成胜权[1]2004年在《Survivin基因对人肝癌细胞增殖和凋亡作用机制的研究》文中研究表明原发性肝细胞肝癌(HCC)是世界范围内流行率和死亡率都很高的恶性肿瘤之一，与世界其他国家相比，我国HCC死亡率居各国之首，但是肝癌的治疗一直是一个棘手的问题。目前肝癌治疗的主要手段是手术切除，但手术切除只适用于部分早期患者，而且手术后的高复发率影响最终的疗效。由此可见，对HCC发病机制和治疗手段的研究是当务之急。 Survivin是近年发现的细胞凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein, IAP)家族的一个新成员，它主要表达于发育中的胚胎组织以及人类常见的恶性肿瘤组织，而不见于终末分化的成熟组织。研究发现，Survivin对细胞凋亡和细胞分裂周期有双重调控作用：Survivin直接作用于caspase，主要抑制凋亡终末效应器caspase-3和caspase-7的活性或干扰caspase-9的活性，阻断各种刺激诱导的下游细胞凋亡的共同通路；Survivin特异性地在细胞周期G2／M期表达，通过与细胞有丝分裂纺垂体的微管结合，参与对细胞基因的转录调控；Survivin可以直接抑制caspase-3活性以降低肿瘤细胞对许多化疗药物的敏感性。由于Survivin选择性的组织细胞分布特征以及抑制细胞凋亡特殊的作用机理，可能成为肿瘤诊断的标志物以及肿瘤基因治疗的新靶点。 研究证明，HCC的发生发展涉及多种癌基因的激活和抑癌基因的失活过程，有针对性地选择在HCC发生发展过程中发挥重要作 第四军医大学博士学位论文.亩亩..亩....口目西面.百面面面面面.面画口口.画.面面面面面面面面面面面面面面面百.面面面百面面面面口肠亩.亩百.口...口...亩百日亩亩亩百百亩亩亩百亩亩草用的癌基因或抑癌基因，利用反义寡核昔酸技术、基因剔除、基因替代以及基因转导等技术，抑制或敲除癌基因的表达，以期达到基因治疗HCC的目的。 肿瘤凋亡抑制基因靶向治疗的优点是可以促进肿瘤细胞凋亡并抑制其增殖，而对正常组织几乎没有不良影响。RNA干涉(RNAint。rference，RNAi)能够特异、有效地降解mRNA，引起转录后水平的基因沉默，在小鼠和人的体外培养细胞中成功阻断了基因的表达，实现了细胞水平的基因敲除。利用RNAi技术能否在体内、体外成功敲除人肝癌细胞中Survivin基因的表达，诱导肝癌细胞凋亡、抑制肝癌细胞增殖是本实验的主要内容。 研究目的:探讨Survivin基因在人肝癌细胞增殖和细胞凋亡中的作用机制，为人肝癌的基因治疗提供理论依据。 实验方法: 1、应用SABC免疫组织化学染色、RT一pCR和western b10t等技术对87例HCC及其50例癌旁肝组织石蜡标本、8例HCC组织和4种人肝癌细胞系(HepGZ、SMMC一7721、HHCC、HCC一9724)中Survivin、P53、Bel一2蛋白和Survivin mRNA以及细胞凋亡进行检测。 2、通过脂质体介导将Survivin基因转染人肝癌细胞系HopGZ中，建立稳定表达survivin基因的HepGZ细胞模型(S竹一HepGZ);运用SABC免疫组织化学染色、RT一PCR、流式细胞分析(FCM)以及生长曲线等检测转染前后HepGZ中Survivin蛋白及其mRNA的表达、细胞周期和细胞生长的变化。 3、通过脂质体介导将Survivin基因的dsRNAi真核表达载体转染人肝癌细胞系SMMC一7721，建立dsRNAi的SMMC一7721细胞模型(S一RNAi一7721);运用SABC免疫组织化学染色、RT一PCR、Westernblot、FCM分析、TUNEL技术、透射电镜、DNA Ladder分析以及生长曲线等检测转染前后S翩C一7721中Survivin蛋白及其mRNA的表达、细胞周期和细胞凋亡、细胞增殖以及细胞生长的变化。 4、以BALB/c裸鼠为研究对象，采用皮下注射H即G2、Svv一HepGZ和S枷C一7721、S一刚Ai一7721细胞悬液，建立肝癌细胞 第四军医大学博士学位论文币亩亩.口.亩百百.亩亩亩亩亩亩亩亩亩亩面面面面面面面面.口国面面面面面面亩百口百目面.面面面面口.面面面面面百西面亩亩.亩.面......口亩亩百亩亩..百亩亩亩亩.百.亩口的裸鼠动物模型;通过测量和称重等方法观察肿瘤形成和肿瘤的生长状况;采用SABC免疫组织化学染色和RT一PCR检测肿瘤组织Survivin蛋白及其mRNA的表达。 5、应用Western blot、 TUNEL技术、DNA Ladder分析和FCM分析等检测抗肿瘤药物表阿霉素在相同浓度(10 pg/ml)不同时间作用于HepGZ、SVV一HepGZ和SMMC一7721、S一RNAi一7721细胞后，Sury ivin蛋白及其mRNA的表达以及细胞周期和细胞凋亡的变化。 实验结果: 1 .Survivin基因在HCC组织和人类肝癌细胞系表达上调，其表达与患者年龄、性别、肿瘤大小、有否转移、Bd一2的表达、组织分化程度及临床分期等均无相关关系，而与突变型P53的表达密切相关。 2.转染Survivin基因的HepGZ细胞出现了Survivin蛋白及其mRNA的表达，成功建立了稳定表达Survivin基因的HepGZ细胞模型，该细胞模型表现出明显的增殖活性。 3.转染Survivin基因dsRNAi的S枷C一7721细胞，Survivin蛋白及其mRNA表达消失，成功建立了稳定表达S盯vivin基因dsRNAi的SMMC一7721细胞模型，该细胞模型表现为Survivin基因在蛋白水平和转录水平表达受阻，出现细胞凋亡的典型特征，细胞生长明显受抑。 4.转
胡江[2]2015年在《生存素基因沉默调控喉鳞癌细胞辐射敏感性研究》文中认为背景：喉鳞状细胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma, LSCC),占所有癌症的1.5%以及喉癌的绝大部分(约96%),是头颈部最常见的恶性肿瘤之一,近年来,喉鳞状细胞癌的发病率正在逐渐增加。放疗在喉癌的治疗中起着重要作用,特别是对早期阶段,这被认为是有效的治疗方式。早期的喉癌患者通常能够通过手术或放疗治愈,但是,进展期不能手术的晚期喉癌病人与预后不良有关。此外,尽管包括手术治疗、放疗和化疗在内的诊断和治疗策略有所进展,但是在过去叁十年里,喉鳞状细胞癌的临床治疗结果尚未明显改善,这很大程度与肿瘤的复发、转移以及抗放化疗敏感性有关。生存素(Survivin)基因位于人类染色体17q25,由单一基因编码(距离端粒的位置约为3%),是凋亡抑制蛋白(IAP)家族中最小的成员,相对分子质量为16.5 kDo Survivin抑制线粒体凋亡途径的功能是通过其单一的重复(BIR)域完成的。但是由于Survivin在细胞周期中的G2/M期表达,支持细胞的快速分裂,许多学者认为,Survivin基因的主要功能在于控制细胞分裂,而不是抑制细胞凋亡。此外,除了睾丸,胸腺和胎盘外,Survivin通常在大多数正常成人组织表达水平极低。但在胎儿发育过程中,以及包括喉癌在内的多数肿瘤中,生存素广泛表达。近年来的研究发现,Survivin与肿瘤细胞的凋亡密切相关,但是,Survivin在喉鳞状细胞癌的放疗治疗中的相关作用未见报道,通过研究Survivin在喉鳞状细胞中的作用机制,可以为临床研究打下坚实的基础。实验目的：本实验旨在探讨沉默Survivin基因和辐射处理联合使用对喉鳞状细胞癌细胞系的增殖和凋亡的影响,以挖掘Survivin在喉鳞状细胞癌发生发展中可能扮演的角色,为喉鳞状细胞癌的治疗、防治提供新的策略。实验方法：本研究首先将沉默基因所用的shRNA序列插入到含GFP的质粒载体pGCsi-H1中,构建pGCsi-H1-shRNA和pGCsi-Hl-control(对照)两种质粒载体。然后采用MTS细胞增殖检测法分析辐射剂量(2Gy、4Gy、8Gy、12Gy)条件下处理Hep-2细胞后细胞的增殖情况以及沉默Survivin基因后,辐射剂量(2Gy、4Gy、8Gy、12Gy)条件下处理Hep-2细胞24h、48h、72h后细胞辐射敏感性的改变以及细胞增殖的情况；接着,采用流式细胞技术检测沉默Survivin基因后,8Gy辐射剂量条件下处理Hep-2细胞24h后细胞周期分布以及细胞凋亡的变化情况；最后检测8Gy辐射剂量条件下沉默Survivin基因的荷瘤小鼠的肿瘤生长。比较试验各组肿瘤体积的大小。实验结果：本研究结果显示,Westemblot和qRT-PCR法检测发现Survivin-shRNA转染后能明显减少人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞中survivin基因mRNA和蛋白的表达水平(P<0.01); MTS细胞增殖实验检测发现辐射(2Gy、4Gy、8Gy、12Gy)条件下处理Hep-2细胞对细胞生长有抗增殖作用,并且呈现时间-剂量依赖性；沉默Survivin基因后,辐射(2Gy、4Gy、8Gy、12Gy)处理Hep-2细胞24h、48h、72h后,沉默Survivin基因组相对于对照组喉鳞状细胞癌的细胞生存率明显降低(P<0.05)；流式细胞技术分析发现辐射(8Gy)处理Hep-2细胞24h后,Survivin基因沉默组抑制了辐射诱导的G2期细胞阻滞(P<0.01),增加了G1期细胞比例(P>0.05)。辐射和Survivin基因沉默均诱导了细胞凋亡,但Survivin基因沉默与辐射协同会诱导更大程度的凋亡(P<0.01)。裸鼠成瘤实验发现辐射(8Gy)处理荷瘤小鼠(Hep-2细胞移植瘤)24h后,沉默Survivin基因小鼠组的肿瘤生长程度较空白组明显受到抑制(P<0.01)。实验结论：1)辐射处理对喉鳞状细胞癌的细胞生长有抗增殖作用,并且呈现时间-剂量依赖性；2)沉默Survivin基因具有提高喉鳞状细胞癌细胞辐射敏感性的作用,辐射处理条件下,沉默Survivin基因组相对于对照组喉鳞状细胞癌的细胞生存率明显降低；3)Survivin基因沉默组抑制了辐射诱导的G2期细胞阻滞(P<0.01),增加了G1期细胞比例(P>0.05)。辐射和Survivin基因沉默均诱导了细胞凋亡,但Survivin基因沉默与辐射协同诱导更大程度的凋亡(P<0.01)。4)辐射处理条件下,沉默Survivin基因荷瘤小鼠组的肿瘤生长程度较对照组明显受到抑制。
许传铭[3]2013年在《人野生型Mst1基因抑制肿瘤生长的实验研究》文中研究说明哺乳动物不育系20样激酶1(mammalian sterile20-like kinase1, Mst1)，又称丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶4(serine/threonine-protein kinase4, STK4)和应激应答激酶2(kinase responsive to stress2, KRS2)，是果蝇Hippo基因在哺乳类中的同源基因，编码丝氨酸/苏氨酸激酶，主要参与细胞生长、增殖、凋亡以及器官大小等的调控，具有抑癌作用。目的：从分子、细胞及动物水平探讨Mst1基因的抑癌作用及其部分的分子机理，模拟肿瘤的基因治疗，旨在为肿瘤的基因治疗进行一些有益的尝试并提供有参考意义的实验数据。方法：1、人野生型Mst1基因真核表达载体的构建及鉴定将Mst1cDNA连接至真核表达载体pEGFP-N1中，用卡那霉素抗性筛选，菌落PCR及测序并序列比对对重组质粒进行鉴定。2、高表达Mst1基因对人肝癌细胞HepG2作用的体外实验研究用PolyJetTM体外DNA转染试剂介导pEGFP-N1-Mst1转染人肝癌细胞HepG2，应用MTT比色法、流式细胞术及Hoechst33342染色法观察高表达Mst1对细胞增殖与凋亡的影响；RT-qPCR检测Mst1、CTGF、AREG和Survivin mRNA的转录水平，Western blot方法检测MST1、YAP、Phospho-YAP(Ser127)和Caspase-3蛋白的表达情况，初步探讨Mst1基因在体外抑制细胞HepG2生长的分子机制。另外，我们将MTT比色法、流式细胞术与Western blot方法相结合，初步探讨MST1蛋白的表达和活化与DDP诱导细胞死亡的关系。3、高表达Mst1基因对人非小细胞肺癌生长影响的实验研究用pEGFP-N1-Mst1转染人非小细胞肺癌细胞A549，初步分析细胞凋亡情况及MST1、YAP、Phospho-YAP(Ser127)蛋白和Mst1、CTGF、AREG和SurvivinmRNA的表达水平。用Mst1基因对A549细胞形成的裸鼠移植瘤进行模拟基因治疗，观察移植瘤的生长情况，并用免疫组织化学分析移植瘤中YAP及Phospho-YAP(Ser127)蛋白的表达，初步探讨Mst1基因抑制肿瘤生长的分子机制。结果：1、经菌落PCR、序列测定及比对结果显示成功构建了人野生型Mst1基因真核表达载体pEGFP-N1-Mst1。2、用PolyJetTM体外DNA转染试剂介导pEGFP-N1-Mst1转染人肝癌细胞HepG2，细胞生长抑制率及细胞凋亡率明显升高，且抑制率随处理时间的增加而升高，并且上调MST1的活性片段MST1(amino terminal truncated form, NT)、Caspase-3的活性片段Caspase-3(cleavage, CL)和YAP的磷酸化形式Phospho-YAP(Ser127)水平，显着下调CTGF、AREG和Survivin mRNA表达水平，DDP的干预具有促进MST1功能的效果。经DDP干预， HepG2-MST1细胞的增殖活性显着低于HepG2-Vect细胞(P<0.05)，细胞凋亡率显着高于HepG2-Vect细胞(P<0.05)，HepG2细胞中MST1(NT)和Phospho-YAP(Ser127)的水平都随DDP干预时间的延长而逐渐升高，但MST1和YAP蛋白总量并没有改变。3、转染pEGFP-N1-Mst1的A549细胞凋亡率升高，细胞中MST1(NT)和Phospho-YAP(Ser127)水平升高，CTGF、AREG和Survivin mRNA表达水平下降。应用Mst1基因、DDP和Mst1基因联合DDP的3个治疗组在27天后的平均瘤块体积和重量均显着低于Control和阴性对照组(P<0.01)，平均抑瘤率分别为(32.30±1.87)%、(51.77±3.98)%和(73.01±1.22)%，并伴随着YAP蛋白的胞核阳性的降低，YAP和Phospho-YAP(Ser127)蛋白的胞浆阳性的升高。结论：1、高表达Mst1基因促进HepG2细胞和A549细胞凋亡；2、高表达Mst1基因上调肿瘤细胞中MST1(NT)、 Caspase-3(CL)和Phospho-YAP(Ser127)蛋白的表达水平，下调CTGF、AREG和Survivin mRNA的转录水平，这可能是高表达Mst1基因抑制肿瘤生长的分子机制之一；3、高表达Mst1能够增强HepG2细胞对DDP的化疗敏感性，而DDP处理可促进MST1蛋白的切割活化；4、Mst1基因的表达对人非小细胞肺癌细胞A549移植瘤的生长具有一定的抑制作用，并伴随着YAP(Ser127)蛋白的胞浆水平和磷酸化水平的升高。综上所述，Mst1可能是一个潜在的抗癌靶点。
杨敬敬[4]2009年在《RNA干扰抑制Survivin基因对人肝癌HepG2细胞增殖的影响》文中研究表明目的:观察RNA干扰技术抑制肝癌细胞株survivin基因表达后对HepG2细胞增殖的影响,探讨RNA干扰survivin基因表达治疗肝癌的可行性。方法:构建针对人肝癌HepG2细胞survivin基因3个不同靶序列的shRNA真核表达载体pshRNA-survivin-323/387/52,用Lipofectamine2000脂质体介导转染法转染质粒,分别进行以下的研究:(1)采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测survivin基因mRNA水平,分析RNA干扰的特异性;(2)选择对survivin基因表达抑制作用最强的shRNA载体转染HepG2细胞后,RT-PCR法检测转染后24、48、72 hHepG2细胞survivin的mRNA表达情况,分析RNA干扰的时效性;(3).四甲基偶氮唑蓝法(MTT)检测各组细胞的增殖情况。结果:(1)RT-PCR结果显示:构建的3个shRNA表达载体和对照组相比,pshRNA-survivin-387与对照组比较差异有显着性意义(P＜0.05),而pshRNA-survivin-323/52表达载体对survivin的表达及mRNA水平的影响,与对照组比较差异无显着性意义(P＞0.05)。(2) RT-PCR结果显示:pshRNA-survivin-387表达载体干扰作用于转染后24 h即可出现,48 h达高峰,72 h有所回升;(3) MTT法表明:与对照组比较,实验组(pshRNA-survivin-387转染组)HepG2细胞的OD值在不同时间点均显着降低。结论:构建的针对人survivin基因387位靶序列的shRNA表达载体pshRNA-survivin-387在mRNA水平可显着抑制肝癌细胞survivin基因表达,并显着抑制HepG2细胞的增殖。
王丽[5]2017年在《沉默FBI-1基因对人乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响及其作用机制研究》文中认为目的:本研究旨在探讨人类免疫缺陷病毒短转录诱导物连接因子1(factor that binds to the inducer of short transcripts of human immunodeficiency virus-1,FBI-1)在人乳腺癌细胞中的表达,并研究靶向沉默FBI-1基因表达对人乳腺癌细胞增殖、凋亡的影响及其可能的作用机制。方法:1、应用qRT-PCR和Western blot检测人正常乳腺上皮细胞株MCF-10A、人乳腺癌细胞株MCF-7、MDA-MB-231中FBI-1的表达水平。2、采用sh RNA慢病毒干扰技术构建沉默FBI-1基因的人乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231稳定转染细胞株,并通过qRT-PCR和Western blot方法进行验证。3、采用CCK-8法、平板克隆形成实验检测沉默FBI-1基因对MCF-7、MDA-MB-231细胞增殖能力的影响;通过流式细胞术检测沉默FBI-1基因对MCF-7、MDA-MB-231细胞周期及凋亡的影响。4、通过qRT-PCR和Western blot检测FBI-1沉默前后凋亡相关因子survivin及NF-κBp65的表达水平,初步探讨沉默FBI-1基因对人乳腺癌细胞增殖及凋亡影响的机制。结果:1、qRT-PCR及Western blot法检测发现FBI-1在人乳腺癌细胞株MCF-7及MDA-MB-231中高表达,差异有统计学意义(P<0.05)。2、利用RNAi技术,成功构建沉默FBI-1的慢病毒颗粒并转染人乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB-231,分别采用qRT-PCR和Western blot检测sh RNA的沉默效果。发现Lv-sh FBI-1-2慢病毒颗粒沉默效果最好,差异具有统计学意义(P<0.05),选用Lv-sh FBI-1-2慢病毒感染人乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB-231进行后续实验。3、沉默FBI-1可抑制人乳腺癌细胞增殖能力:CCK8结果显示,沉默FBI-1基因的表达后,沉默组MCF-7/sh RNA-FBI-1细胞的增殖能力较空载组MCF-7/sh RNA-NC细胞及空白对照组MCF-7细胞均明显下降,差异有统计学意义(P<0.05);平板克隆形成实验结果显示沉默组MCF-7/sh RNA-FBI-1的细胞克隆形成率(37.000±4.885)%低于空白对照组MCF-7(59.918±3.214)%和空载组MCF-7/sh RNA-NC(54.753±4.057)%,差异有统计学意义(P<0.05)。MDA-MB-231细胞得出一样的结论。4、沉默FBI-1可阻滞人乳腺癌细胞周期:流式细胞术检测细胞周期结果显示空白对照组MCF-7和空载组MCF-7/sh RNA-NC细胞G0/G1期细胞比例分别为(59.257±2.222)%、(60.210±0.795)%,较沉默组MCF-7/sh RNA-FBI-1细胞(72.993±0.401)%低,同样空白对照组MDA-MB-231和空载组MDA-MB-231/sh RNA-NC细胞G0/G1期细胞比例低于沉默组MDA-MB-231/sh RNA-FBI-1细胞,差异有统计学意义(P<0.05),可见沉默FBI-1基因可阻滞MCF-7、MDA-MB-231细胞于G0/G1期。5、沉默FBI-1可诱导人乳腺癌细胞凋亡:流式细胞术检测细胞凋亡结果显示沉默组MCF-7/sh RNA-FBI-1细胞凋亡率(5.140±0.478)%较空白对照组MCF-7(3.683±0.608)%及空载组MCF-7/sh RNA-NC(2.840±0.221)高,同样沉默组MDA-MB-231/sh RNA-FBI-1细胞凋亡率高于空白对照组MDA-MB-231及空载组MDA-MB-231/sh RNA-NC,差异有统计学意义(P<0.05)。6、相关机制的研究:qRT-PCR结果显示沉默组MCF-7/sh RNA-FBI-1中survivin、NF-κBp65 m RNA的相对表达量低于空白对照组MCF-7与空载组MCF-7/sh RNA-NC,差异具有统计学(P<0.05)。Western blot结果显示,沉默组MCF-7/sh RNA-FBI-1中survivin、NF-κBp65蛋白的相对表达量低于空白对照组MCF-7及空载组MCF-7/sh RNA-NC,差异具有统计学意义(P<0.05)。MDA-MB-231细胞得出相同结论。结论:1、人乳腺癌细胞中FBI-1基因呈高表达水平。2、沉默FBI-1基因可抑制人乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231的增殖能力,阻滞细胞周期,诱导细胞凋亡。3、沉默FBI-1基因对人乳腺癌细胞增殖及凋亡的影响可能与抑制survivin的表达及抑制NF-κB通路有关。
孙瑶[6]2010年在《RNA干扰survivin基因对HepG2细胞凋亡及化疗的影响》文中研究表明目的：观察RNA干扰技术抑制人肝癌HepG2细胞survivin基因表达后对其细胞增殖及对其化疗敏感性的影响,探讨RNA干扰survivin基因表达对于肝癌治疗的可行性。方法：构建针对人肝癌HepG2细胞survivin基因靶序列的shRNA真核表达载体pshRNA-survivin-387,应用Lipofectamine2000脂质体介导转染法转染质粒,后分别行以下的研究：(1)将HepG2细胞接种于6孔板中,分为5组：空白对照组(不加药物)、阴性对照组(3.2ugpshRNA-survivin-NC/孔)、低浓度转染组(0.8ugpshRNA-survivin-387/孔)、中浓度转染组(1.6ug pshRNA-survivin-387/孔)、高浓度转染组(3.2ug pshRNA-survivin-387/孔),作用48h后收集细胞,流式细胞术检测各组细胞凋亡指数。(2)将HepG2细胞接种于96孔板中,分为叁组：空白对照组(不加药物)、阴性对照组(0.2ugpshRNA-survivin-NC/孔)、实验组(0.2ug pshRNA-survivin-387/孔),四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测各组细胞分别于顺铂(2.0ug/ml)作用24h,36h,48h,60h后的增殖水平。结果：(1)各浓度转染组细胞的凋亡指数明显高于空白对照组和阴性对照组(与空白对照组比较, F=228.87,*q=14.21-38.21,p<0.01;与阴性对照组比较,#q=10.45-34.4,p<0.01),高浓度转染组细胞凋亡指数高于低浓度转染组(F=228.87,q=23.99,p<0.01)。(2)顺铂对实验组细胞的细胞抑制率在24h,36h,48h,60h时明显高于空白对照组和阴性对照组(F=235.88-910.86,q=28.04-52.28,p<0.01)。结论：pshRNA-survivin-387转染能显着诱导人肝癌HepG2细胞的凋亡,增加人肝癌HepG2细胞对顺铂(C-DDP)化疗的敏感性。
马军国[7]2016年在《微囊藻毒素对HepG2细胞的毒性及其作用机制研究》文中认为水体富营养化导致蓝藻水华的频繁发生已成为国内外普遍关注的水环境污染问题。蓝藻水华不仅污染水体、破坏饮用水源、造成渔业损失,而且多数蓝藻水华还由于产生蓝藻毒素(cyanotoxins)而影响和危害水生生物甚至人的健康。在众多蓝藻毒素中,微囊藻毒素(microcystins,MCs)是分布最广且毒性最强的一类环七肽肝毒素。目前已发现超过100种MCs异构物,它们具有广谱的生物毒性,且化学性质稳定,在自然水体中难以降解。因此,它们对人类健康的影响尤其令人关注。近年来,关于MCs对动物或细胞的毒性及其作用机制的探索已成为MCs毒理学研究的重点和热点。关于MCs的毒性作用及其机理研究虽然有很多新的发现和见解,但其作用的具体信号通路目前尚不完全清楚,而且存在一定的争议,而该问题的解决是进行MCs环境和健康风险评价的基础。本研究选择MCs异构体中最常见且毒性最大的微囊藻毒素-LR(microcystin-LR,MC-LR),以人肝癌细胞Hep G2作为实验模型,研究MC-LR对Hep G2细胞的毒性及其作用机制,以期进一步丰富和完善MC-LR肝细胞毒性作用机制理论、解析MC-LR毒性作用的危害及评价MC-LR的环境安全风险,为研究MCs对人类健康的影响及其防护提供理论支撑。研究内容及获得的主要实验结果:(1)MC-LR对Hep G2细胞的毒性作用及其特点本研究首先通过MTT实验检测细胞活力、流式细胞仪检测细胞周期和凋亡、倒置荧光显微镜检测细胞及细胞器形态,评价MC-LR对Hep G2细胞的毒性作用及其特点。实验结果显示,0.1 n M-10μM MC-LR短时间暴露未对Hep G2细胞的活力、细胞周期和细胞凋亡产生明显影响;而0.1-50 n M MC-LR处理Hep G2细胞96 h也未显着改变细胞活力。高浓度MC-LR(20-100μM)暴露Hep G2细胞却显着抑制细胞活力,并呈时间-剂量-效应关系。用0.5-50μM MC-LR暴露Hep G2细胞,倒置荧光显微镜镜检发现,高浓度MC-LR暴露改变Hep G2细胞形态、导致细胞损伤。Hoechst 33342染色后检测发现,一定浓度的MC-LR暴露导致细胞核损伤并诱导细胞凋亡。Acridine orange染色后检测发现,高浓度MC-LR暴露对细胞溶酶体造成严重损伤,且呈时间-剂量依赖效应关系。Rhodamine-123染色检测发现,较低浓度MC-LR暴露,部分Hep G2细胞线粒体出现轻微形态改变,但无明显结构损伤;而高浓度MC-LR长时间暴露后,Hep G2细胞线粒体损伤明显,且弥散性地分布在细胞内,这说明MC-LR暴露对Hep G2细胞的线粒体产生了损伤。该实验结果表明,MC-LR对Hep G2细胞的毒性具有浓度依赖性,非细胞毒浓度染毒对细胞活力无影响,而高浓度处理可导致细胞凋亡。(2)MC-LR对Hep G2细胞代谢及其耐药基因表达的影响由于0.1 n M-10μM MC-LR暴露Hep G2细胞24 h并未影响受试细胞的细胞活力、细胞周期和细胞凋亡。因此,我们首先要确定Hep G2细胞内是否表达MC-LR特异性转运体—有机阴离子转运多肽(OATP 1B1和OATP 1B3),并确定MC-LR是否真正进入到Hep G2细胞内。通过q PCR检测发现,Hep G2细胞内确实存在OATP1B1和OATP 1B3基因的表达。而通过Western blot技术并使用MC-LR特异性抗体检测,结果证实MC-LR可进入Hep G2细胞,且MC-LR处理浓度越高,检测到细胞内MC-LR特异性条带越强。MC-LR虽然可进入Hep G2细胞,但低浓度染毒并未对细胞表型产生影响。但进一步研究发现,MC-LR暴露引起Hep G2细胞I相和II相部分代谢酶及外排泵基因表达的改变,说明MC-LR染毒可能扰乱这些代谢酶的正常功能。因此推测Hep G2细胞代谢酶在MC-LR代谢和解毒过程中可能发挥作用。为了验证该假设,接下来我们使用CYPs诱导剂Omeprazole(OME)、Ethanol(ETH)和Rifampicin(RIF)处理Hep G2细胞,提高代谢酶活性以证实Hep G2细胞内代谢酶是否在MC-LR的代谢过程中发挥作用。实验结果显示,用5μM MC-LR染毒后,CYPs诱导剂影响Hep G2细胞活力,其中ETH的诱导作用最明显。由于ETH是CYP2E1特异性诱导剂,进一步通过CYP2E1抑制剂Chlormethiazole(CMZ)实验证实,MC-LR可通过上调CYP2E1表达或酶活性而诱导产生过量的ROS,并对Hep G2细胞产生毒性、引起线粒体损伤而导致细胞凋亡。通过ROS清除剂L-抗坏血酸与MC-LR共培养细胞,结果发现ROS清除剂能减少MC-LR诱导产生ROS及其诱导的细胞死亡。(3)MC-LR低浓度长期暴露对Hep G2细胞的影响已有研究表明,低浓度MC-LR长期暴露能促进细胞增殖并诱发肝炎/肝癌。为探究该机理,本研究进一步选择低浓度MC-LR(0.1-30 n M)暴露Hep G2细胞83 d。Western blot检测结果显示,即使极低浓度的MC-LR(0.1 n M)染毒后,该毒素也可有效地进入Hep G2细胞,但CCK-8检测并未发现MC-LR对细胞活力产生明显的影响。然而,通过DCF荧光分析结果显示,30 n M MC-LR暴露Hep G2细胞使其ROS水平较对照组显着上升;而5和10 n M MC-LR长时间暴露促进细胞SOD活性升高。该结果说明,低浓度MC-LR长时间暴露也能诱导细胞产生过量的ROS,而细胞内高活性SOD可能在清除过量ROS过程中发挥重要作用。采用0.1-30 n M MC-LR暴露Hep G2细胞48 h,对细胞NF-κB p65、TNF-α、IL-1β和IL-6的表达水平无明显影响;而MC-LR长时间暴露却显着提升细胞内NF-κB p65、TNF-α、IL-1β和IL-6的表达水平。(4)高浓度MC-LR处理致Hep G2细胞凋亡及其机理细胞毒性实验结果表明,高浓度MC-LR可通过诱导Hep G2细胞产生过量的ROS而对细胞产生毒性并导致细胞凋亡。为探究MC-LR诱导Hep G2细胞产生过量ROS导致细胞凋亡的信号途径,我们用10-50μM MC-LR暴露Hep G2细胞,检测后发现,Hep G2细胞内ROS水平上升、HSP70和HSP90表达增加、SOD和CAT活性降低、GSH含量降低,且较高浓度组与对照组差异显着。另外,Hep G2细胞MDA水平明显提高。该结果说明,高浓度MC-LR暴露诱导Hep G2细胞产生过量的ROS、引起细胞氧化应激,并导致细胞脂质过氧化程度加重。用0.5-50μM MC-LR暴露Hep G2细胞,通过Western blot和q PCR检测发现,Hep G2细胞线粒体相关的COX-2、Cyt-c和Smac/Diablo的表达上调;p53 m RNA水平上调,并使其蛋白磷酸化水平明显增强;p21/WAF1、Fas和Fas L表达水平普遍上调。MC-LR暴露还影响Hep G2细胞Bad、Cleaved-Bid、Bcl-2和Bax蛋白表达水平,促进Bax与Bcl-2表达。MC-LR暴露显着促进Hep G2细胞PUMA蛋白表达;而30和50μM MC-LR处理6 h抑制细胞survivin表达,随后多数浓度MC-LR处理组却促进survivin表达。另外,0.5-50μM MC-LR暴露还促进细胞Caspase-3和Caspase-9 m RNA水平提升和酶活性升高,而高浓度MC-LR暴露也促进Caspase-8的表达。本研究还发现,Hep G2细胞c-myc m RNA变化与MC-LR暴露浓度和时间有关,且MC-LR能促进c-Myc蛋白表达,高浓度MC-LR暴露24 h能增强Hep G2细胞c-Myc(phosphor S62)磷酸化水平。MC-LR暴露促进Hep G2细胞c-fos和c-jun转录和蛋白水平提升,说明MC-LR可能引起细胞DNA损伤并诱发遗传毒性,而c-myc、c-fos和c-jun可能在MC-LR促进肿瘤发展过程中发挥重要作用。(5)MC-LR肝细胞毒性的转录组学分析为进一步全面和系统地研究MC-LR细胞毒性的作用机制,本实验通过转录组学方法研究了不同浓度MC-LR暴露对Hep G2细胞转录组的影响。结果显示,0.5、5、10、和50μM MC-LR处理组Hep G2细胞与对照组细胞相比分别有532、32、30和984个基因发生极显着变化。通过GO分析发现,低浓度MC-LR(0.5μM)暴露影响Hep G2细胞的迁移、运动、细胞定位、细胞组分移动、磷酸化调节和磷酸盐代谢过程调节。而高浓度MC-LR(50μM)暴露影响Hep G2细胞差异表达基因显着富集到94个亚类,如细胞代谢调节、细胞生物合成调节、基因表达调控、磷酸化调节、激酶活性调节、免疫系统、MAPKKK通路调节、细胞增殖、分化、迁移、细胞运动、细胞坏死和细胞凋亡等。KEGG pathway分析结果显示,MC-LR暴露影响Hep G2细胞磷酸肌醇代谢、磷脂酰肌醇信号系统、NF-κB信号通路、p53信号通路和MAPK信号通路等重要信号通路。(6)MC-LR处理对Hep G2细胞mi RNA表达谱的影响虽然目前MCs毒性机理已有较多研究,但micro RNA(mi RNA)是否在MCs毒性过程发挥作用却报道甚少。本实验用不同浓度的MC-LR暴露Hep G2细胞后,通过高通量测序检测受试细胞mi RNA表达谱。实验结果显示,10μM MC-LR暴露显着改变Hep G2细胞mi RNA表达,其中5个上调、16个下调,共预测到37 566个靶基因;而50μM MC-LR处理组Hep G2细胞mi RNA表达显着上调的有20个、表达下调17个,共预测到39 174个靶基因。与对照组相比,10μM和50μM MC-LR处理组均引起Hep G2细胞has-mi R-149-3p、has-mi R-449c-5p和has-mi R-454-3p表达显着上调,引起has-mi R-4286、has-mi R-500a-3p、has-mi R-500a-5p和has-mi R-500b-5p表达显着下调。q PCR检测结果也验证了以上结果。MC-LR暴露Hep G2细胞引起差异表达mi RNA的靶基因共筛选出23个显着富集的GO条目,其中有3个在10μM和50μM MC-LR暴露组均显着富集。而KEGG pathway分析结果显示,MAPK信号通路、次生代谢产物的合成、嘧啶代谢和嘌呤代谢等信号通路可能在MC-LR对Hep G2细胞的毒作用过程中通过mi RNA负调节发挥作用。通过mi RNA表达谱分析还从Hep G2细胞中预测并筛选出了110个候选新mi RNA,进一步丰富了人类mi RNA数据库资源,并为后续的功能分析研究提供了基础支撑。本研究的主要结论:(1)MC-LR的暴露浓度及作用时间影响其对Hep G2细胞的毒性,而高浓度MC-LR处理可导致Hep G2细胞凋亡,且线粒体和溶酶体与该过程可能密切相关。(2)MC-LR可通过上调Hep G2细胞CYP2E1表达或酶活性而诱导细胞产生过量的ROS并对细胞产生毒性。(3)低浓度MC-LR长时间暴露可能会促发细胞的炎性反应。(4)高浓度MC-LR可通过诱导Hep G2细胞产生过量的ROS、激活线粒体细胞凋亡信号途径而介导细胞凋亡,PUMA和survivin在其中可能发挥重要作用。(5)高浓度MC-LR暴露也会激活Fas/Fas L死亡受体通路,并介导细胞凋亡。(6)MC-LR的肝细胞毒性作用由多种基因和蛋白参与、并由多条信号通路协同或拮抗而发挥作用。(7)mi RNA可能与MC-LR肝细胞毒性及其诱发的肝炎、肝癌有关,并可能在其中扮演重要的调控角色。本研究结果有助于从毒理学和分子水平揭示MC-LR导致易感人群患肝炎/肝癌的原因,为MC-LR安全风险评价和人类健康防护提供了理论支撑。
戴德坚[8]2005年在《靶向抑制Survivin对肝癌细胞增殖和凋亡效应的研究》文中研究表明背景和目的 肿瘤的发生发展与细胞增殖和凋亡调节失控密切相关。最近研究发现凋亡蛋白抑制因子家族(IAPs)的最小成员survivin在细胞增殖和凋亡的界面之间发挥重要调节作用,过表达于常见的恶性肿瘤组织,而在正常分化组织中沉默,使其成为一个非常有吸引力的癌症治疗靶点。在肿瘤细胞内导入凋亡抑制因子survivin拮抗物有可能成为肿瘤基因治疗中最诱人的策略之一。不少研究显示survivin是一潜在的抗癌治疗靶,并且反义survivin表达成功诱导肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤细胞增殖,但在survivin反义应用研究中,许多关键问题亟需解决。首先,必须寻找抑制survivin表达的有效靶位。Survivin mRNA链长1619bp,以其不同编码区为靶序列的反义寡核苷酸对survivin表达抑制差异可能很大,必须通过体外和体内试验寻找安全有效的反义寡核苷酸序列,并确定剂量—反应曲线。其次,尽管对survivin的结构了解得比较清楚和它的抗凋亡功能得到公认,然而survivin在细胞生命活动如凋亡、细胞周期和有丝分裂增殖中的界面角色和作用机制仍有待进一步阐明。更重要的是survivin在不同肿瘤表达有很大差异,靶向抑制survivin表达能否影响一些常见肿瘤生长必须通过更多的浙江大学博士学位论文体外试验,并进而通过体内试验证实。 诱导肿瘤细胞凋亡是化疗药物发挥杀伤作用的重要机制之一,而凋亡抑制基因Survivin的过表达导致了凋亡抑制,并与肿瘤化疗耐药有密切关系。反义技术可通过封闭凋亡基因的过表达,诱导凋亡,增强化疗敏感性。这正是当今备受关注的一种肿瘤耐药逆转的新策略。最近研究已经证明了反义抑制Survivin的表达能够增加多种肿瘤细胞系(包括肝癌)对化疗的敏感性,但这些研究主要讨论的是敏感细胞系,而反义Survivin表达能否使耐药细胞系对化疗敏感,甚至对原耐受的化疗药物增敏有待进一步阐明。这对于预防肿瘤的发生发展及手术后抗复发治疗有着潜在的巨大价值。肝癌手术切除率低,复发率高、对化放疗均不敏感,预后很差,至今缺乏有效的治疗手段,鱼需探索新的治疗方法。最新研究表明,survivin广泛表达于HepGZ,Huh7和SK一Hepl等肝癌细胞系及人肝癌组织,与肝癌细胞增殖和凋亡密切相关,也是其对放化疗不敏感的原因之一。 本研究试图设计、筛选和确定能有效抑制肝癌细胞系survivin表达的反义复合物,进而探讨其对肝癌细胞增殖和凋亡的影响;反义干扰survivin抗凋亡功能对肝癌细胞的细胞周期、细胞分裂和Survivin亚细胞定位的影响,阐明过表达survivin在肝癌细胞增殖和凋亡界面角色及作用机制;探讨survivin基因表达与肝癌细胞耐药的关系及反义抑制survivin表达恢复耐药肝癌细胞系对阿霉素的敏感性,阐明反义寡核昔酸和阿霉素的联合应用,可能是将来耐阿霉素肝细胞癌临床治疗的一种合理策略;建立肝癌裸鼠模型,验证反义复合物对肝癌细胞裸鼠体内移植瘤的生长影响,为肝癌及survivin阳性肿瘤治疗提供新途径。浙江大学博士学位论文方法和结果 本课题分以下几部分研究: 研究一:影响。特异反义复合物抑制Survivin表达对肝癌细胞增殖和凋亡效应的 方法:根据GenBank、RNAdraw设计程序和BLAST同源分析,预测和确定一系列20一mer反义硫磷酞寡核昔酸序列靶向SuI’vivin mRNA不同区域的候选序列。分别转染H即GZ细胞系,MTT法筛选出有效的反义寡核营酸序列。通过改变反义寡核昔酸:脂质体(l:0.5一l:5)比率,利用RT-pCR、Westernblot实验,构建并优化能有效抑制肝癌细胞Survivin表达的反义复合物。MTT法检测细胞生长情况。流式细胞术测定Caspase一3活性及凋亡率。电镜观察细胞形态学变化。 结果:针对S盯vivin mR触核营酸号为232一251(翻译区)的反义寡核营酸序列m是最有效的序列,而针对翻译起始ATG位置的序列I(39一58)及其他翻译区序列11(97一116)、IV(329一348)、V(821一840)和Vl(1461一1480)序列均无效。反义寡核昔酸序列m:脂质体(1:4,1:5)为最有效的反义复合物,而反义复合物(1:0.5一1:3)不能达到最大效应。鉴于脂质体有轻度细胞毒性,故本实验选择反义复合物(1:4)。反义复合物〔1:4)转染肝癌细胞有效下调survivin表达水平,呈剂量依赖关系,IC50值为250nmol几,最大效应浓度为SOOnmol/L,此时表达水平下调了80%。类似细胞生长抑制结果为川’f实验所证实。与此同时,Caspase一3活性和凋亡率随转染时间延长而逐渐递增,并出现凋亡形态学变化,如胞浆空泡变性、核浓缩和核碎裂。 研究二:反义干扰Survivin抗凋亡功能对肝癌细胞细胞周期,细胞分裂和survivin蛋白分子亚细胞定位的影响. 方法:用脂质体介导survivin反义寡核昔酸转染肝癌细胞系HePGZ。通过RT-PCR,Western blot检测survivin的表达水平。流式细胞术测定easpase一3的浙江大学博士学位论文活性及凋亡率。应用流式细胞仪同步分析反义复合物对HePGZ增殖周期和倍体数的影响。用反向相差显微镜和电子显微镜观察细胞核形态学的变化。应用激光共聚焦显微镜免疫荧光分析法评价脂质体反义复合物在亚细胞水平对survivin蛋白分子的影响。 结果:在反义复合物转染的H即GZ细胞中,反义干扰survivin的功能导致了正在分裂增殖细?
林海华, 余玉红, 张绍敏, 陈出新, 刘国军[9]2019年在《ShRNA-survivin基因对肝癌Huh7细胞增殖、迁移和凋亡的影响》文中提出目的探讨生存素(survivin)基因对肝癌Huh7细胞增殖、迁移和凋亡的影响。方法将肝癌细胞分为空白对照组(A组)、空白载体病毒组(B组)和ShRNA-survivin慢病毒组(C组),构建ShRNA-survivin慢病毒载体,通过RT-qPCR检测凋亡因子半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9(Caspase-9)以及Caspase-3 mRNA的表达量;通过CCK-8实验检测肝癌Huh7细胞增殖能力;通过Transwell小室实验检测肝癌Huh7细胞迁移能力;通过AV-PI凋亡试剂盒检测肝癌Huh7细胞的凋亡情况。结果 A、B、C组survivin mRNA的相对表达量分别为1.000±0.000、1.079±0.011、0.421±0.097,A、B组与C组比较差异具有显着统计学意义(F=15.984,q=8.141、3.257,P<0.05),Caspase-3和Caspase-9的mRNA表达量与survivin的mRNA表达量趋势相同;A、B、C组中透过分子筛的细胞数比较差异有显着性(F=31.982,P<0.05);A、B组与C组比较差异均有显着意义(q=7.153、9.074,P<0.05);A、B、C组细胞的增殖率比较差异有显着意义(F=23.983,P<0.05);A、B组与C组比较差异均有显着意义(q=10.322、9.886,P<0.05);A、B、C组细胞的凋亡率比较差异有显着意义(F=30.009,P<0.05);A、B组与C组比较差异均有显着意义(q=9.531、8.001,P<0.05)。结论 ShRNA-survivin对肝癌Huh7细胞的增殖、迁移有抑制作用,对细胞凋亡具有促进作用,可以作为肝癌的潜在治疗靶点。
张英敏[10]2016年在《apoE修饰阳离子脂质体介导HSV-tk基因对肝癌细胞的杀伤作用研究》文中认为目的:1.检测本实验室合成的基因载体apo E修饰脂质体(apo E-lipoplex)对肝(癌)细胞的结合特异性。2.构建包含自杀基因HSVtk的质粒pSurvivin-TK-PBI-CMV2,用apo E-lipoplex转染其进入肝(癌)细胞,检测HSVtk基因在细胞中的表达情况。3.检测apo E-lipoplex/HSVtk/GCV系统对肝癌细胞的靶向杀伤作用。方法:1.用apoE-lipoplex携带pGenesil-1质粒分别转染肝癌细胞HepG2、Huh-7和正常肝细胞HL-7702,宫颈癌细胞Hela,流式细胞仪检测转染率。2.用apoE-lipoplex携带pSurvivin-TK-PBI-CMV2质粒分别转染肝癌细胞HepG2、Huh-7和肝细胞HL-7702,RT-PCR检测HSVtk基因的mRNA表达水平,western blot检测HSVtk蛋白表达。3.apoE-lipoplex携带pSurvivin-TK-PBI-CMV2质粒转染肝癌细胞HepG2、Huh-7和肝细胞HL-7702,加入前体药物更昔洛韦(GCV)。2 d后流式细胞仪检测细胞凋亡率;MTT法检测细胞增殖;Hoechst染色后荧光显微镜下观察细胞形态变化。结果:1.apo E-lipoplex对肝癌细胞HepG2、Huh-7和肝细胞HL-7702的转染率相比宫颈癌细胞Hela更高,差异有统计学意义(P<0.05)。2.apoE-lipoplex携带pSurvivin-TK-PBI-CMV2质粒转染肝癌细胞HepG2、Huh-7和肝细胞HL-7702后,HSVtk基因的mRNA和蛋白在两种肝癌细胞中均有明显表达,但在肝细胞HL-7702中均未检测到表达。3.流式结果表明,转染组肝癌细胞HepG2、Huh-7凋亡显着(P<0.05);MTT结果表明,转染组肝癌细胞HepG2、Huh-7增殖减弱显着(P<0.05);荧光显微镜下观察,转染组肝癌细胞有凋亡的特征性形态学改变。结论:1.apo E-lipoplex对肝(癌)细胞具有较高的转染率,有靶向性转染肝(癌)细胞的能力。2.相比肝细胞HL-7702,apo E-lipoplex介导的survivin启动子驱动的HSVtk基因在肝癌细胞HepG2、Huh-7中有特异性表达。3.apo E-lipoplex介导的pSurvivin-TK-PBI-CMV2质粒+GCV系统,对肝癌细胞HepG2、Huh-7有选择性杀伤作用,而对肝细胞HL-7702未见明显杀伤作用。本课题为国家自然科学基金“乳糜微粒定向介导TK基因载体系统对肝癌杀伤作用(编号:81172136)”。
参考文献：
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[4]. RNA干扰抑制Survivin基因对人肝癌HepG2细胞增殖的影响[D]. 杨敬敬. 青岛大学. 2009
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[6]. RNA干扰survivin基因对HepG2细胞凋亡及化疗的影响[D]. 孙瑶. 青岛大学. 2010
[7]. 微囊藻毒素对HepG2细胞的毒性及其作用机制研究[D]. 马军国. 河南师范大学. 2016
[8]. 靶向抑制Survivin对肝癌细胞增殖和凋亡效应的研究[D]. 戴德坚. 浙江大学. 2005
[9]. ShRNA-survivin基因对肝癌Huh7细胞增殖、迁移和凋亡的影响[J]. 林海华, 余玉红, 张绍敏, 陈出新, 刘国军. 精准医学杂志. 2019
[10]. apoE修饰阳离子脂质体介导HSV-tk基因对肝癌细胞的杀伤作用研究[D]. 张英敏. 山西医科大学. 2016