张浚, 邓朝晖, 龚娅[1]2007年在《不同偶联模式的兴奋性氨基酸受体所介导非洲爪蟾卵母细胞跨膜电流的相互影响》文中认为目的研究不同偶联模式的兴奋性氨基酸受体所介导非洲爪蟾卵母细胞跨膜电流的相互影响。方法用异硫氰酸胍-酚-氯仿法从成年大鼠脑中提取总RNA,以寡聚脱氧胸苷酸纤维素亲和层析法分离出mRNA并注射入非洲爪蟾卵母细胞使表达,通过全细胞双电极电压钳位法,分别以M-胆碱受体Carb,谷氨酸离子型受体激动剂kainate(KA),代谢Ⅰ型受体激动剂quisqualate(QA)及代谢Ⅲ型受体激动剂L-phosphoserine(L-SOP)两两同时灌流有受体表达的非洲爪蟾卵母细胞。结果3种偶联模式的受体激动后产生的膜电流具有交叉脱敏现象。结论在多种受体共存的细胞中,受体之间可能存在着广泛的相互作用。
张浚[2]2000年在《兴奋性氨基酸受体各亚型所介导非洲爪蟾卵母细胞跨膜电流的特征不同偶联模式的受体所介导非洲爪蟾卵母细胞跨膜电流的相互影响》文中指出用异硫氰酸胍-酚-氯仿法从成年大鼠脑中提取总RNA，以寡聚脱氧胸苷酸纤维素亲和层析法分离得mRNA，将其注射到非洲爪蟾卵母细胞中进行表达。以全细胞双电极电压钳位法，快速灌流兴奋性氨基酸受体之离子型受体激动剂kainate（KA）及兴奋性氨基酸受体之代谢型Ⅰ型受体激动剂quisqualate（QA）检测表达之离子型及代谢型Ⅰ型受体所介导的膜电流。100μM KA产生一主峰电流后缓慢下行，成为一稳定电流平台，最终脱敏，脱敏时间平均为37.57min。2μM QA产生一峰值电流后转为一持续性钙振荡或直接出现钙振荡，振荡维持时间为6.72±1.33min。脱敏时间均随激动剂浓度的增加而缩短。 同法在表达成功的卵母细胞上，快速灌流兴奋性氨基酸受体之代谢型Ⅲ型受体激动剂L-phosphoserine（L-SOP）检测表达之代谢型Ⅲ型受体所介导的膜电流。0.8mM L-SOP灌流一定时间后，细胞膜电流出现一规律性电流振荡。电流振荡维持时间为20.17±8.47min。给药后至出现振荡所需要的时间与浓度没有必然的联系，振荡维持时间随激动剂浓度增加而缩短。此D 振荡电流可被代谢型谷氨酸1型受体桔抗剂L－AP。所桔抗，提示代谢型谷Dl 氨酸受体激动剂 L－SOP不仅是＊型受体的激动剂，而且是 1型受体的弱的 lD 激动剂。Dl 在同时表达了代谢型谷氨酸l型受体和M－胆碱受体的卵母细胞上连续l 给予 QA及 Carb，研究两类受体所介导的膜电流脱敏的相互影响。结果表l 明，代谢型谷氨酸1型受体介导的膜电流与M－胆碱受体介导的膜电流之ll 间存在双向交叉脱敏现象。即对 QA脱敏的卵母细胞，对 Carb无反应，对 lICarb脱敏的，对QA亦无反应。同法，我们研究了兴奋性氨基酸之代谢型 l11型与离子型受体，代谢型I型与代谢型＊型受体，离子型与代谢型＊型 lD 受体两两之间膜电流的相互影响，发现它们均存在双向交叉脱敏现象。我D 们的结论是，蛋白激酶CRKC）可能在这种异源性脱敏中发挥了关键作D 用。在多种受体共存的细胞中，受体之间存在着广泛的相互作用。D
张浚, 王晖, 金星[3]2008年在《兴奋性氨基酸受体所介导细胞钙电流特征及其中L-SOP的作用途径》文中研究说明目的:研究兴奋性氨基酸受体各亚型所介导非洲爪蟾卵母细胞跨膜电流的特征及其中Ⅲ型受体激动剂L-SOP的作用途径。方法:用异硫氰酸胍-酚-氯仿法从成年大鼠脑中提取总RNA,以寡聚脱氧胸苷酸纤维素亲和层析法分离出mRNA并注射入非洲爪蟾卵母细胞使表达,以全细胞双电极电压钳位法灌流此卵母细胞。结果:100μM KA(kainate)(离子型)产生一主峰电流后缓慢下行,成为一稳定电流平台,最终脱敏,脱敏时间平均为37.57 min。2 txM QA(quisqualate)(代谢Ⅰ型)产生一峰值电流后转为一持续性钙振荡或直接出现钙振荡,振荡维持时间为(6.72±1.33)min,脱敏时间均随激动剂浓度的增加而缩短。0.8 mM L- SOP(L-phosphoserine)(代谢Ⅲ型)灌流产生规律性电流振荡,振荡时间为(20.17±8.47)min。此振荡电流可被代谢Ⅰ型受体拮抗剂L-AP_3所拮抗。结论:离子型、代谢Ⅰ型及代谢Ⅲ型受体均产生各自特征电流模型;L-SOP不仅是Ⅲ型受体的激动剂,而且是Ⅰ型受体的弱的激动剂,即细胞振荡电流是L-SOP通过Ⅰ型受体的作用途径而产生。
王照宇[4]2006年在《非洲爪蟾卵母细胞ATP-激活电流特征及其调制》文中认为第一部分非洲爪蟾卵母细胞ATP-激活电流特征及pH值改变的影响目的:研究非洲爪蟾卵母细胞ATP受体激活电流(IATP)的特征及pH改变对IATP的影响及其机制。方法:在未去滤泡膜的卵母细胞标本上进行实验,用16~18℃任氏液灌流细胞,实验用双电极电压钳技术将卵母细胞膜电位钳制在-50mV,记录外加ATP溶液所引起的内源性ATP-激活电流及细胞外液pH值改变对ATP-激活电流的影响。结果:共检测了85个细胞,其中75例对ATP敏感,所记录到的ATP-激活电流包括三种成分:快内向电流(D1),慢内向电流(D2)和慢外向电流(H)。各种成分的出现率( incidence )约为: (1)D1+D2+H ( 74.7%;53/75; (2) D1+H(17.3%;15/75); (3) D1+D2(5.7%;5/75); (4) D1(2.3%;2/75)。根据3种成分出现率的不同,本实验所观察到的ATP激活电流表现为四种基本形式,且同一蛙体各个卵母细胞对ATP的反应电流的形式不尽相同。以pH=7.4,10~(-3)mol/LATP受体激活电流为对照,当细胞外pH降低到6.0、5.5时,10~(-3)mol/L的ATP引起的IATP幅值明显被抑制,以对D1电流抑制最明显。当细胞外pH为7.9时,ATP-激活电流幅值也被抑制。结论:运用双电极电压钳技术在带有滤泡膜的非洲爪蟾卵母细胞标本上,外加ATP可引起内源性ATP-激活电流, pH值降低对爪蟾卵母细胞IATP的抑制可能通过对P2X受体的影响实现的。
张懿熙[5]2012年在《昆虫烟碱型乙酰胆碱受体的组成及其药理学特性研究》文中研究指明烟碱型乙酰胆碱受体(nAChRs)是脊椎动物和无脊椎动物神经系统中快速介导胆碱能突触传递的配基门控离子通道。在脊椎动物中,nAChRs在神经肌肉接头以及中枢和周缘神经系统中均有表达。在昆虫中,nAChRs在神经肌肉接头处没有分布,却是中枢神经系统中最丰富的神经递质受体,是重要的杀虫剂作用靶标。目前通过分子克隆和基因组测序技术在多种昆虫中发现了大量的nAChRs亚基,为昆虫nAChRs的研究提供了坚实的基础。在昆虫nAChRs亚基功能研究中,试图体外组建昆虫功能性nAChRs一直是国际研究热点,但近20年来始终没有突破,主要有两个问题没有解决：第一,昆虫神经系统中nAChRs蛋白复合体的组成仍然未知；第二,在异源表达系统中无法获得有功能的昆虫nAChRs同型五聚体。本文利用非洲爪蟾卵母细胞表达系统,对褐飞虱的四个nAChRs a亚基与大鼠的nAChRs β2亚基进行了体外重组,通过双电极电压钳技术及放射性配基结合实验研究了重组型受体的药理学特性,并利用免疫共沉淀技术对昆虫内源性nAChRs a亚基的组成进行了探索。通过搜索褐飞虱EST数据库及基因克隆获得了两个Ly-6/neurotoxin超家族基因,分别将其命名为Nl-lynx1和Nl-lynx2.在异源表达系统中检测了这两个lynx蛋白对重组型受体NIαl/rβ2的调节作用,并对其调节机理进行了研究。一、昆虫烟碱型乙酰胆碱受体a1、a2亚基的异源表达与功能研究吡虫啉等新烟碱类杀虫剂作为昆虫烟碱型乙酰胆碱受体(nAChRs)的选择性激动剂,在农业害虫和卫生害虫的防治中应用广泛。褐飞虱(Nilaparvata lugens)是亚洲许多地区的主要水稻害虫。本文在异源表达系统中对褐飞虱nAChRs两个a亚基Nlal和Nla2进行了体外重组,并对重组型受体的功能特性进行了研究。在非洲爪蟾卵母细胞中,Nlal和Nla2分别与哺乳动物的β2亚基共表达,均能够形成有功能的受体,这与以往对于昆虫a亚基的研究结果一致。两种重组受体Nlαl/rβ2和Nlα2/rβ2对乙酰胆碱的激动剂剂量反应相差不足两倍,但是,Nlα1/rβ2受体对吡虫啉的亲和力显著高于Nlα2/rβ2受体,其EC5o分别为61±7μM(n=9)和870±76μM(n=13)。在卵母细胞中同时表达Nlα1, Nla2和哺乳动物的β2亚基,所形成的受体对激动剂的剂量反应曲线介于Nlα1/rβ2受体和Nlα2/rβ2受体对激动剂的剂量反应曲线之间,但又与计算机模拟的两种受体同时存在时的剂量反应曲线存在显著差异,由此推测,Nlα1, Nlα2和哺乳动物的β2亚基可能组成一个三亚基五聚体Nlα1/Nlα2/rβ2。改变各亚基的注射比例,激动剂的EC50没有显著变化,进一步证明三个亚基共表达时形成的受体不是亚基组成不同的nAChRs的混合物,而是单一的重组型nAChRs。为证明在褐飞虱体内Nlal和Nla2两个亚基是否存在于同一个受体中,进一步研究昆虫内源性nAChRs的组成,本文分别以Nlal和N1a2亚基胞内环的氨基酸序列为抗原制备特异性的多克隆抗体,进行了免疫共沉淀,研究结果证明,在褐飞虱体内N1a1和N1a2亚基的确存在于同一个受体中。二、昆虫烟碱型乙酰胆碱受体a3、a8亚基的异源表达与功能研究昆虫烟碱型乙酰胆碱受体(nAChRs)是以吡虫啉为代表的新烟碱类杀虫剂的作用靶标。目前,通过基因组序列分析和基因克隆的方法在包括黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)在内的多种昆虫中鉴定出了大量的nAChRs亚基。系统发生关系的分析结果表明,果蝇Dβ2亚基与许多昆虫的a8亚基属于同一个亚类群中。以往的研究中并没有关于在异源表达系统中成功表达昆虫a8/Dβ2亚类群nAChRs亚基的报道,但是,有证据表明DD2亚基可以与其它两个亚基共聚,形成三亚基五聚体。本文通过RT-PCR和RACE技术克隆了褐飞虱Nla8亚基(GenBank登录号：FJ481979),并首次报道了包含昆虫nAChRs a8亚基的三亚基五聚体Nla8/Nla3/rβ2。Nla8亚基基因全长2036bp,开放阅读框为1617bp,编码538个氨基酸,与意大利蜜蜂(Apis mellifera)、赤拟谷盗(Tribolium castaneum)、冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)的nAChRs a8亚基具有较高的相似性,且具有nAChRs a亚基基因家族的特征结构。在非洲爪蟾卵母细胞表达系统中,褐飞虱Nla8亚基可以与哺乳动物p亚基rβ2共聚,形成重组型受体Nlα8/rβ2;也可以与Nla3亚基及rβ2共聚,形成三亚基五聚体Nlα8/Nlα3/rβ2,且该受体对激动剂的剂量反应显著高于Nlα8/rβ2nAChRs. Nlα/Nlα/rp2对吡虫啉的最大反应电流Imax是Nlα8/rβ2的29.69倍。剂量依赖反应的研究结果表明,Nlα8/rβ2对乙酰胆碱的ECs0是Nlα8/Nlα3/rβ的5.58倍,而Nlα8/rβ2对吡虫啉的EC50约是Nlα8/Nlα/rβ2的40倍。免疫共沉淀的研究结果进一步证明,Nla3与Nla8亚基存在于同一个内源性1nAChRs中。三、昆虫烟碱型乙酰胆碱受体附属蛋白的克隆及其对受体的调节作用在昆虫体内或离体条件下,除了nAChRs亚基组成外,一些附属蛋白,包括分子伴侣,调控因子或调节蛋白,在昆虫nAChRs的蛋白折叠与成熟、复杂结构组成、蛋白功能等方面起到十分重要的作用。本文通过搜索褐飞虱EST数据库(http://bphest.dna.affrc.go.jp/:Noda et al.,2008)及基因克隆获得了两个Ly-6/neurotoxin超家族基因,分别将其命名为Nl-lynx1和Nl-lynx2。Nl-lynx1和Nl-lynx2与萤火虫Pr-lynx1基因的相似性分别为53%和50%,与小鼠lynx1基因的相似性分别为39%和41%,与小鼠lynx2基因的相似性分别为42%和44%。尽管褐飞虱Nl-lynx1和Nl-lynx2基因与萤火虫的Pr-lynx1基因及脊椎动物的Ly-6/neurotoxin超家族的基因不具有较高的相似性,但是具有Ly-6/neurotoxin超家族基因的特征结构。在非洲爪蟾卵母细胞表达系统中,Nl-Lynx1和Nl-Lynx2能够上调重组型受体Nlα1/rβ2对激动剂反应的最大电流,但是对受体对激动剂的敏感性没有影响。Nl-Lynx1与重组型受体Nlα1/rβ2共表达时,受体对乙酰胆碱和吡虫啉的Imax分别是单独表达Nlα1/rp2时的3.56倍和1.72倍;Nl-Lynx2与重组型受体Nlal/rβ2共表达时,受体对乙酰胆碱和吡虫啉的Imax分别是单独表达Nla1/rβ2时的3.25倍和1.51倍。放射性配基结合实验的结果表明,Nl-lynx1或Nl-lynx2与受体Nla1/rβ2共表达只能增加配基的最大结合量(Bmax)不改变受体与配基结合的平衡常数(Kd),即不改变受体对配基的亲和力。进一步的研究结果表明,Nl-lynx1或Nl-lynx2对受体的脱敏特性及nAChRs亚基表达水平没有影响,且在一定范围内Nla1/rβ2对激动剂的反应电流随Nl-lynx:主射量的增加而增大,由此推测,Nl-lynx对受体的调节作用可能是通过提高蛋白质折叠和亚基组装的效率实现的。本文的研究结果表明,两种不同的昆虫nAChRs α亚基共表达可以提高受体对激动剂的反应,但仍需哺乳动物β亚基的参与才能够在异源表达系统中构建功能受体；附属蛋白与受体亚基共表达仍然不能形成有功能的受体,由此推测昆虫nAChRs的蛋白复合体中尚有未知的蛋白需要鉴定,试图体外组建昆虫功能性nAChRs可能需要更多的未知附属蛋白。因此,本研究通过免疫共沉淀分离纯化包含某一亚基的昆虫内源性nAChRs蛋白复合体,经SDS-PAGE电泳进行分离,LC-MS/MS质谱鉴定的方法,对nAChRs蛋白复合体中的未知蛋白鉴定进行了尝试。虽然,由于抗体特异性等原因导致鉴定出的蛋白数量过多,难以筛选出目的蛋白并对其功能进行验证,但是,应用免疫共沉淀,亲和层析等方法对昆虫1nAChRs蛋白复合体进行分离纯化,结合基因组或转录组数据库,通过质谱对其组分进行鉴定的方法仍然具有可行性。应用蛋白质组学和基因组学的技术手段,鉴定昆虫nAChRs蛋白复合体的组成,体外构建功能性昆虫nAChRs,仍然是未来昆虫nAChRs结构与功能研究的热点之一
朱雅妮[6]2004年在《谷氨酸转运蛋白的结构与功能的研究》文中进行了进一步梳理兴奋性氨基酸转运蛋白 EAAC1 是一种受 Na+-,K+-浓度梯度驱动的产电型转运蛋白。另外,在 Na+和谷氨酸存在的情况下,这一转运蛋白能够介导谷氨酸非偶联的离子流动。蛋白 N-端的前两个跨膜区对于形成离子通道模式非常重要,它们与胞外区的交界处均为带正电的精氨酸残基,R39 和 R61,这两个位点在同一家族中的所有成员中都是保守的。另一个保守的酪氨酸残基,Y98,也可能对于 Cl-流的形成非常重要。将精氨酸和酪氨酸残基突变为丙氨酸后,我们通过测量谷氨酸的重摄取和谷氨酸诱导的电流来研究突变对转运蛋白功能的影响。突变体 R39A 对于转运和通道模式几乎毫无影响。但是另一个精氨酸突变体,R61A,却能够在减弱转运活性的同时刺激通道的形成。并且使得谷氨酸重摄取和谷氨酸依赖电流的表观 Km值减小。谷氨酸对电流的激活似乎伴随着一个电压依赖的过程,而在 R61A 突变体中,电荷移动的表观效价减小了。突变体 Y98A 导致转运功能的减弱以及谷氨酸表观 Km值减小,在通道模式中,强烈减小了对于 NO3和 Cl-的选择性。
景红娟[7]2008年在《麻黄碱直接激活控制心节律的心脏I_（Ks）电流机理的研究》文中研究指明麻黄是我国特产而闻名世界的一味中药材,早在两千年前就用于发汗、平喘、止咳。生药麻黄为麻黄(Ephedra sinica stapf)及其同属植物的地上茎,其成分主要包括3组立体异构的生物碱:左旋麻黄碱、右旋伪麻黄碱、左旋去甲基麻黄碱、右旋去甲基伪麻黄碱、左旋甲基麻黄碱、右旋甲基伪麻黄碱。生物碱中以麻黄碱为主,占生物碱总量的80%。麻黄及麻黄碱在临床已经使用多年,而且还作为膳食补充剂等非处方药用来治疗肥胖。麻黄及麻黄碱的广泛使用引发了一系列副作用事件,尤其是心血管系统副作用占47%。传统的观念认为:麻黄治疗疾病及引起副作用的机制是由麻黄碱直接或间接激动α或β肾上腺素受体所致。而我们的研究表明:麻黄碱还可以通过直接增强离子通道电流起作用。首先,我们利用全细胞扫描的方法,发现麻黄碱对PC12细胞上钾通道有显著的激活作用,但是对PC12细胞上钙通道和DRG细胞钠通道没有影响。而作为其立体异构体的伪麻黄碱对钾电流、钠电流和钙电流都没有作用。其次,我们研究了麻黄碱对KCNQ1通道的影响。KCNQ1通道(又称Kv7.1,KvLQT1)是一类电压门控钾通道,在心脏中主要与辅助亚基KCNE1共表达形成缓慢激活的、延迟整理的钾电流(I_(Ks)),在心脏动作电位复极化Ⅱ期过程中起关键作用。利用常规膜片钳、双电极膜片钳、点突变、显微注射和转染等试验方法,我们发现麻黄碱在体外表达系统——HEK293细胞和非洲爪蟾卵母细胞中,都能激活KCNQ1/KCNE1通道,激活I_(Ks)电流的EC_(50)=50 nM,而且加药后的激活时间常数(τ_(on))和洗脱时间常数(τ_(off))分别为49 s和400 s。尽管麻黄碱对I_(Ks)电流有显著的激活作用,而伪麻黄碱对I_(Ks)电流几乎没有影响。因此,我们推测并进一步发现了麻黄碱与KCNQ1/KCNE1通道的结合位点是S5-S6之间P-loop上的两个芳香族氨基酸,分别是F296和Y299。由于这两个作为位点在KCNQ通道家族中是保守的,而位于脑组织中的M电流是由KCNQ1的同源基因形成的,故麻黄碱可能在人类的学习和记忆等行为中起重要作用。再次,为了进一步验证麻黄碱对心血管系统的作用,我们检验了麻黄碱对BALS/c小鼠心电图的影响。结果表明:5 mg/kg麻黄碱能够增加心率49%,缩短QTc 39%。另外,秀丽隐杆线虫(C.elegans)中与KCNQ1通道同源的KQT-3主要位于肠道肌肉,因此我们研究了麻黄碱对线虫排泄的作用,表明:麻黄碱对线虫排泄的周期及排泄间隔影响不大,但却提高线虫排泄成功率Exp/pBoc 20%。另外,麻黄被用来治疗普通感冒、支气管炎、哮喘和关节炎。我们首次从支气管平滑肌入手,研究麻黄碱对支气管平滑肌细胞(bronchial smooth muscle cells,BSMCs)增殖的影响。300μg/mL麻黄碱对BSMCs增殖影响效果不明显,而600μg/mL麻黄碱却显著抑制了BSMCs的增殖,作用24,48小时后,对BSMCs增殖的抑制率分别达到(25.9±0.43)%和(40.7±0.35)%。
刘伯一[8]2009年在《受体及药物引起的M/KCNQ钾通道、钙激活氯通道及内向整流钾通道的调控作用及其生理学意义》文中研究说明M型钾离子通道介导一种具有电压及时间依赖性、慢激活、慢去活、非失活的外向钾电流。由于最初发现其能被毒蕈碱M1受体激活后所强烈抑制,故因此得名。目前认为M通道的分子基础是由KCNQ家族成员(KCNQ1-5,又称KV7.1-7.5)的单或异二聚体所构成。M通道的激活阈值位于-60 mV左右,这一特征使得M通道能够在细胞静息膜电位水平附近开放。目前人们认为神经元中M电流可以发挥一种类似“细胞内在电压钳”的功能,即能对其静息膜电位、动作电位发放阈值等影响神经元兴奋性的因素进行调节,抑制神经元的过度兴奋。M通道在神经系统中有非常广泛的分布,其中在海马、皮层、外周感觉神经元以及一些交感神经元中均有明显表达。此外越来越多的实验证据表明,功能性的M通道在外周负责感觉传递的神经纤维中有表达,并且对神经纤维的兴奋性有重要调节作用。钙激活氯通道(CACC)是一类在包括神经元、平滑肌细胞及上皮细胞等诸多类型细胞有表达,并具有重要生理功能的离子通道。在神经系统中,嗅觉神经元、视锥与视杆细胞、味觉细胞及背根神经元中都存在功能性的CACC。CACC在神经细胞中的主要生理功能是促使神经元去极化,并对由其他离子通道引发的去极化起到加强作用,参与兴奋性的产生。直到最近才由三个实验室共同发现构成CACC的分子基础为跨膜蛋白16A (TMEM 16A),而这一发现使得人为通过基因手段调控CACC的功能与表达成为可能。内向整流钾离子通道(Kir)包括至少7个亚家族(Kir1-7),这些通道在组织中分布广泛,能够保持细胞内外K+平衡、维持细胞膜电位,因此在动作电位复极化过程以及调节细胞兴奋性等方面发挥重要作用。近年来有文献报道,Kir2.0家族成员因其与细胞膜PIP2结合力强弱不同,因此在对一些通道调节剂的调节作用方面表现有所区别。本研究论文以上述几种通道为出发点,利用电生理膜片钳、细胞内钙成像、小RNA干扰、原代神经元转染、双电极电压钳、激光扫描共聚焦显微镜以及动物行为学实验等技术手段,系统研究了以下几方面内容:(1)炎症介导因子缓激肽引发急性痛觉信号的离子机制;(2)炎症介导因子组胺引发KCNQ/M通道调节作用及其内在机制;(3)第一代抗组胺药物相比其他抗组胺药物在中毒剂量下更易引发严重神经系统不良反应的分子机制。论文具体内容如下:第一部分缓激肽引发急性痛觉信号的离子机制目的:研究缓激肽引发急性痛觉信号的离子机制,观察缓激肽对大鼠背根神经元中离子通道的调节作用。我们发现缓激肽能够抑制M型钾电流的同时激活一种内向离子电流。我们进行了一系列药理学实验和小RNA干扰实验来阐明缓激肽调节M电流的信号通路和这一内向电流的确切分子基础。通过电流钳实验我们又研究了这两种机制是否参与了缓激肽所引发的神经元兴奋性增高。最后通过动物行为学实验,我们在整体动物水平上研究了这两种机制在缓激肽引发动物急性疼痛行为中所发挥的作用。方法:使用打孔全细胞膜片钳观察缓激肽对背根神经元离子电流的影响。使用细胞内钙成像测定细胞内钙离子浓度变化。利用激光扫描共聚焦显微镜动态观察PIP2特异性荧光探针YFP-tubby的变化过程。使用小RNA干扰技术结合神经元细胞核转染的方法探讨缓激肽引发内向电流的分子基础。利用电流钳观察缓激肽引发的神经元兴奋性,并最后通过整体动物行为学测试法,研究相应通道调节剂对缓激肽引发的急性疼痛的作用。结果:(1)缓激肽抑制小背根神经元中的M电流:缓激肽能够剂量依赖性地抑制小背根神经元中的M电流,其抑制作用的EC50为60.0±16.3 nM。此外对背根神经元进行纯化培养后并不影响缓激肽的抑制作用。(2)缓激肽引发M电流抑制作用的信号途径:缓激肽能够在背根神经元引发PLCδ-PH-GFP出现荧光转位,而对PIP2特异性荧光探针YFP-tubby却无作用,说明缓激肽能够激活PLC,但细胞膜PIP2水平却没有明显变化。Ca2+成像实验显示缓激肽能够引发背根神经元细胞内Ca2+浓度明显增高。膜片钳实验进一步证实,缓激肽对M电流的抑制作用受到B2受体拮抗剂Hoe-140,IP3受体拮抗剂Xe-C,SERCA抑制剂thapsigargin及高浓度BAPTA电极内液的显著影响,但并不受PLA2阻断剂quinacrine和PKC抑制剂bisindolylmaleimide影响。(3)缓激肽激活TMEM16A依赖性的CACC:我们发现在缓激肽抑制M电流的同时会引发一种明显内向电流。这一内向电流对TRP通道阻断剂钌红及HCN特异性阻断剂ZD7288均不敏感。但当把电极内液换成低Cl-内液后,这一内向电流消失;而且Cl-通道阻断剂DIDS同样能够明显抑制这一电流的出现。提示这一内向电流是由Cl-通道开放而介导的。进一步的药理学实验证明,这种内向电流受Hoe-140,thapsigargin,Xe-C及高BAPTA电极内液的影响。提示这一内向电流为CACC所介导。此外利用siRNA技术使编码CACC的Tmem 16a基因沉默后,此内向电流显著降低,而缓激肽对M电流的抑制作用不受影响。(4) M通道的抑制与Ca2+激活Cl-通道的开放共同构成了缓激肽对感觉神经元的兴奋作用:在高Cl-内液环境下,缓激肽与M通道特异性抑制剂XE991均能明显增强背根神经元的兴奋性,而缓激肽的作用要强于XE991。此外二者均能使神经元细胞膜电位明显去极化。使用低Cl-内液去除CACC作用后,XE991同样能够引发神经元兴奋性,而此时若共同给予缓激肽+ XE991后,神经元兴奋性不再增加。在低Cl-内液环境下,若先给予缓激肽,再给予缓激肽+ XE991后,XE991能够在缓激肽引发兴奋性的基础上再增加兴奋性。(5) M通道增强剂能够拮抗缓激肽引发的动物疼痛表现:在动物行为学实验中,缓激肽能够引发受试动物出现明显疼痛反应。M通道增强剂retigabine和zinc pyrithione能够有效缓解缓激肽的致痛作用,然而Cl-阻断剂DIDS却对痛觉反应无明显作用。结论:(1)缓激肽对小背根神经元中M电流具有剂量依赖性抑制作用。这种作用与其他非神经元作用无关。(2)缓激肽能够激活PLC,但并不能造成细胞膜PIP2整体水平出现明显下降;缓激肽还能引发细胞内Ca2+浓度升高。缓激肽抑制背根神经元中M电流的作用依赖于B2受体、PLC和其引发的细胞内Ca2+信号。(3)缓激肽在抑制M电流的同时引发的内向电流为Ca2+激活Cl-电流。这一电流由Tmem 16a基因所编码的Ca2+激活Cl-通道所介导。(4)缓激肽对M电流与Ca2+激活Cl-电流的作用共同参与了其引发的背根神经元兴奋性增高。(5) M通道的特异性增强剂能够明显缓解缓激肽引发受试动物出现的疼痛症状。说明M通道在缓激肽引发的急性疼痛中发挥重要作用。第二部分细胞膜磷脂PIP2介导组胺对KCNQ/M通道电流调节机制的研究目的:研究组胺对HEK293表达细胞与大鼠颈上交感神经元中KCNQ/M通道电流的调节作用,并对作用机制进行信号通路的研究,并且与已知的能调节KCNQ/M电流的M1受体与BK2受体激动剂oxo-M和缓激肽进行比较,从而对G蛋白偶联受体调节KCNQ/M电流的共同机制进行更深入的了解。方法:利用膜片钳观察组胺对电流的调节作用,利用细胞内钙成像技术测定细胞内钙离子浓度变化,并使用一系列药理学方法配合激光扫描共聚焦显微镜作动态观察,详细研究组胺调节KCNQ/M电流的信号转导通路。结果:(1)组胺通过激活组胺H1受体,抑制外源性表达于HEK293细胞的KCNQ2/Q3与大鼠颈上神经元的M通道电流:当HEK293细胞外源性表达KCNQ2/Q3通道与H1受体后,组胺(10μM)能够强烈抑制通道电流,抑制率达到77.9±3.5%,并且这种作用并不受H2受体拮抗剂西咪替丁影响(p > 0.05 vs. control),但却能被H1受体特异性抑制剂美吡拉敏所阻断(p < 0.01 vs. control)。组胺还能对大鼠颈上神经元的M通道电流有抑制作用,这种抑制作用同样能被美吡拉敏阻断(p < 0.01 vs. control),且这一作用具有剂量依赖性,通过对不同浓度组胺所引发的M电流抑制作用的量效曲线进行分析,组胺抑制作用的EC50 = 3.3±1.1μM。此外通过Western blot的方法,我们也发现在颈上神经元中的却存在H1受体。(2)组胺对KCNQ2/Q3电流的抑制作用是由PLC激活所介导:我们发现组胺对电流的抑制作用能被PLC阻断剂U-73122显著降低,只有7.1±0.6% (p < 0.01 vs. control);同样对于颈上神经元中的M电流来说,组胺的抑制作用也能被U-73122所取消(p < 0.01 vs. control)。(3)组胺对KCNQ/M电流的抑制作用是由于细胞膜磷脂PIP2水解所造成的:PLCδ1-PH-GFP是一种常用的标记PIP2的荧光探针。通过LSCM观察我们发现,组胺可以明显引起PLCδ1-PH-GFP从胞膜到胞浆的转位,胞膜荧光强度可以增加80.4±6.0%,且这一过程在组胺洗脱后可逆。组胺的这一作用能被H1受体特异性抑制剂美吡拉敏与PLC抑制剂U-73122所阻断(p < 0.01 vs. control)。如果使用膜片钳研究我们发现,当用PI4-Kinase抑制剂wortmannin灌流HEK293细胞以阻断PIP2再合成后,由组胺引起KCNQ2/Q3电流抑制后的恢复程度便由给予wortmannin前的88.4±6.2%显著降低到10.5±3.4% (p < 0.01 vs. control)。另一种PI4-Kinase抑制剂PAO同样使电流被组胺抑制后的恢复程度从给药前的95.4±4.6%显著降低到6.3±0.9% (p < 0.01 vs. control)。(4)组胺对HEK293细胞表达的KCNQ电流的抑制作用不依赖于细胞内钙信号:我们发现组胺能够引起明显的细胞内钙浓度升高,并且在无钙外液下依旧存在,但是这种变化可以被PLC抑制剂U-73122很大程度上取消。在全细胞膜片钳记录模式,当细胞内通过长时间由微电极向细胞内导入钙离子螯合内液以缓冲钙信号后,由组胺引发的KCNQ电流抑制作用不受任何影响(81.3±4.0%,p > 0.05 vs. control)。此外细胞内钙库耗竭剂thapsigargin也不能影响组胺的作用(88.6±3.9%,p > 0.05 vs. control)。(5)组胺不能引发颈上神经元中钙离子浓度升高:测定细胞内钙离子在给予组胺后的变化,并与M1受体与BK2受体激动剂oxo-M,缓激肽的作用进行比较。缓激肽能够引发很明显的细胞内钙离子浓度升高,但oxo-M与组胺却不能引发细胞内钙变化。缓激肽, oxo-M和组胺所引起的荧光强度的升高分别为0.04±0.008, 0.03±0.004和0.32±0.05 (p < 0.01)。(6)组胺对颈上神经元M电流的抑制不依赖于细胞内钙信号:当使用含有0.1 mM BAPTA (低BAPTA)的细胞内液对颈上神经元进行全细胞渗透后,组胺、oxo-M和缓激肽均能不同程度抑制M电流,其抑制程度分别为38.3±7.9%, 98.8±0.4%和85.3±4.4%。当使用含有20 mM BAPTA + 10 mM CaCl2 (高BAPTA)的细胞内液对颈上神经元进行全细胞渗透后,缓激肽的作用便会被显著降低到20.5±2.6% (p < 0.01 vs. control),而组胺、oxo-M的作用分别为32.1±3.1%和87.3±7.0%,与对照相比没有明显变化(p > 0.05 vs. control)。结论:(1)组胺可以通过激活H1受体抑制外源性表达于HEK293细胞上的KCNQ2/Q3与大鼠颈上神经元中的M通道电流,且这种抑制作用具有剂量依赖性。(2)组胺对KCNQ/M电流的抑制作用与PLC的激活密切相关。(3)组胺能够引起细胞膜磷脂PIP2的水解,并且其对KCNQ电流的抑制作用很可能是由于细胞膜磷脂PIP2水解造成。(4)组胺虽能引起HEK293细胞中内钙浓度升高,但是其对KCNQ电流的抑制作用并不取决于钙信号。(5)组胺对颈上神经元中M电流的抑制也不依赖于细胞内钙信号,与已知的两种G蛋白偶联受体激动剂缓激肽与oxo-M的作用机制相比,更接近于oxo-M。因此H1受体在调解M电流的机制方面与已知的M1受体非常一致。这一发现充实并完善了G蛋白偶联受体调节KCNQ/M电流的信号途径,此外组胺对神经元M电流的抑制作用对研究其作为炎症介导因子与神经递质参与并引发神经元兴奋性的机制提供了新的方向。第三部分抗组胺药物美吡拉敏直接抑制KCNQ/M电流并且引发大鼠颈上神经元去极化目的:研究第一代H1受体抗组胺药美吡拉敏及苯海拉明对KCNQ/M通道电流的作用及其机制,并研究其对神经元兴奋性的影响,揭示第一代抗组胺药在服用过量下所引发的神经系统不良反应的分子机制。方法:利用电生理膜片钳技术,观察美吡拉敏及苯海拉明对KCNQ/M通道电流的作用,并对通道动力学特征变化进行分析;利用全细胞膜片钳细胞内渗透给药与outside-out膜片钳相结合的实验手段确定药物作用于通道的部位;利用电流钳模式记录药物对细胞膜电位以及细胞兴奋性的影响。结果:(1)美吡拉敏抑制KCNQ2/Q3通道电流并影响其动力学特征:利用细胞转染的方法,将KCNQ2/Q3基因外源性导入HEK293细胞。第一代H1受体抗组胺药美吡拉敏(100μM)能够强烈抑制KCNQ2/Q3电流,其对KCNQ2/Q3尾电流的抑制率达到92.0±1.7%。这种抑制作用很快,并且能在很大程度上被洗脱。这种作用具有剂量依赖性,其IC50 = 12.5±1.8μM。而H2受体拮抗剂西咪替丁则对KCNQ2/Q3电流没有任何作用。(2)美吡拉敏对通道动力学特征的影响:美吡拉敏可以延长电流激活段时间参数而缩短电流去活段时间参数,并且将通道I-V曲线半数激活电压从-16.9±0.9 mV右移至-7.8±1.4 mV。(3)苯海拉明也具有相似的抑制作用,其对KCNQ2/Q3的抑制率达到66.9±5.9%,并且也可以将通道I-V曲线右移。(4)美吡拉敏对KCNQ通道家族(KCNQ1-5)的作用:除对KCNQ2/Q3电流的抑制作用外,美吡拉敏还能够分别抑制KCNQ1,KCNQ2,KCNQ3,KCNQ4,KCNQ3/5等KCNQ通道成员,并且这种抑制作用均具有剂量依赖性。(5)美吡拉敏从细胞膜外面直接抑制KCNQ2/Q3通道电流:首先我们利用全细胞膜片钳的方法向表达有KCNQ2/Q3的HEK293细胞内部渗透美吡拉敏,研究药物是否通过细胞内部的作用部位发挥对KCNQ通道的抑制作用。在对照情况下,如果利用正常细胞内液进行细胞渗透,经过12分钟后,KCNQ2/Q3电流大小会降低到原来的56.0±9.0%;而使用美吡拉敏进行渗透后,电流会降低到原来的54.8±11.6%,这与对照组相比没有显著差别(p > 0.05)。而与熟知的通过受体激活引发PIP2水解而抑制KCNQ/M通道的M1受体激动剂oxo-M比较后我们发现,oxo-M对电流的抑制作用会受到PLC抑制剂U-73122的影响,而美吡拉敏则不受U-73122的任何影响。通过膜外面向外(outside-out)膜片钳实验我们进一步发现,美吡拉敏可以非常迅速且明显地抑制outside-out膜片钳记录下HEK293细胞的KCNQ电流,抑制率为90.1±2.8%。(6)美吡拉敏抑制大鼠颈上神经元中的M电流:100μM美吡拉敏也同样能够抑制颈上神经元中的M电流,其抑制率达到76.7±2.6%,且这种作用也具有剂量依赖性,IC50 = 25.7±0.7μM。此外美吡拉敏也能够引发颈上神经元明显的去极化,可将细胞膜电位从–51.0±5.6 mV去极化至–38.9±7.3 mV。若使用M通道的特异性抑制剂linopirdine事先作用于细胞后,美吡拉敏便不能在linopirdine持续存在的情况下进一步引发去极化作用。(7)美吡拉敏对神经元兴奋性的影响:我们发现虽然M通道的特异性抑制剂linopirdine的却能够明显引发神经元兴奋性增高,但美吡拉敏却并不能增高兴奋性。结论:(1)第一代H1受体抗组胺药美吡拉敏及苯海拉明能够明显抑制KCNQ/M电流,这种作用是由药物在细胞膜外侧直接阻断通道而引起。(2)美吡拉敏可以改变KCNQ通道激活与去活动力学特征,并引起通道I-V曲线右移。(3)美吡拉敏剂量依赖地抑制所有KCNQ家族成员(KCNQ1-5)。(4)美吡拉敏同样抑制大鼠颈上神经元M电流,并通过这种作用引发神经元明显去极化,但美吡拉敏却并不引起神经元兴奋性改变。第一代H1受体抗组胺药美吡拉敏和苯海拉明在大剂量情况下抑制KCNQ/M电流,并且引发神经元明显去极化的作用,很可能是导致其在中毒剂量引发病人抽搐、痉挛、癫痫等神经系统毒性作用的分子机制之一。第四部分抗组胺药物选择性抑制Kir通道目的:研究第一、二、三代H1受体抗组胺药对内向整流钾离子通道(Kir)的作用,试图揭示第一代H1受体抗组胺药在大剂量情况下所引起的神经系统毒性反应的分子机制。方法:利用分子克隆、RNA体外转录以及细胞显微注射等技术,在非洲爪蟾卵母细胞中,外源性表达Kir2.1,2.3,3.4及Kir2.3突变体通道蛋白,再利用双电极电压钳记录卵母细胞全细胞电流。观察大剂量情况下各种H1受体抗组胺药对通道电流的作用。结果:(1)抗组胺药对表达于卵母细胞Kir2.3通道电流的作用:在高钾外液孵育下的Kir2.3通道呈现明显的内向整流特性,其反转电位位于0 mV附近。外液给予第一代H1受体抗组胺药美吡拉敏(100μM)或苯海拉明(100μM)后,Kir2.3通道电流均受到明显抑制,其抑制率分别为25.0±2.9%和17.3±0.7%。而第二代及第三代H1受体抗组胺药以及H2受体阻断药阿司咪唑,地氯雷他定及西咪替丁对Kir2.3通道没有任何作用。通过对通道I-V曲线进行分析,美吡拉敏对Kir2.3的抑制作用无电压依赖性。美吡拉敏及苯海拉明能剂量依赖地抑制Kir2.3电流,其IC50分别为306.4μM和689.2μM。(2)抗组胺药对表达于卵母细胞Kir2.1通道电流的作用:第一代H1受体抗组胺药美吡拉敏(100μM)及苯海拉明(100μM)对Kir2.1电流没有明显影响。同样如果给予其他类型药物,包括阿司咪唑,地氯雷他定及西咪替丁,均对Kir2.1电流没有影响。(3)抗组胺药对Kir电流的选择性作用与通道―PIP2相互作用程度有关:如果利用分子生物学方法进行点突变,将Kir2.3位于213位的异亮氨酸置换为亮氨酸(即Kir2.3(I213L)),而增强通道与细胞膜磷脂PIP2的亲和力后,我们发现美吡拉敏对通道电流的抑制作用会被明显削弱。此外通过利用另一种与PIP2结合力较弱的Kir3.4进行实验后我们发现,美吡拉敏能明显抑制其电流,抑制率为30.3±4.6%。因此美吡拉敏对Kir电流抑制率大小顺序为Kir3.4 > Kir2.3 > Kir2.3 (I213L) > Kir2.1,而这与以往关于关于Kir通道与PIP2亲和力所报道的顺序一致。(4)第一代H1受体抗组胺药通过抑制Kir2.3电流引发卵母细胞膜电位去极化:在表达了Kir2.3通道后,卵母细胞膜电位为-95.2±2.3 mV。外液给予美吡拉敏后,可以引起细胞膜电位逐渐去极化,达稳态后,膜电位去极化至-57.1±6.1 mV。苯海拉明也具有相似效应,可将卵母细胞膜电位去极化至-70.0±3.4 mV。结论:(1)第一代H1受体抗组胺药美吡拉敏和苯海拉明能够明显抑制Kir2.3通道电流,且作用具有剂量依赖性,而第二、三代H1受体抗组胺药以及H2受体拮抗剂阿司咪唑,地氯雷他定及西咪替丁对Kir2.3没有任何作用。(2) Kir2.1通道对任何抗组胺药均不敏感。(3)美吡拉敏对Kir2.1与Kir2.3通道之间作用的明显差别很可能源于通道与PIP2的亲和力大小。美吡拉敏也同样能抑制与PIP2亲和力较弱的Kir3.4通道电流。(4)通过抑制表达于爪蟾卵母细胞的Kir2.3通道电流,美吡拉敏可以明显引发卵母细胞去极化。因此第一代H1受体抗组胺药对Kir2.3通道的抑制作用很可能也是其服用过量或中毒情况下引发神经系统毒性作用的分子机制之一。总结1缓激肽能够剂量依赖地抑制存在于小背根神经元中的M电流,缓激肽通过作用于其B2受体,能够激活PLC,导致由IP3介导的内Ca2+释放。由缓激肽所引发的细胞内Ca2+信号能够同时引发M电流的抑制与Ca2+激活Cl-通道的开放。这两种通道的共同作用足以引发背根神经元的去极化并导致其兴奋性的增高。在动物行为学实验中,M通道的特异性增强剂能够显著缓解由缓激肽所引发的疼痛效应。上述实验结果揭示了缓激肽引发炎症性疼痛的详细分子机制,并为炎症性疼痛的治疗提供了崭新方向。2组胺能够抑制HEK293细胞与大鼠颈上神经元中的KCNQ/M通道电流,这一作用是通过H1受体―PLC信号通路引发的PIP2水解所造成的,而与细胞内钙信号无关。与作用已知的两种G蛋白偶联受体激动剂缓激肽与oxo-M相比,组胺对M通道抑制作用的机制更接近于oxo-M。因此H1受体在调解M电流的机制方面与M1受体非常一致。3第一代抗组胺药物美吡拉敏与苯海拉明能够剂量依赖性的抑制外源性表达于HEK293细胞中的KCNQ2/Q3通道电流。美吡拉敏影响通道的激活、失活动力学,并使其I-V曲线显著右移。美吡拉敏除对KCNQ2/Q3电流有抑制作用外,还能剂量依赖地抑制所有KCNQ通道家族成员(包括KCNQ1-4和KCNQ3/Q5)。美吡拉敏还能抑制大鼠颈上神经元中的M电流,并由此引发神经元显著去极化。美吡拉敏和苯海拉明对KCNQ/M通道抑制作用的IC50均位于临床上所观察到的中毒血药浓度范围之间。因此第一代抗组胺药物对M通道的抑制及由此引发的神经元去极化效应很可能导致其中毒剂量下病人所出现的神经系统毒性症状。4第一代抗组胺药物美吡拉敏与苯海拉明能够剂量依赖地抑制外源性表达于卵母细胞中的Kir2.3通道电流,并能由此产生去极化效应;而第二与第三代抗组胺药物阿斯咪唑及地氯雷他定则无作用。上述所有药物则对Kir2.1通道电流无作用。美吡拉敏同样能够抑制Kir3.4通道电流。美吡拉敏对Kir通道的选择性抑制作用很可能与通道和细胞膜磷脂PIP2的亲和力存在一定关系。
孙美艳[9]2014年在《钙激活氯离子通道ANO1在卵巢颗粒细胞中的表达与功能》文中提出钙激活氯离子通道（calcium-activated chloride channel，CaCCs）是一类受细胞内钙离子调节的氯离子通道，广泛表达于各种组织并参与许多生理过程。2008年，未知功能的跨膜蛋白16A（transmembrane protein16A，TMEM16A，也称为ANO1）被确定为钙激活氯离子通道。近些年来，对ANO1钙激活氯离子通道蛋白结构与功能的研究成为一个热点领域，发现ANO1在唾液腺和肠道液体分泌、感觉神经传导、血管平滑肌和胃肠平滑肌的收缩调控等生理功能中发挥重要作用。但是，ANO1在生殖系统的表达和功能目前鲜有报道。卵泡发育是一个十分复杂的过程并处于严格的调控系统当中，主要受到促性腺激素、性腺类固醇激素和一些局部因子的调节。卵巢颗粒细胞中所产生的雌激素在维持卵泡正常发育以及调节雌性生殖系统的结构和功能中发挥着重要的作用。雌激素水平的异常会引起卵泡发育障碍，导致女性内分泌紊乱和生育期女性不孕，如多囊卵巢综合症，卵巢早衰等；严重的可诱发生殖系统肿瘤，如卵巢癌、颗粒细胞癌等。本篇论文是研究钙激活氯离子通道ANO1在小鼠卵巢中的表达以及它在雌激素调节中所发挥的作用，为卵泡发育和排卵调节的分子机制提供了新思路。【目的】钙激活氯离子通道ANO1在小鼠卵巢中的表达以及它在卵泡发育和排卵过程中的功能和分子机制【方法】1.通过RT-PCR和Western Blot技术确定钙激活氯离子通道ANO1的mRNA和蛋白在小鼠卵巢中表达水平，通过免疫组织化学染色和免疫荧光技术分析钙激活氯离子通道ANO1在小鼠卵巢中表达定位。2.通过膜片钳技术（全细胞膜片钳和内面向外式膜片钳）对新鲜分离的卵巢原代颗粒细胞进行了电生理学特征分析，并分别使用了氯离子通道抑制剂（NFA）和钙激活氯离子通道ANO1的选择性抑制剂（T16Ainh-A01）来确定钙激活氯离子通道ANO1的电生理特征。3.使用慢病毒载体介导的shRNA下调了原代培养的颗粒细胞中ANO1的表达量，通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测了ANO1下调后雌激素量的变化。为了确定钙激活氯离子通道ANO1的通道活性是否影响雌激素合成的量，我们在原代培养的颗粒细胞中使用了钙激活氯离子通道ANO1的选择性激活剂（Eact）和选择性抑制剂（T16Ainh-A01）。并通过Western Blot技术以及使用MEK/ERK信号通路抑制剂U0126分析了钙激活氯离子通道ANO1调节雌激素合成的分子机制。4.通过以下3个实验分析钙激活氯离子通道ANO1的表达规律。（1）通过观察小鼠阴门外观及对小鼠阴道脱落细胞进行巴氏染色确定了小鼠的发情周期，应用实时定量PCR技术分析了处于不同发情周期的小鼠卵巢中钙激活氯离子通道ANO1表达量的变化。（2）使用孕马血清（PMSG）和人绒毛膜促性腺激素（hCG）模拟了小鼠的卵泡发育和排卵过程，应用实时定量PCR技术分析了排卵过程中不同时间点小鼠卵巢颗粒细胞中钙激活氯离子通道ANO1表达量的变化。（3）体视显微镜下分离不同直径大小的卵泡，通过免疫组织化学染色和Western Blot技术，分析钙激活氯离子通道ANO1表达量的变化。5.使用脱氢表雄酮DHEA诱导多囊卵巢综合症的小鼠模型，通过HE染色观察小鼠卵巢的形态变化；Western Blot技术分析钙激活氯离子通道ANO1表达量的变化；ELISA方法检查小鼠血清中雌激素水平。【结果】1. RT-PCR结果表明ANO1、ANO4、ANO6和ANO10的mRNA在小鼠卵巢和原代培养的颗粒细胞中表达。Western Blot结果表明钙激活氯离子通道ANO1的蛋白（~114kDa）在小鼠卵巢和原代培养的颗粒细胞中也表达。免疫组织化学染色表明在小鼠卵巢颗粒细胞上有强特异性染色，其他细胞类型（卵泡膜细胞、间质细胞、卵母细胞和卵巢表面上皮细胞）也有染色，但相对较弱。对原代培养的颗粒细胞进行ANO1免疫荧光染色，结果显示ANO1表达于卵巢颗粒细胞质膜上。2.单一的卵巢颗粒细胞用全细胞膜片钳方式记录到的电流在600nM [Ca2+]i时具有明显的外向整流特征，同时又具有钙依赖性和电压依赖性，这都符合经典CaCCs的电流特征。且这种电流可以被ANO1选择性抑制剂T16Ainh-A01所抑制，这提示卵巢颗粒细胞中的CaCCs是由ANO1所介导的。内面向外式膜片钳记录到的电流具有以下特征：当细胞钳制电位为50mV的时候，0[Ca2+]i时，没有得到电流；[Ca2+]i为1μM的时候电流为10pA左右，且此电流可被氯离子通道抑制剂NFA和ANO1选择性抑制剂T16Ainh-A01所抑制，进一步证实卵巢颗粒细胞中的CaCCs是由ANO1所介导的。3. Western Blot结果表明以慢病毒为载体的靶向卵巢颗粒细胞ANO1的shRNA对原代培养的颗粒细胞中ANO1蛋白表达的抑制率平均为70%左右。ELISA结果显示在原代培养的颗粒细胞中下调ANO1的表达或者是使用ANO1特异性抑制剂T16Ainh-A01都能够提高雌激素的合成量，相反使用了ANO1特异性激活剂Eact，可以显著的抑制雌激素的合成。ANO1的表达或激活可以增加MEK和ERK1/2的磷酸化同时降低芳香化酶的表达量。使用了MEK抑制剂U0126后可以去除ANO1选择性激活剂Eact对MEK和ERK1/2磷酸化的调节作用，这提示ANO1可能是经过MEK/ERK信号通路对雌激素的合成具有负性调控作用。4.在小鼠的发情周期中的发情前期和发情期，ANO1的表达量明显增加。体内试验表明PMSG可以诱导卵巢颗粒细胞中ANO1的表达，同时hCG也可进一步增加ANO1的表达量。对不同直径大小卵泡中ANO1表达量进行免疫组织化学染色和Western Blot的结果显示在卵泡发育阶段，随着卵泡的体积变大，ANO1的表达量也随之增多，ANO1的表达量在排卵前卵泡中最多，而在排卵结束后形成的黄体中ANO1的表达量下调明显。5.在DHEA诱导的小鼠多囊卵巢综合症（PCOS）模型中，与对照组相比较，模型组中卵巢颗粒细胞ANO1的mRNA和蛋白的表达明显下调且小鼠血清中的雌激素明显上升。【结论】1.首次发现钙激活氯离子通道ANO1表达于哺乳动物卵巢颗粒细胞的质膜上。2.小鼠卵巢颗粒细胞上的钙激活氯离子电流是由ANO1所介导。3.小鼠卵巢颗粒细胞上钙激活氯离子通道ANO1是通过MEK/ERK途径下调芳香化酶的表达进而对雌激素的合成具有负性调节作用。4.在小鼠发情周期中ANO1的表达具有时期特异性且受到促性腺激素的调节。ANO1可能参与了LH排卵峰诱导的排卵过程，为卵泡发育和排卵调节的分子机制提供了新思路。5.在DHEA诱导的小鼠PCOS模型中，卵巢颗粒细胞中ANO1的表达显著下调。【意义】本研究首次发现了钙激活的氯离子通道ANO1表达于卵巢颗粒细胞的质膜上，以此发现为研究基础，深入的研究了钙激活的氯离子通道ANO1在颗粒细胞中的重要生理功能，可能是经过MEK/ERK信号通路对雌激素的合成具有负性调控作用，可能参与调节卵泡的发育与排卵，为卵泡发育和排卵调节的分子机制提供了新思路。
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