-a, TNF-a),抑制病原体复制,促进巨噬细胞清除胞内病原体。然而,在MTB/HIV共感染者体内,其免疫功能明显紊乱,表现为T细胞增殖反应下降,效应CD8+T细胞数量和反应水平均很低,白细胞介素-2(interleukin-2, IL-2)和IFN-γ产生显著减少。因此,通过过继转移大量效应CD8+T细胞至MTB/HIV共感染者体内,可增强其抗MTB/HIV感染的能力。过继细胞免疫治疗已在抗MTB和HIV感染中显示了巨大潜力。Kitsukawa等利用灭活的结核菌体外致敏PBL,将其回输给多药耐药肺结核患者,取得良好疗效。Lieberman等将患者自体HIV特异性CD8+细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)过继回输治疗6例HIV感染者,最初2周所有患者CD4计数增加,5名患者血浆病毒血症减少。24周后,2名患者的HIV病毒负载继续减少,另1名患者CD4计数增加超过2倍。尽管过继细胞免疫治疗展现出光明的前景,但这种方法的广泛应用却存在许多障碍。首先,我们很难从处于疾病进展期的患者体内分离出效应T细胞,因为此时CTL反应是不断消耗的；接受长期治疗的个体也是如此,因为随着病原体负载减少,针对病原体的CTL反应也减少。另外,从患者体内分离出的T细胞往往是已最终分化的,很难扩增。即使可以扩增,回输患者体内后其存活时间也很短。而通过抗原特异T细胞受体(T cell receptor, TCR)基因修饰初始T细胞,人为赋予普通T细胞识别特异抗原的能力,短期内获得大量效应T细胞,则可有效解决这一问题。我们已经利用结核分枝杆菌38KDa抗原体外刺激正常人外周血CD4+和CD8+T细胞,获得38KDa抗原特异TCR,转导初始T细胞,修饰的T细胞具有显着的体外抗结核抗原活性。HIV-1 gag特异性TCR基因修饰CD8+T细胞的体外和体内活性也有报道。但是,用MTB和HIV-1抗原双特异的TCR对T细胞进行基因修饰尚未见报道。有研究者提出,在人初始T细胞池中,不同特异性的TCR种类<108,而潜在外源肽>1015,因此,TCR的数量与大量潜在的外源肽-MHC复合物相比,是相形见绌的。适应性T细胞免疫要求每个T细胞都能识别大量与细胞异常相关的潜在抗原肽,这种现象可以由T细胞的交叉反应性来解释。最近报道的从I型糖尿病患者分离的1E6 TCR具有非常大的交叉反应性。表达1E6 TCR的T细胞除了识别前胰岛素原来源的HLA-A*0201限制性PPI15-24肽(ALWGPDPAAA)以外,还至少对130万个十肽产生反应,反应强度与PPI15-24一样强烈。在这些大量肽中,活化表达1E6 TCR的T细胞时,RQFGPDFPTI比PPI15-24的活性强100倍以上,尽管它与PPI15-24在组成上有七个氨基酸不一致。因此,我们完全有理由相信可以找到一个单一TCR同时识别两种抗原肽。本文首次提出通过转导一个TCR同时产生针对两种不相似病原体抗原肽的活性反应,为MTB/HIV共感染患者的免疫治疗提供新的思路。利用分别负载MTB肽Ag85B199-207 (KLVANNTRL)和HIV-1肽Env120-128 (KLTPLCVTL)的树突状细胞(dendritic cell, DC)反复刺激HLA-A*0201型健康人外周血CD8+T细胞,通过互补决定区3 (complementarity determining region 3, CDR3)谱型分析,筛选出同时对Ag85B 199-207和Env120-128特异的单一TCR,通过逆转录病毒载体将双特异TCR基因转导至普通CD8+T细胞中使其表达。研究结果显示,双特异TCR基因修饰的CD8+T细胞既可针对Ag85B199-207产生高水平的IFN-γ、 TNF-α和GrB分泌及特异性杀伤,同时也可针对Env120-128产生显着的效应反应。本研究为MTB/HIV共感染过继细胞免疫治疗奠定了基础,同时也为其他共感染疾病的免疫治疗研究提供了模式和平台。方法1.筛选Ag85B199-207和Env120-128双特异TCR1)采用淋巴细胞分离液分离HLA-A*0201型健康志愿者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC);2) PBMC贴壁培养2h后,吸出悬浮细胞,往贴壁细胞中加入100ng/mL重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte macrophage colony-stimulating factor, rhGM-CSF)和100 ng/mL重组人白细胞介素-4 (recombinant human interleukin-4, rhIL-4)诱导DC；3)MTB肽Ag85B199-207 (50 μg/mL)和HIV-1肽Env120-128 (50μg/mL)分别冲击致敏DC；4)利用分别负载Ag85B199-207和Env120-128抗原肽的DC诱导抗原特异T细胞发生克隆扩增；5)经过两轮刺激后,磁珠分选CD8+T细胞,提取mRNA,逆转录为cDNA；6)CDR3谱型分析检测刺激前后CDR3谱型,找出刺激后均呈单克隆增生的Ag85B199-207和Env120-128双特异的TCRα、β基因家族。2.重组逆转录病毒载体构建与病毒滴度测定1)根据NCBI网站GeneBank报道的人TCR α、β基因家族上游可变区(variable region, V)和下游恒定区(constant region, C)基因序列,设计TCR α和β链全长基因上、下游引物,扩增出Ag85B199-207和Env120-128双特异的α17和p15基因；2)根据文献报道的影响外源TCR基因表达和功能的C区9个关键氨基酸序列,分别设计α和β链C区突变位点上、下游引物,利用重组PCR方法将TCRα、β链C区9个关键氨基酸进行替换；3)利用重组PCR技术,将TCRα和p基因通过自剪切多肽P2A连接,测序鉴定正确后插入逆转录病毒载体pMX-IRES-GFP,酶切鉴定；4)采用脂质体转染法,将重组逆转录病毒表达载体pMX-β 15-P2A-α 17-IRES-GFP与包膜蛋白质粒VSV-G共转染GP2-293包装细胞；5)收集转染后48 h病毒上清,低温超速离心浓缩纯化重组病毒,分装后保存于-80℃;6)重组病毒感染NIH3T3细胞,流式细胞术检测其感染性滴度,计算公式：病毒感染性滴度(GFU/mL)=NIH3T3细胞数×GFP阳性率/病毒浓缩液量(mL)。3.TCR基因修饰CD8+T细胞1)采用Ficoll密度梯度离心法,分离HLA-A*0201型健康人外周血PBMC;2)磁珠分选CD8+T细胞；3)联合使用抗CD3 (1μg/mL)、抗CD28 (1μg/mL)单抗和IL-2 (100U/mL)活化刺激分选出的CD8+T细胞；4)以最佳感染复数(multiplicity of infection, MOI),,即MOI=13将重组逆转录病毒pMX-β15-P2A-α17-IRES-GFP感染CD8+T细胞；5)IL-2刺激感染后的CD8+T细胞；6)流式细胞术检测病毒感染后CD8+T细胞的GFP表达阳性率；7)流式细胞术检测病毒感染后CD8+T细胞的MHC dextramer阳性率；8)实时荧光定量PCR (real-time quantitative PCR, qRT-PCR)检测病毒感染后CD8+T细胞的β15-P2A-α17的基因水平。4.TCR基因修饰CD8+T细胞针对外源性抗原的活性测定按已摸索好的效靶比(effector:target, E:T),将TCR基因修饰CD8+T细胞与负载MTB肽Ag85B199-207或H1V-1肽Env120-128的DC共培养。实验组设置如下：① Vector plus TCR+DC:TCR基因修饰CD8+T细胞+未负载抗原肽的DC; ②NV+DC-MTB:未转染CD8+T细胞+负载MTB肽Ag85B199-207的DC;③NV+DC-HW：未转染CD8+T细胞+负载HIV-1肽Env120-128的DC；④Vector+DC-MTB:空载体转染CD8+T细胞+负载MTB肽Ag85B199-207的DC；⑤ Vector+DC-HIV:空载体转染CD8+T细胞+负载HIV-1肽Envi20-128的DC;⑥ Vector plus TCR+DC-CMV:TCR基因修饰CD8+T细胞+负载CMV肽pp65495-503的DC; ⑦ Vector plus TCR+DC-MTB:TCR基因修饰CD8+T细胞+负载MTB肽Ag85B199-207的DC; ⑧ Vector plus TCR+DC-HIV:TCR基因修饰CD8+T细胞+负载HIV-1肽Env120-128的DC。利用酶联免疫吸附分析法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测CD8+T细胞培养上清中IFN-γ、TNF-α、GrB的分泌水平；利用时间分辨荧光免疫分析技术(time-resolved fluoroimmuno assay, TRFIA)检测CD8+T细胞对负载抗原肽DC的杀伤活性；利用ELISA检测TCR基因修饰CD8+T细胞IFN-γ分泌的剂量效应；利用胞内细胞因子染色法(intracellular cytokine staining, ICS)检测TCR基因修饰CD8+T细胞的IFN-γ分泌。5.TCR基因修饰CD8+T细胞针对内源性抗原的活性测定按已摸索好的E：T,将TCR基因修饰CD8+T细胞与转染pV1J.ns-tPA-Ag85B质粒、pCAGGS-Env质粒或pCI-OVA质粒的DC共培养。实验组设置如下：①Vector plus TCR+DC:TCR基因修饰CD8+T细胞+未负载抗原的DC;②NV+DC-MTB:未转染CD8+T细胞+转染pV1J.ns-tPA-Ag85B质粒的DC;③NV+DC-Env:未转染CD8+T细胞+转染pCAGGS-Env质粒的DC；④Vector+DC-MTB:空载体转染CD8+T细胞+转染pV1J.ns-tPA-Ag85B质粒的DC;⑤ Vector+DC-Env:空载体转染CD8+T细胞+转染pCAGGS-Env质粒的DC；⑥ Vector plus TCR+DC-OVA:TCR基因修饰CD8+T细胞+转染pCI-OVA质粒的DC; ⑦ Vector plus TCR+DC-MTB:TCR基因修饰CD8+T细胞+转染pV1J.ns-tPA-Ag85B质粒的DC; ⑧ Vector plus TCR+DC-Env:TCR基因修饰CD8+T细胞+转染pCAGGS-Env质粒的DC。利用ELISA检测CD8+T细胞培养上清中IFN-γ、TNF-α、 GrB的分泌水平;利用TRFIA检测CD8+T细胞对负载抗原DC的杀伤活性。6.TCR基因修饰J.RT3-T3.5细胞的CD69表达水平测定接种不表达TCR的Jurkat T细胞系J.RT3-T3.5细胞,按MOI为0、1、5、10、20、50分别加入重组逆转录病毒浓缩液,测定最适MOI值。按最适MOI值加入病毒感染J.RT3-T3.5细胞,与负载不同浓度(0、0.01、0.1、1、10μg/mL)的MTB肽Ag85B199-207或HIV-1肽Env120-128的T2细胞共培养,标记APC-CD69抗体,流式细胞术检测J.RT3-T3.5细胞的CD69表达。7.统计学分析采用Windows SPSS 17.0统计软件包进行数据分析。所有计量资料用平均值±标准差(x±s)表示;采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)比较CD8+T细胞的细胞因子分泌水平和杀伤水平,方差不齐时采用Welch进行校正；多重比较方差齐时用LSD法,方差不齐时用Dunnett T3法。检验水准a=0.05,双侧检验。结果1.分析抗原肽刺激前后CDR3谱型,筛选出MTB肽Ag85B199-207和HIV-1肽Env120-128双特异TCR通过对CDR3谱型进行分析发现,抗原肽刺激前健康志愿者外周血T细胞各TCR Vα (α chain variable gene)、Vβ (β chain variable gene)基因家族CDR3谱型均呈8个或8个以上峰型的高斯分布,表现为多克隆性。而抗原肽刺激后,部分TCR基因家族的CDR3谱型发生改变,呈偏态分布甚至单峰分布,表明这些家族是因为抗原肽的持续刺激而引起的寡克隆或单克隆增生。通过比较刺激前、后的CDR3谱型,我们在CD8+T细胞中找到了刺激前为多克隆,刺激后呈单克隆扩增,针对MTB肽Ag85B199-207和HIV-1肽Env120-128都特异的Vα17和Vβ15基因家族。2.构建重组逆转录病毒表达载体成功扩增出MTB肽Ag85B199-207和HIV-1肽Env120-128双特异的α17和β15全长基因片段,将其克隆至pGEM-T载体后测序鉴定,其V、C区DNA序列与GeneBank报道的序列完全一致。利用重组PCR技术,将人Cα、Cβ区9个关键位点的氨基酸替换为鼠C区相应位点氨基酸,扩增出hVβ15mCβ-P2A-hVα17mCα融合基因,将其插入pMX-IRES-GFP载体,构建重组逆转录病毒表达质粒pMX-hVβ5mCβ-P2 A-hVα17mCα-IRES-GFP,酶切鉴定证实基因片段插入正确。将上述表达质粒与包膜蛋白质粒VSV-G共转染包装细胞GP2-293,收集48 h病毒上清,经低温超速离心浓缩纯化后感染NIH3T3细胞,流式细胞术检测NIH3T3细胞GFP表达阳性率,经计算,重组病毒滴度为1.08×l08GFU/mL。3.TCR基因修饰CD8+T细胞按MOI=13,将重组逆转录病毒颗粒感染CD8+T细胞,感染5天后,在倒置荧光显微镜下观察GFP的表达,利用流式细胞术检测CD8+T细胞的dextramer阳性率。结果显示,在荧光显微镜下可观察到明显的绿色荧光,TCR基因修饰CD8+T细胞的MTB dextramer和HIV-1 dextramer双阳性率约为10%。收集感染5天后的CD8+T细胞,提取RNA,并逆转录为cDNA, qRT-PCR检测TCR基因修饰CD8+T细胞的β15-P2A-a17的基因表达水平,结果显示,TCR载体转染组β15-P2A-α17的基因水平显着高于未转染组和空载体转染组。4.TCR基因修饰CD8+T细胞针对外源性抗原的活性检测1)TCR基因修饰CD8+T细胞的IFN-y分泌水平按E：T=7,将TCR基因修饰CD8+T细胞和负载MTB肽Ag85B199-207、HIV-1肽Env120-128、CMV肽pp65495-503的DC或未负载抗原肽的DC混合培养18 h,ELISA检测细胞培养上清中IFN-y的分泌水平。结果显示,负载MTB肽组(Vector plus TCR+DC-MTB组)和负载HIV-1肽组(Vector plus TCR+DC-HIV组)的IFN-y分泌水平组间差异均具有统计学意义(F值和P值分别为F=50668.981,P=0.000；F=4097.071,P=0.000)。各组间两两比较结果显示,Vector plus TCR+DC-MTB组(598.530 ± 3.621 pg/mL)和Vector plus TCR+DC-HIV组(323.584 ± 6.870 pg/mL)的IFN-y分泌水平分别显着高于各自的四个对照组(P值均<0.001)。2)TCR基因修饰CD8+T细胞的TNF-α分泌水平按E：T=20,将TCR基因修饰CD8+T细胞和负载MTB肽Ag85B199-207、HIV-1肽CMV肽pp65495-503的DC或未负载抗原肽的DC混合培养24 h,ELISA检测细胞培养上清中TNF-α的分泌水平。结果显示,负载MTB肽组(Vector plus TCR+DC-MTB组)和负载HIV-1肽组(Vector plus TCR+DC-HIV组)的TNF-a分泌水平组间差异均具有统计学意义(F值和P值分别为F=2173.051, P=0.000; F=393.708, P=0.000)。各组间两两比较结果显示,Vector plus TCR+DC-MTB组(566.531±19.548 pg/mL)和Vector plus TCR+DC-HIV组(354.622 ± 28.604 pg/mL)的TNF-a分泌水平分别显着高于各自的四个对照组(P值均<0.01)。3)TCR基因修饰CD8+T细胞的GrB分泌水平按E：T=20,将TCR基因修饰CD8+T细胞和负载MTB肽Ag85B199-207、HIV-1肽Env120-128、CMV肽pp65495-503的DC或未负载抗原肽的DC混合培养24 h,ELISA检测细胞培养上清中GrB的分泌水平。结果显示,负载MTB肽组(Vector plus TCR+DC-MTB组)和负载HIV-1肽组(Vector plus TCR+DC-HIV组)的GrB分泌水平组间差异均具有统计学意义(F值和P值分别为F=2757.830,P=0.000; F=3601.843,P=0.000)。各组间两两比较结果显示,Vector plus TCR+DC-MTB组(413.818 ± 12.507 pg/mL)和Vector plus TCR+DC-HIV组(375.823 ± 9.654 pg/mL)的GrB分泌水平分别显着高于各自的四个对照组(P值均<0.01)。4)TCR基因修饰CD8+T细胞的杀伤效应按E：T=30,将TCR基因修饰CD8+T细胞和负载MTB肽Ag85B199-207、HIV-1肽Env120-128、CMV肽pp65495-503的DC或未负载抗原肽的DC混合培养4 h,TRFIA检测TCR基因修饰CD8+T细胞对负载抗原肽DC的杀伤活性。结果显示,负载MTB肽组(Vector plus TCR+DC-MTB组)和负载HIV-1肽组(Vector plus TCR+DC-HIV组)的杀伤水平组间差异均具有统计学意义(F值和P值分别为F=1708.411, P=0.000; F=114.198,P=0.000)。各组间两两比较结果显示,Vector plus TCR+DC-MTB组(31.107±1.140%)和Vector plus TCR+DC-HIV组(21.280±2.862%)的杀伤水平分别显着高于各自的四个对照组(P值均<0.05)。5)TCR基因修饰CD8+T细胞IFN-y分泌的剂量效应按E：T=7,将TCR基因修饰CD8+T细胞和负载不同浓度的MTB肽Ag85B 199-207或HIV--1肽Env120-128的DC共培养18 h, ELISA检测细胞培养上清中IFN-γ的分泌水平。结果显示,TCR载体转染组的IFN-γ分泌水平在MTB肽或HIV-1肽浓度为0.01 μg/mL时即可检测得到,并且随MTB肽或HIV-1肽浓度的增加而升高,呈现出明显的剂量效应；而未转染组和空载体转染组在每一个肽浓度均没有检测到显着的IFN-γ分泌。6)ICS检测TCR基因修饰CD8+T细胞的IFN-γ分泌将TCR基因修饰CD8+T细胞与负载MTB肽Ag85B199-207、HIV-1肽Env120-128或CMV肽pp65495-503的DC共培养,利用ICS检测CD8+T细胞的胞内IFN-γ分泌。结果显示,在TCR载体转染组中,通过DC递呈MTB肽Ag85B199-207后,超过5%的TCR基因修饰CD8+T细胞为CD8和IFN-γ双阳性；通过DC递呈HIV-1肽Env120-128后,超过2%的TCR基因修饰CD8+T细胞共表达CD8和IFN-γ;通过DC递呈无关肽CMV pp65495-503后,只有很低水平的双阳性CD8+T细胞可检测到；而在未转染组和空载体转染组中,双阳性CD8+T细胞的水平均很低。5.TCR基因修饰CD8+T细胞针对内源性抗原的活性检测1)TCR基因修饰CD8+T细胞针对内源性抗原的IFN-γ分泌按E：T=7,将TCR基因修饰CD8+T细胞和转染pV1J.ns-tPA-Ag85B质粒、pCAGGS-Env质粒或pCI-OVA质粒的DC共培养18 h,ELISA检测细胞培养上清中IFN-γ的分泌水平。结果显示,转染pV1J.ns-tPA-Ag85B质粒组(Vector plus TCR+DC-MTB组)和转染pCAGGS-Env质粒组(Vector plus TCR+DC-Env组)的IFN-γ分泌水平组间差异均具有统计学意义(F值和P值分别为F=1545.061,P=0.000; F=1611.016, P=0.000)。各组间两两比较结果显示,Vector plus TCR+DC-MTB组(338.280 ± 13.919 pg/mL)和Vector plus TCR+DC-Env组(236.875 ± 7.979 pg/mL)的IFN-γ分泌水平分别显著高于各自的四个对照组(P值均<0.001)。2)TCR基因修饰CD8+T细胞针对内源性抗原的TNF-a分泌按E：T=20,将TCR基因修饰CD8+T细胞和转染pV1J.ns-tPA-Ag85B质粒、pCAGGS-Env质粒或pCI-OVA质粒的DC共培养24 h, ELISA检测细胞培养上清中TNF-a的分泌水平。结果显示,转染pViJ.ns-tPA-Ag85B质粒组(Vector plus TCR+DC-MTB组)和转染pCAGGS-Env质粒组(Vector plus TCR+DC-Env组)的TNF-α分泌水平组间差异均具有统计学意义(F值和P值分别为F=1648.189,P=0.000; F=341.302, P=0.000)。各组间两两比较结果显示,Vector plus TCR+DC-MTB组(307.088 ± 6.695 pg/mL)和Vector plus TCR+DC-Env组(187.847±11.278 pg/mL)的TNF-α分泌水平分别显著高于各自的四个对照组(P值均<0.001)。3)TCR基因修饰CD8+T细胞针对内源性抗原的GrB分泌按E：T=20,将TCR基因修饰CD8+T细胞和转染pV1J.ns-tPA-Ag85B质粒、pCAGGS-Env质粒或pCI-OVA质粒的DC共培养24 h, ELISA检测细胞培养上清中GrB的分泌水平。结果显示,转染pV1J.ns-tPA-Ag85B质粒组(Vector plus TCR+DC-MTB组)和转染pCAGGS-Env质粒组(Vector plus TCR+DC-Env组)的GrB分泌水平组间差异均具有统计学意义(F值和P值分别为F=99.449,P=0.000；F=149.589,P=0.000)。各组间两两比较结果显示,Vector plus TCR+DC-MTB组(289.289 ± 53.946 pg/mL)和Vector plus TCR+DC-Env组(263.086 ± 39.756 pg/mL)的GrB分泌水平分别显着高于各自的四个对照组(P值均<0.05)。4)TCR基因修饰CD8+T细胞针对内源性抗原的杀伤效应按E：T=30,将TCR基因修饰CD8+T细胞和转染pV1J.ns-tPA-Ag85B质粒、pCAGGS-Env质粒或pCI-OVA质粒的DC共培养4h, TRFIA检测TCR基因修饰CD8+T细胞对负载抗原的DC的杀伤活性。结果显示,转染pV1J.ns-tPA-Ag85B质粒组(Vector plus TCR+DC-MTB组)和转染pCAGGS-Env质粒组(Vector plus TCR+DC-Env组)的杀伤水平组间差异均具有统计学意义(F值和P值分别为F=803.014, P=0.000; F=235.995, P=0.000)。各组间两两比较结果显示,Vector plus TCR+DC-MTB组 (25.663 ± 0.655%)和Vector plus TCR+DC-Env组(15.054±0.696%)的杀伤水平分别显着高于各自的四个对照组(P值均<0.001)。6.TCR基因修饰J.RT3-T3.5细胞的CD69表达水平测定按不同MOI值,将重组逆转录病毒颗粒感染J.RT3-T3.5细胞,流式细胞术结果显示,MOI=5时,J.RT3-T3.5细胞的GFP阳性率最高,在感染后第3天达52.7%。将TCR基因修饰的J.RT3-T3.5细胞与负载不同浓度的MTB肽Ag85B199-207或HIV-1肽Env120-128的T2细胞共培养,流式细胞术检测J.RT3-T3.5细胞CD69的表达。结果显示,通过对GFP阳性的细胞群进行分析,在TCR载体转染组中,J.RT3-T3.5细胞对MTB肽和HIV-1肽均有反应,其早期活化标志CD69的表达在肽浓度为0.01 μg/mL时即有明显升高,且随着肽浓度的增加而增加,表现出明显的剂量效应；但在空载体转染组中,J.RT3-T3.5细胞对每一个浓度的MTB肽和HIV-1肽均没有明显反应,其CD69表达均没有明显升高。结论本研究利用分别负载MTB肽Ag85B199-207和HIV-1肽Env120-128的DC反复刺激HLA-A*0201型健康志愿者外周血CD8+T细胞,通过CDR3谱型分析,获得针对这两种抗原肽共?
杨晨[3]2007年在《TCR的电气特性及控制系统》文中研究指明在现代电力系统中，最大限度的发挥输电线路的设计容量和提高系统运行稳定性问题日益突出；而随着电力电子技术的发展，非线性负载的冲击性和不平衡性使电网的无功损耗增加以及受电端电压下降，大量的无功功率在电网中的传输使电能利用率大大降低且严重影响供电质量。这些问题的出现使得在电网中装设无功补偿装置成为满足电网无功需求的必要手段。TCR是晶闸管控制电抗器的简称，是Thyristor Controlled Reactor的英文缩写，是目前无功功率补偿领域中应用比较广泛的SVC(Static Var Compensation静止无功补偿)装置之一。由于其自身的补偿性能优于同步调相机、并联电容器等传统的无功补偿装置，而且将其性能与价格综合起来考虑，比较适合中国的国情，因此近年来在电力系统中得到了广泛的应用。本文首先对无功补偿的意义、方法、发展概况等方面进行了阐述，然后分析了TCR的结构、机理、动态性能以及谐波等电气特性；通过比较确定了适合于TCR的控制策略和系统模型，设计出一套基于单片机的TCR控制系统，系统的核心处理部分为P89V51RD2，外围电路包括测量信号输入和调理、同步触发及通讯、告警等部分；并对如何进一步改进无功补偿装置特性进行了研究，在验证了装置效果的基础上提出了改善TCR谐波特性的方案。从基本电气特性分析、控制系统功能的实现，到性能进一步提升，都贯穿着物理模拟试验及电力系统仿真软件PSCAD的数字仿真，确保了研究的准确性和客观性。
刘华东[4]2008年在《基于DSP的SVC控制系统设计》文中研究说明随着我国国民经济的迅速发展,越来越多功率因数低、非线性、非对称性和冲击性等特点的工业用电设备和民用用电设备接入电网中,由此产生了功率因数低,电压波动,电压叁相不平衡,高次谐波污染等诸多的电能质量问题。在解决这些电能质量的众多设备中,静止无功补偿器SVC(Static VarCompensator)是性价比较高的一种,应用也最为广泛。控制系统是影响SVC性能的关键,也是SVC的核心技术。本文以一种TCR(Thyristor controlled Reactor)+TSC(ThyristorSwitched Capacitor)型SVC为对象,对其控制系统展开研究。在相对成熟的TCR,TSC型SVC控制原理的基础上,提出了TCR+TSC型SVC的控制策略,并且设计了TCR+TSC型SVC控制器。在TSC方面,选择了合理的投切方式;TCR方面,为保证设备的响应速度和控制精度,采用开环控制与闭环控制相结合的控制方式。在控制器的硬件方面,设计了基于TMS320F2812和80C196KC双CPU的控制电路和保护电路;软件方面,包括上位机(PC机)和下位机(DSP与单片机)控制软件的设计两部分,从而满足无功补偿的功能,同时还有操作方便,直观的人机对话界面。最后,通过试验测试和实际试运行来检验此控制系统的控制效果。实测结果表明:所研制的TCR+TSC型混合补偿装置的控制系统设计合理,响应速度快,控制精度高,且运行稳定,满足工程实际要求。
王鹏[5]2017年在《扬子鳄T细胞受体基因的基因组结构与进化分析》文中研究表明T细胞在动物适应性免疫系统中发挥重要的作用,主要参与细胞免疫,具有信号传递、激活B细胞、杀伤靶细胞、调节免疫应答等功能,T细胞特异性免疫功能的行使需要通过T细胞表面受体(T cell receptor,TCR)来完成。之前的研究发现有颂类脊椎动物中都存在α、β、γ和δ四种典型的TCR基因类型,其蛋白产物可以形成αβ和γδ两种跨膜型异源二聚体。此外,在低等哺乳动物、鸟类、两栖类和软骨鱼中还存在非典型的TCR基因类型:TCRμ、VHδ(位于TCRα/δ位点的与免疫球蛋白重链可变区序列相似性更高的V基因)和NAR-TCR。爬行类动物在进化过程中是连接两栖类、鸟类和哺乳动物的纽带,目前对其TCR基因的研究还非常少,在很大程度上限制了我们对有颌类脊椎动物TCR基因进化模式和过程的理解。鳄目动物是现存较为原始的爬行类动物,同时被广泛认为具有强大的免疫系统。本研究选择中国特有的扬子鳄(Alligator sinensis)为研究对象,对其TCR基因进行了全面的分析。本研究首先利用鸟类TCR基因恒定区氨基酸序列在已经公布的扬子鳄基因组序列中进行搜索,得到扬子鳄的TCR基因恒定区的序列信息;再通过筛选扬子鳄基因组BAC(bacterial artificial chromosome)文库,对得到的含有TCR基因的17条BAC克隆中的9条进行全长测序并与基因组序列进行拼接,获得了包含扬子鳄TCRβ基因全长(约500Kb)、TCRγ基因全长(109Kb)、TCRα/δ基因大部分V区和全部C区(包含两个位点,位点A跨度约1 Mb,位点B长约400 Kb)的序列信息。结合RACE(rapid amplification of cDNA ends)实验获得的转录本序列信息和Southern blotting实验结果对获得的基因组序列进行分析并绘制基因位点图谱,发现扬子鳄TCRβ基因座的结构为 Vβ(39)-Jβ1-ψCβ1-Dβ2-Jβ2(11)-Cβ2-Vβ(4),TCRγ 基因座的结构为 Vγ(18)-Jγ(9)-Cγ。与其他物种相似,扬子鳄的TCRδ基因也位于TCRα基因座内,共有两个结构相似的TCRα/δ基因位点。位点A的结构为 V(104)-Dδ1(3)-Jδ1(3)-Cδ1-Jα1(91)-Cα1-VHδ(2)(包含 80 个 Vα/δ 和 26 个 VHδ),位点 B 的结构为 V(39)-Dδ2(3)-Jδ2(3)-Cδ2-Vδ-VHδ-Jδ3-ψCδ3-VHδ(3)-Dδ4-Jδ4-Cδ4-VHδ(2)-Dδ5-Jδ5-Cδ5-Jα2(63)-Cα2(包含37个Vα/δ和11个VHδ)。RACE实验证明位点A和位点B是相邻的,因为两个位点可以共用部分可变区基因,但基因组序列搜索和BAC克隆筛选暂时都无法确定其位置关系。表达水平的分析发现扬子鳄的所有TCR基因在表达过程中都不发生体细胞超突变(somatic hypermutation,SHM),但其CDR3中存在大量的N/P核苷酸。δ链能够使用至少50%的Vα基因和大部分有功能的VHδ基因,还能同时使用多个D基因,使其CDR3的序列和长度多样性大大增加。定量PCR实验表明在外周淋巴组织中γδTCR的表达量与αβ TCR的表达量基本相同,在小肠上皮等粘膜组织中γδ TCR的表达量更高。扬子鳄的TCRβ位点和TCRγ位点与其他物种在相应的基因位点上存在同线性关系,位点结构和表达机制与其他物种基本相同。扬子鳄的TCRα/δ位点中存在大量与Cδ共同表达的VHδ基因,这些VHδ基因主要分为三组:第一组(VHδⅠ)与鸟类中的VHδ相似性较高(VHClanⅠ);第二组(VHδⅡ)与鸭嘴兽和负鼠中的VHδ和Vμ相似性较高(VH Clan Ⅲ);第叁组(VHδⅢ)与鳄目动物自身的IGHV(免疫球蛋白重链可变区基因)相似性最高(VH Clan Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中都存在),但多数为假基因,没有发现与Cδ基因共同表达的转录本。综合序列比对、进化分析和同线性分析的结果,本研究提出了羊膜动物TCRα/δ位点的一种可能的进化过程:爬行类、鸟类和哺乳类的共同祖先中只存在一个TCRα/δ位点,并且含有VHδ Ⅰ和VHδⅡ基因(VHδ Ⅰ也可能出现在哺乳类与爬行类分化之后),在低等哺乳类中保留了部分VHδ Ⅱ,并以此分化出TCRμ基因,在高等哺乳类中丢失了全部VHδ;爬行类与鸟类的共同祖先中发生了Cδ基因的复制(鳄目动物的Cδ基因分为三组:CδⅠ、CδⅡ和CδⅢ),鸟类中保留了部分VHδⅠ和CδⅠ,并复制出一个新的VHδ-Cδ位点;鳄目动物保留了 VHδ Ⅰ和VHδ Ⅱ,还出现了 VHδⅢ,并且发生了一次TCRα/δ位点的整体复制。扬子鳄的TCRα/δ位点B更加保守和古老,与其他物种的TCRα/δ位点存在同线性关系,位点A是鳄目动物出现后由位点B复制形成的,只保留了 CδⅠ,但TCRα/δ位点A的基因在淋巴组织中的表达量远高于位点B的基因,且位点A的V、J基因数量更多,在表达水平上的使用频率也更高。综上所述,本论文对扬子鳄TCR基因的位点结构、表达机制和进化特点等进行了多方面的研究,并总结了羊膜动物TCRα/δ位点的进化模式,这些研究结果为探索VHδ基因的起源和TCR基因的进化过程提供了重要的线索。
王伟甲[6]2008年在《面向不平衡负荷补偿的SVC的研究与设计》文中指出随着电力系统中不平衡负荷的增加,电网叁相电压不平衡日趋严重,电力系统的安全和经济运行受到威胁。晶闸管投切电抗器(ThyristorControlled Recator,TCR)型静止无功补偿装置是提高电力系统运行电压和提高系统稳定水平、减小网损、补偿不平衡负荷的常用手段。但从目前已投运的TCR运行情况来看,普遍存在平衡化能力较差、响应速度较慢等问题,以及晶闸管电磁触发与监测方式已不能满足装置的要求的缺点。本文主要研究面向不平衡负荷补偿的静止无功补偿装置补偿方法及晶闸管阀光电触发与在线监测系统的设计。首先结合基于瞬时无功功率理论的负序和无功综合补偿的策略来实现对不平衡负荷及负荷的功率因数进行补偿,并采用在系统允许精度范围内降低补偿精度的方法改进负序和无功综合补偿方法所存在的过补偿的问题。其次,针对当前面向负荷的TCR型静止无功补偿装置(SVC)多采用的开环控制方式中存在的不足,本文采用一种局部开环整体闭环的控制策略,在保证响应速度的同时也提高了控制的精度。最后,在对晶闸管光电触发与在线监测系统进行深入研究的基础上,将其引入到SVC的设计中,以改进对晶闸管阀状态的监测,提高晶闸管触发的可靠性。通过仿真研究表明:局部开环、整体闭环的控制策略有效地补偿了系统无功及负荷的不平衡度。本文最后给出了高压TCR型SVC设计中的硬件及软件设计的思路。
翟莎[7]2008年在《平衡不对称负荷的静止无功补偿器的研究》文中进行了进一步梳理随着叁相不对称负荷的不断增加,电力系统中叁相不平衡问题日益严重,电力系统的安全稳定运行也越来越受到威胁。针对这一现状,本文研究设计了TCR型静止无功补偿器,该补偿器在补偿负荷无功的同时,也能改善负荷不平衡的状况。本文首先介绍了SVC的工作原理和叁相不平衡的基本概念、危害及解决办法。其次介绍了SVC补偿叁相不对称负荷的基本原理,及基于对称分量法的不对称补偿算法。针对补偿算法中叁相负荷无功功率的测量计算,提出了一种基于希尔伯特滤波器的单相瞬时无功功率补偿新算法。在理论分析的基础上,建立了基于MATLAB/Simulink的SVC系统仿真模型。通过该模型可以实现对叁相不平衡负荷和无功功率的补偿。在仿真实验中,对比了基于对称分量法和基于希尔伯特滤波器的新型补偿算法,结果表明,本文所采用的补偿新方法,响应速度快,对采样时刻没有要求。同时分析比较了补偿电纳直接控制与增量式控制两种方案。实验结果表明,本文提出的不对称补偿算法可以实现对叁相负荷的不平衡和无功功率的补偿。
梁静静[8]2016年在《Tespal通过IP3R1调控T细胞受体（TCR）诱导的钙离子信号通路》文中进行了进一步梳理T细胞受体(T cell receptor,TCR)信号在胸腺T细胞发育和外周T细胞活化过程中均发挥关键作用。TCR刺激能诱导细胞膜附近LAT信号复合体形成,招募并活化一系列信号分子,传导信号。我们研究团队近期的研究发现,一个新的信号传导接头蛋白Tespa1,能在TCR活化后被招募到LAT信号复合体中,参与调控下游MAPKs信号通路以及Ca~(2+)信号通路的活化。然而,Tespa1调控下游信号的具体分子机制尚不清楚。本论文的研究发现,Tespa1通过F187和F188位点直接与IP3R1结合,并将IP3R1招募到TCR信号复合体。这一招募不仅促进胞膜附近Fyn激酶对IP3R1的Tyr353的磷酸化,还有效促进了 TCR信号复合体附近钙离子信号的最大活化。当我们将Tespa1与IP3R1的结合位点突变之后,TCR活化诱导的胞内钙离子信号活化受到了显着抑制。最后,携带这一突变的Tespa1-FFAA转基因小鼠完全模拟了 Tespa1敲除小鼠的表型,提示Tespa1与IP3R1的相互作用在胸腺细胞的阳性选择过程中发挥了主要作用。综上所述,我们的工作揭示了Tespa1调控TCR信号传导和胸腺细胞发育全新的分子机制。
罗微[9]2007年在《系统性红斑狼疮TCR二次重排的初步研究》文中进行了进一步梳理背景T淋巴细胞识别、活化是免疫反应的核心问题，也是免疫学中发展最快的研究领域之一。在分子水平上了解免疫识别活化的机制，不仅可以对机体免疫系统的运作有更深入的理解，而且对解析临床免疫相关疾病的发病机制、发展新的诊断和治疗技术均具有极大的帮助。也正是近十几年来在T细胞识别活化研究领域所取得的一些重大进展推动了肿瘤、移植、病毒感染及自身免疫性疾病的临床诊断和治疗。然而，在T细胞免疫识别活化研究中仍有许多的机理尚未完全解析，很多新的发现在充实原有理论的基础上又提出了新的命题。经典的免疫学理论克隆选择学说认为具有自身反应受体的“禁忌”T／B细胞克隆在发育过程中经历阴性选择(negative selection)被清除或失活成为克隆无能(anergy)，而具有其他抗原特异性受体的T／B细胞将得以进一步成熟，并进入外周淋巴组织行使其功能，T细胞迁出胸腺后其重排机制关闭，不再表达重组活化基因(recombination activating genes，RAGs)和发生受体基因重排(rearrangement)。然而，近二十年来国外一些实验室的研究结果对这一学说提出了挑战，新的研究发现，免疫系统除了细胞克隆选择(clone select)之外，还存在受体分子水平的选择，在细胞选择之前先通过受体可变区(variable，V)、多样区(diversity，D)、连接区(joining，J)基因重排改变其抗原特异性，以一种全新的受体取代原有的受体，从而逃避清除或凋亡。受体的第二次重排(second rearrangement)不仅可以发生于发育早期不成熟的T／B淋巴细胞中，也可发生于外周成熟T／B淋巴细胞中，前者称为受体编辑(receptor editing)，后者称为受体修正(receptor revising)。受体编辑多发现于胸腺阳性／阴性选择过程中，若缺乏阳性选择配体(合适的MHC)，TCR a位点将触发持续重排(continued rearrangement)直到新表达的TCR通过阳性选择(positive selection)；而在阴性选择过程中，自身反应T细胞启动TCR二次重排，使原表达的自身反应受体内化，重排后编码并表达非自身反应受体，细胞在阴性选择之前获救，避免被清除或凋亡。受体修正则多见于病毒感染的免疫反应过程中，病毒超抗原可通过两种途径诱导外周成熟T细胞耐受，一个是克隆凋亡或清除，另一个是受体修正。为避免抗原特异性T细胞大量凋亡，细胞修正其受体，转为表达非特异性受体而获救，修正后的受体不再识别耐受原，从而机体对病原微生物不再发生反应。目前已公认受体编辑在胸腺阳性／阴性选择机制和维持自身免疫耐受以及塑造多样性淋巴细胞受体库(repertoire)中发挥了重要作用。而受体修正的研究结果虽然较具争议性，但对于认识和理解自身免疫和淋巴细胞反应亲和力成熟以及肿瘤和病毒感染的免疫逃逸机制等免疫学重大问题则更具潜在意义。理论而言，受体编辑／修正与自身免疫病的关系非常密切，或许在冲破机体自身免疫耐受以及自身免疫病的发生发展过程中占据了重要的角色。首先，对于机体自身免疫耐受而言，受体编辑是一柄双刃剑，一方面它通过编辑淋巴细胞表面受体改变自身抗原特异性使细胞在克隆选择之前获救，细胞可以免于凋亡或清除；另一方面这种看似较为经济的方式，却造成了部分T／B细胞因此而成为更严重的潜在自身反应细胞。比如在aβT细胞中，TCRβ基因遵循等位排斥原则，一个细胞表面仅表达一个功能性TCRβ链。但该原则并不适用于TCR a基因，表达了第一次重排的a链后重排并未终止，仍然持续发生受体编辑，由于缺乏等位基因排斥，重排可能发生于另一条染色体上，导致单个T细胞包含两套重排的TCR a基因，甚至同时表达两种TCRs，其潜在危险是致使自身反应TCR逃避胸腺阴性选择。因为选择可发生于细胞表面受体中的任何一个，而未经选择的另一个TCR则可能具有自身反应性。携带自身反应受体的T细胞进入外周将发育成为自身攻击性T细胞，成为日后发展自身免疫病的“隐患”。其次，外周成熟T／B细胞与肿瘤、病毒等反应后发生受体修正，由于外周缺乏中枢“阴性选择”的微环境，这种重排形成的TCR／BCR若具有自身反应性，则可能无法消除。因此，TCR／BCR的二次重排，在维持自身免疫耐受或在应答肿瘤和病毒感染、增加T／B细胞受体库而避免凋亡和清除的同时，却不可避免的出现副作用----潜在的或更为严重的自身反应性。不仅理论上受体编辑与自身免疫联系紧密，在实际研究中也发现，自身免疫病患者体内的抗原受体编辑非常活跃。在炎症活动期系统性红斑狼疮病人外周血以及类风湿性关节炎病人的滑膜组织中可检测到RAGs和TdT的表达，且狼疮患者比正常人存在更多的轻链编辑。在有自身免疫倾向的NZB小鼠和MRL小鼠中也有高水平的RAGs mRNA表达和Ig基因重组的现象。而且不论是人类SLE还是动物模型都比正常对照组存在更多D-D融合、二次D-JH重排、VH置换之类异常重排，这些异常的重排往往能够提高抗体或抗原受体与DNA或核酸的结合亲和力。在非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠模型中发现外周自身免疫T细胞a链的重排以及病毒超抗原诱导TCR a链位点的断裂和第二次重排，则提示TCR二次重排可能是产生自身免疫T细胞的一种途径。诚然，TCR二次重排与自身免疫病、肿瘤、病毒感染等临床免疫相关疾病关系密切，研究TCR二次重排的理论意义和潜在临床应用价值重大，但因其涉及的机制非常复杂，目前并未取得突破性进展，。大多受体修正的结果来源于基因敲除鼠和转特异性TCR基因动物的实验，这应用到正常的生理背景中具有明显的局限性。人的外周TCR二次重排研究则多发现于一些“特殊的T细胞亚群”或一些“特殊部位”的T细胞，并且倾向认为这些重排的证据来源于刚从胸腺迁出的未发育成熟的初始T细胞尚未完全关闭的一次重排，而并非重新激活开放引起的二次重排。TCR二次重排究竟是一个普遍存在的现象，还是仅发生于特定发育阶段或特定T细胞亚群或特定解剖学部位或特定疾病背景下的一个特殊现象?其产生的机制和意义是什么?与疾病的发生发展有何关系?在详细机制的研究无法获得突破的前提下，开展大量临床疾病监测或许能为受体编辑／修正的研究开辟新的局面。目的整合已有的工作基础，完善TCR二次重排的研究方法和体系，为检测系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)患者外周血单个核细胞(peripheralblood mononuclear cell，PBMC)中aβT细胞TCR二次重排研究提供可靠的监测技术和有效的分析手段：检测SLE患者外周血重排主要调节蛋白RAG1／RAG2、末端脱氧核糖核酸转移酶(terminal deoxynucleotidy transferase，TdT)、Ku70&Ku80连接蛋白mRNA的表达，巢式PCR(nest-PCR)方法检测SLE中aβT细胞TCR BD-BJ基因重组伴随产物TCR重排删除环(TCR excision circles，TRECs)、连接介导PCR方法(Ligation-Mediated-PCR，LM-PCR)检测SLE中aβT细胞TCR BD-BJ基因重组信号序列(recombination signal sequences，RSS)断裂末端。为TCR二次重排与疾病关系、疾病中TCR aβT细胞的免疫应答机制、SLE的发病机制研究提供基础；更重要的是，为T细胞相关临床疾病提供新的研究平台。检测SLE患者PBMC中aβT细胞TCR 32 AV家族和24 BV家族的表达，结合监测人TCR CDR3谱系漂移的免疫扫描谱型分析技术(immunoscopespectratyping technique)监测SLE完整的a和β链双链TCR CDR3的多态性和长度分布，动态监测不同病程CDR3谱型的变化，筛选疾病相关的单／寡克隆增生T细胞家族，测序鉴定其TCR CDR3区基因序列并模拟出其蛋白质叁维结构，为筛选具代表性的自身反应T细胞家族进行体外二次重排研究打下基础，为SLE的诊断、治疗研究和疫苗的研制提供数据。方法(1)以胎儿胸腺组织、T淋巴细胞白血病细胞株Jurkat和正常人外周血PBMC为研究对象(可分别作为SLE样本的阳性、阴性对照。参照文献和本实验室以前的研究，Jurket的重排体系是开放的，可与胸腺一同作为阳性对照)。合成参与基因剪切和连接的主要调控蛋白：RAG、TdT、Ku70、Ku80的上下游引物，扩增并检测各蛋白mRNA的表达；合成与双链RSS平断裂末端相接的特殊接头BW Linker及其引物，提取各样本的总DNA与BW-Linker连接，在人TCRBD1和BD2基因的5’端前和3’端后分别合成两条内、外侧引物，巢式PCR扩增，阳性产物测序鉴定；在TCR BJ1和BJ2基因5’端各合成3条上游引物，TCR BD1和BD2基因3’端各合成2条下游引物，PCR扩增BD1与6个BJ1片段、BD2与7个BJ2片段重排时可能形成的TCR BD-BJ信号结合T细胞受体删除DNA环(signal joint TCR excision DNA circles，sjTRECs)。(2)以Jurkat和正常人PBMC为研究对象，提取各样本总RNA，优化并合成人aβT细胞TCR 32 AV(a chain variable gene，AV)家族和24 BV(βchainvariable gene，BV)家族上游引物和共用AC(a chain constant gene)和BC(βchainconstant gene)下游引物(下游引物内侧端带FAM标记)，扩增并检测样本各AV、BV基因家族CDR3区段cDNA，采用免疫扫描谱型分析技术，分析单克隆水平Jurkat细胞TCR a和β链的基因家族及其CDR3区基因序列和群体多克隆水平正常人PBMC中TCR aβT细胞的CDR3谱型。(3)以明确诊断的20例临床SLE患者PBMC为研究样本，提取总RNA，逆转录成cDNA，扩增并检测重排主要调节蛋白RAG、TdT、Ku70、Ku80等mRNA的表达；提取各样本的总DNA与BW-Linker连接，再分别以人TCR BD1和BD2基因的5’端前和3’端后的内、外侧引物与BW-Linker引物，进行巢式PCR，琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物；提取各样本的总DNA，巢式PCR扩增BD1与6个BJ1片段、BD2与7个BJ2片段重排时可能形成的sjTRECs。(4)以明确诊断的20例临床SLE患者PBMC，和3例不同病程时收集的患者PBMC为研究样本，提取总RNA，逆转录成cDNA，PCR扩增各32 AV家族和24 BV家族CDR3区基因，采用免疫扫描谱型分析技术检测aβT细胞TCRCDR3多态性和长度分布，并选取部分单／寡克隆增生的TCR AV和BV家族RT-PCR产物进行测序，生物信息学分析和模拟TCR蛋白质叁维结构。结果(1)在胸腺组织、Jurkat细胞中均检测到RAG1和RAG2 mRNA的表达，正常人PBMC仅检测到RAG1mRNA，对Jurkat细胞RAG1和RAG2 RT-PCR产物测序结果表明，序列与GeneBank报道序列完全一致。胸腺组织、Jurkat细胞的TdT、Ku70、Ku80 mRNA均在特定位置出现片段大小对应的特异条带，正常人PBMC除未检测到TdT外，其余均检测到。在胸腺DNA中，同时检测到BD1RSS、BD2 RSS 5’端和3’端四个断端，而在Jurkat DNA中检测到BD2 RSS 5’端和3’端两个断端，正常人PBMC未检测到RSS断端。胸腺DNA中检测到BD1-BJ1 sjTRECs S1、S2、S4、S5、S6以及BD2-BJ2 sjTRECs S1、S2、S4、S5。PBMC中检测到BD1-BJ1 sjTRECs S1、S4以及BD2-BJ2 sjTRECs S2。Jurkat细胞中检测到BD2-BJ2 sjTRECs S1、S5。(2)Jurkat细胞TCR 32AV和24BV家族RT-PCR产物2％琼脂糖凝胶电泳显示仅AV1.1和BV8家族出现特异条带；6％变性聚丙酰胺凝胶电泳分析AV1.1和BV8家族产物均显示单一条带，进一步自动扫描AV1.1和BV8基因家族显示均呈单峰；正常人PBMC中TCR AV和BV各家族产物在2％琼脂糖凝胶上均显示模糊条带，6％测序胶电泳分析各家族产物均显示8条或8条以上条带，自动分析峰型，各家族均为8个或8个以上中间高两端低的高斯(Gaussian distribution)分布钟型峰图，相邻两条带大小相差约3bp，各家族CDR3表达频率接近，但呈现不同的多态性和长度分布；(3)20例患者中均检测到RAG1、RAG2、Ku70、Ku80 mRNA的表达，16例患者中检测到TdT mRNA的表达，在两例患者中检测到BD1 RSS 3’和5’断端。20例患者中均检测到sjTRECs环，多数检测到的为BD1-BJ1 sjTRECs S1、S2、S4和BD2-BJ2 sjTRECs S1、S2、S4。20例SLE患者PBMC中TCR 32AV和24BV家族RT-PCR产物，多数在2％的琼脂糖凝胶电泳图上显示一条模糊的条带，部分家族未显条带；在6％变性聚丙酰胺凝胶电泳图上，多数家族显示8条以上条带，部分家族显示少于8条带或未显带；利用GeneScan 672软件进一步自动分析显示20例患者的CDR3谱型，呈现单峰、寡峰、偏峰，部份家族表达频率极低或缺失；某些家族出现单／寡克隆性增生的频率较高，例如TCR AV8，AV14，AV23，AV30，AV31，BV2，BV8，BV11，BV14，BV16，BV19和BV24家族；比较病人不同病程检测到的CDR3谱型，发现随着疾病的进展，出现了不同的单／寡克隆增生家族。对SLE患者部分单／寡克隆扩增的家族进行测序分析，发现存在GGX氨基酸保守序列和高频出现的Ja34、Jβ2s1和Jβ2s7基因片断。结论(1)我们采用的检测RAG1、RAG2、Ku70、Ku80、TdT这几种重排主要调控蛋白mRNA表达的RT-PCR方法、检测重组中间产物RSS断端的LM-PCR方法以及检测重排删除环sjTRECs的巢式PCR方法，经实验证明稳定、可靠，可作为研究SLE aβT细胞TCR二次重排的研究平台。监测人aβT细胞TCRCDR3谱系漂移的免疫扫描谱型分析技术，是一种相对简便、可靠、灵敏度高的特异T细胞研究技术，不仅能监测单克隆细胞TCR的分子特征和变化，还能监测群体多克隆样本中各家族CDR3表达和频率的动念变化并筛选单／寡克隆增生的特异T细胞进行测序和生物信息学分析，这些重排相关的检测技术能为TCR二次重排与肿瘤、自身免疫病等的关系研究提供方法；(2)在SLE患者PBMC中检测到RAG2、TdT mRNA的表达，在两例患者中均检测到BD1 RSS 3’、5’断端，这有别于正常人PBMC中的检测结果。进一步提示，SLE患者外周很可能存在TCR二次重排。然而由于临床采集的样本量、时间、经费、实验条件以及自己早期对课题的把握不足等诸多原因，我们目前所做的工作非常粗浅。进一步的工作需要开展SLE体内和体外二次重排研究两条线路。在体内研究方面需扩大样本，对重组参与蛋白进行mRNA和蛋白质两个水平的定量分析；对sjTRECs进行测序和荧光定量分析；对检测到的RSS断端进行序列鉴定，同时设置好大样本的正常人对照，使得量化对比的数据具备统计学意义。在体外研究方面要分两个部分进行，首先依据我们对SLE患者TCR CDR3谱型的监测，筛选出具有代表性的单克隆自身反应T细胞家族，利用家族特异性单抗将其分选出来(目前国外已有TCR 24个Vβ家族单抗出售)，在体外进行重排的检测，其次，在体外建立SLE患者自身反应细胞系，尝试体外人工诱导二次重排，从单克隆细胞水平监测TCR基因和蛋白的变化，并对信号转导途径进行实时监测。实验研究将为SLE的免疫发病机制研究提供新的方向，更重要的是，为T细胞相关临床疾病提供新的研究平台。(3)SLE患者PBMC中T细胞存在明显单寡克隆增生和偏峰现象，单／寡克隆增生T细胞α和β链CDR3区有着不同的序列和结构，提示应答T细胞TCR的分子特征与自身抗原和个体HLA多样性有关，不同病人存在相同的单寡克隆增生家族和保守序列以及高频使用的J基因片断，这种限制性使用的家族和片断可能与同类的或相似结构的自身抗原相关。随着疾病的进展，在不同病程中监测到T细胞α和β链各家族CDR3谱型均有不同程度的改变，提示在不同的炎症活动期存在不同的单寡克隆家族行使自身反应功能。对比20例病人的CDR3谱型，发现SLE DAI评分越高(表明疾病的活动度越强，病情越重)
李伟, 施炜星, 杜盈, 王倩, 杨春霞[10]2017年在《T细胞受体基因转导T细胞免疫治疗技术的研究进展》文中指出T细胞受体(T cell receptor,TCR)基因转导的T细胞疗法(TCR-T)是目前发展较快的一种新的过继性细胞免疫疗法,该方法主要是将肿瘤特异的TCR基因通过各种载体转入自体或异体的淋巴细胞中,再回输至患者体内以达到杀伤肿瘤细胞的目的。因此,肿瘤特异的高亲和性的TCR基因的获取是提高TCR-T细胞治疗的一个重要因素,TCR基因的高水平表达和TCR双链的正确配对也是确保TCR能够在T细胞表面发挥正常抗原识别功能的必要条件。现对TCR的表达及调控机制、TCR基因转导和亲和力的优化策略,以及TCR-T在肿瘤治疗临床试验中的进展与所面临的问题做了详细的阐述。
参考文献：
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[10]. T细胞受体基因转导T细胞免疫治疗技术的研究进展[J]. 李伟, 施炜星, 杜盈, 王倩, 杨春霞. 生命科学. 2017