长沙医学院
【摘 要】目的：通过观察坤泰胶囊对围绝经期（更年期）小鼠的白血病抑制因子（Leukaemia inhibitory factor，LIF）和增殖细胞核抗原（proliferrating cell nuclear antigenting，PCNA）表达以及子宫内膜厚度的影响，来对其进行评估，并了解LIF和PCNA蛋白的多种作用，为临床的该药物使用提供实验依据。方法：选用20只8～10个月已生育过的雌性昆明鼠和5只八周左右未受孕的雌性昆明鼠。分组：通过完全随机分组法将20只生育后的种鼠随机分为药物组（高浓度组、中浓度组和低浓度组）和对照组，5只未生育雌鼠设为青年组。药物组分别灌服坤泰胶囊180mg/100g、90mg/100g、45mg/100g，每天灌服一次连续九天，对照组和青年组每天灌服同等体积蒸馏水。结果：各年龄段小鼠一般情况正常，各组小鼠的LIF和PCNA蛋白表达有明显差异。
【关键词】坤泰胶囊；围绝经期；白血病抑制因子；增殖细胞核抗原
依据近年来的国内外研究发现[1][2]在子宫内表达的LIF和PCNA蛋白对提高妊娠率起到重要作用。目前对女性生殖方面的研究大多集中在处于优育年龄却无法正常受孕的女性身上，却忽略了越来越多因我国二胎政策的开放而开始预备生育二胎的大龄女性。此外，坤泰作为一种中成药，在治疗更年期方面一直倍受瞩目[3]。本实验将坤泰胶囊与大龄女性的备孕结合起来，探索坤泰胶囊在治疗更年期症状之余，更是否具有改善子宫受孕环境的功能，为临床的使用提供更多理论依据。
1.材料
1.1实验仪器
1.3实验动物
雌性昆明种小鼠，月龄8～10个月、体质量45～65g。动物合格证号：43004700021688雌性昆明种小鼠，月龄2～3个月左右、体质量35～40g，动物合格证号：43004700021689 所有动物均由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，许可证号：SCXK（湘）2011-0003。
2.方法
2.1建模：选用20只8～10个月已生育过的雌性昆明鼠和5只八周左右未受孕的雌性昆明鼠。通过完全随机分组法将20只生育后的种鼠随机分为药物组（高浓度组、中浓度组和低浓度组）和对照组，5只未生育雌鼠设为青年组。药物组分别灌服坤泰胶囊180mg/100g、90mg/100g、45mg/100g，每天灌服一次连续九天，对照组和青年组每天灌服同等体积蒸馏水。于末次给药1h后，一同处死，随后开腹取出子宫，生理盐水冲洗干净，放入10%的甲醛溶液中固定，存放在4℃冰箱中。
2.2制备标本：
固定：将雌鼠的子宫置于10%甲醛溶液内固定24小时。
脱水：将固定过的雌鼠子宫用自来水冲洗干净，采用酒精梯度法进行脱水：依次经过70%的酒精30分钟、80%的酒精30分钟、90%的酒精30分钟、100%的酒精30分钟。
透明：脱水后将雌鼠子宫顺次放入二甲苯和100%酒精的混合液（按1：1配置）内30分钟、二甲苯-Ⅰ30分钟、二甲苯-Ⅱ30分钟，直至组织变为透明。
浸蜡：已透明好的子宫组织依次放入石蜡杯Ⅰ1小时、石蜡杯Ⅱ1小时、石蜡杯Ⅲ1小时，为使温度持续维持在57℃，整个过程均在熔蜡箱中进行。
包埋：把浸过蜡的子宫组织置于包埋匣中，并做标记，倒上溶化的石蜡，浸过子宫组织，等石蜡凝固后倒出蜡块。
2.3免疫组化
1）60℃烤片30~60 min；
2）切片脱蜡至水：先将切片置于二甲苯中10 min，2次。然后依次在100%，95%，85%和75%乙醇，每级放置5 min。再用蒸馏水浸洗5 min；
3）热修复抗原：将切片浸入0.01M 枸橼酸盐缓冲液（pH6.0），电炉或微波炉加热至沸腾后断电，间隔8 min后，反复6次。冷却后0.01M PBS（pH7.2~7.6）洗涤3 min x 3次；
4）加入3%H2O2，室温10 分钟以灭活内源性酶。PBS冲洗3 min x 3次；
5）孵育一抗：滴加适当稀释的一抗（PCNA、LIF），4℃过夜。PBS冲洗5 min x 3次；
6）孵育二抗：滴加50~100 μL抗兔、兔IgG抗体-HRP多聚体，37℃孵育30 min，PBS冲洗5 min x 3次；
7）DAB显色：滴加预制好的显色剂DAB工作液50~100 μL，室温孵育1~5 min，镜下控制反应时间，蒸馏水洗涤；
8）苏木素复染5~10 min，蒸馏水冲洗，PBS返蓝；
9）各级酒精（60-100%）脱水，每级5 min。取出后置于二甲苯10 min，2次，中性树胶封片、显微镜观察。
2.4数据分析
采像为普通的电脑采像；
图像分析软件为IPP（Image-Pro-Plus）
[注：平均IOD：视野下的阳性表达部位的累积光密度和视野下样品面积的比值（针对400倍视野的图）
一般平均IOD是针对非纯核表达指标的阳性分析。
阳性率：视野下的阳性表达的细胞核个数和视野下的细胞核总数的比值（针对400倍视野的图）
一般阳性率是针对纯核表达指标的阳性分析。]
2.5指标相关实验条件
4.实验结论
1）大龄雌鼠与青年雌鼠相比，PCNA与LIF蛋白表达水平有所降低。
2）坤泰胶囊能显著提高围绝经期雌鼠PCNA与LIF蛋白的表达水平，且加大坤泰胶囊剂量提高更明显。
5.讨论
1）坤泰胶囊对围绝经期综合征的作用效果
坤泰胶囊含有熟地黄、白芍、黄连、阿胶、黄苓、茯苓，具有滋阴降火、调节阴阳、安神除烦的作用，标本兼治，改善各种更年期症状[4]。而有实验显示[5]，坤泰胶囊对更年期雌鼠不仅具有激素水平双向调节作用，而且不改变其内源性激素水平，对围绝经期综合征也有很好的改善作用。
2）坤泰胶囊对围绝经期雌鼠PCNA蛋白表达的影响
近年来研究发现，PCNA是反映细胞增殖活性的标志物之一，作为DNA多聚酶δ的辅助蛋白，在DNA复制中起重要作用，其是一种酸性核蛋白，分子量为36KD[6]。Jeff R等的研究发现，PCNA基因在围着床期子宫内膜中呈上调表达，推测PCNA不仅参与了子宫内膜的增值过程，还在受精卵粘附和侵入子宫内膜的过程中参与了子宫内膜的蜕膜化过程[7]。本实验研究结果示分析显示，PCNA蛋白在对照组和药物组小鼠子宫内膜的表达显著低于青年组，说明说明围绝经期可影响子宫内膜中PCNA的表达。加坤泰胶囊后，小鼠子宫内膜中PCNA蛋白的表达明显增加，说明坤泰胶囊能显著改善围绝经期对子宫内膜造成的负面影响，且增加坤泰胶囊的剂量，其改善效果也随之增加。
3）坤泰胶囊对围绝经期雌鼠LIF蛋白表达的影响
LIF是一类具有多种生物学功能的白细胞介素6（IL-6）家族中的一个多性能细胞因子，在不同的组织中发挥着不同的生物学活性[8]。而近年来，国内外对LIF的研究则着重其在协助子宫内膜发育成有利胚胎着床的状态时，起着的重要作用[9]，以提高不孕患者的妊娠率。本实验研究结果示分析显示，LIF蛋白在对照组和药物组小鼠子宫内膜的表达显著低于青年组，说明说明围绝经期可影响子宫内膜中LIF蛋白的表达。加坤泰胶囊后，小鼠子宫内膜中LIF蛋白的表达明显增加，说明坤泰胶囊能显著改善围绝经期对子宫内膜造成的负面影响，且增加坤泰胶囊的剂量，其改善效果也随之增加。
参考文献：
[1]Ivanov PD，Komsa-Penkova RS，Konova EI，et al.Polymorphism A1/A2 in the cell surface integrin subunit β3 and disturbance of implantation and placentation in women with recurrent pregnancy loss[J].Fertil Steril，2010，94（7）：2843-2845.
[2]Peyghambari F，Salehnia M.The Correlation between the Endome-trial Integrins and Osteopontin Expression with Pinopodes Development in Ovariectomized Mice in Response to Exogenous Steroids Hormones[J]，Iranian Biomedical Journal，2010，14（3）：109.
[3]Dobos G，TaoⅠ.The Model of Western Integrative Medicine：the Role of Chinese Medicine[J].Chin J Integr Med，2012，18（9）：643-651.
[4]陈蓉，林守清，杨欣，等.坤泰胶囊与戊酸雌二醇对更年期综合征各种症状的不同疗效分析[J].医学综述，2013，19（10）：1869-1872.
[5]段燕康，李芳，李进东，魏茂陈.坤泰胶囊对更年期雌鼠激素水平及围绝经期综合征的影响[J].中国医院药学杂志，2013，34（6）：435.
[6]Takahshi H，Strutton GM，Parsons PG，et al.Determination of proliferating fraetions in malig-nant melanomas by anti-PCNA/cyclin monoclonal antibody[J].Histopathology，1991；18（3）：221-227.
[7]Ivanov PD，Komsa-Penkova RS，Konova EI，et al.Polymorphism A1/A2 in the cell surface integrin subunit β3 and disturbance of implantation and placentation in women with recurrent pregnancy loss[J].Fertil Steril，2010，94（7）：2843-2845.
[8]Takhashi Y，Takahashi M，Carpino N，et al.Leukemia inhitory factor regulates trophoblast giant cell differentiation via Janus Kinasel-Signal Transducer and activator of transcription 3-suppressor of cytokine signaling 3 pathway.Mol Endocrinol，2008，22：1673-1681.
[9]Peyghambari F，Salehnia M.The Correlation between the Endome-trial Integrins and Osteopontin Expression with Pinopodes Development in Ovariectomized Mice in Response to Exogenous Steroids Hormones[J]，Iranian Biomedical Journal，2010，14（3）：109.
论文作者:周筱茹,彭子珍,林泽全,田彬,钱姗姗
论文发表刊物:《航空军医》2016年第25期
论文发表时间:2017/1/9
标签：胶囊论文; 绝经期论文; 蛋白论文; 子宫内膜论文; 小鼠论文; 子宫论文; 昆明论文; 《航空军医》2016年第25期论文;