任庆亚[1]2014年在《鸡CpG核酸免疫活性分子的筛选及其对ALV亚单位疫苗的免疫增强作用》文中研究指明CpG寡聚核苷酸(CpG oligodexynucleotides,CpG ODN)是一类以非甲基化的CpG为核心的DNA序列,能够激活哺乳动物Toll样受体9(Toll-like receptor,TLR9)和鸡TLR21,促进T/B淋巴细胞增殖,诱导单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞活化以及细胞因子的表达,调节免疫反应；临床上可作为免疫治疗剂和免疫增强剂而倍受关注。些研究表明,这类核酸免疫增强剂具有结构、种属差异性,能否筛选到适用于鸡,增强鸡白血病病毒亚单位疫苗的这一类佐剂尚未见报道。本研究设计并人工合成了四种不同碱基长度的CpG ODNs未甲基化的全硫代修饰的CpG ODNs,依次命名为CpG-Ⅰ、CpG-Ⅱ、CpG-ⅡI和CpG-Ⅳ和不同程度硫代化修饰的CpG ODNs,分别命名为CpG-S1、CpG-S2、CpG-S3;使用SPF鸡血液和脾细胞对它们的淋巴细胞增殖活性进行体外筛选；再分别与原核表达的ALV亚单位疫苗抗原等联合接种雏鸡和种母鸡,观察对疫苗抗体的免疫增强效果、TLR21mRNA表达、细胞增殖等作用。结果表明,几种CpG ODNs均能刺激鸡血液、脾淋巴细胞增殖,其中CpG-Ⅱ刺激效果最佳,部分硫代化修饰的CpG刺激效果较好,不同CpG浓度刺激效果差异显着。与疫苗抗原联合接种雏鸡后,四种不同长度的CpG佐剂都能增加ALV亚单位疫苗抗原的抗体效价和抗体阳性率,其中CpG-Ⅳ组的抗体效价最高,且最早出现阳性鸡只,但CpG-Ⅲ组在二免后第二周鸡只的抗体阳性率最高；碱基不同硫代化修饰影响ALV-J抗体效价,全部碱基硫代化修饰的CpG-S3免疫组抗体效价最高；含CpG ODN组鸡只抗体阳性率均高于无CpG ODN组,在一免后第二周CpG-S3组鸡只抗体阳性率最高,二免后CpG-S2组抗体阳性率最高。不同长度的CpG佐剂对禽流感H5二价灭活疫苗抗体滴度均具有增强效果,其中碱基数最多的CpG佐剂免疫增强效果最强；不同硫代化修饰对灭活苗免疫增强作用影响显着,其中全部碱基硫代化效果最佳。不同长度和不同硫代化修饰的CpG免疫鸡后脾脏TLR21mRNA的表达高于对照组,其中CpG-Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ诱导效果较好,组间没有显着性差异；部分硫代化修饰的CpG-S1/S2诱导效果也较好。不同长度的CpG免疫鸡后脾淋巴细胞增殖活性增加不显着,但硫代化程度越高,对免疫雏鸡的脾淋巴细胞增殖越好。全部硫代化修饰的CpG-Ⅳ联合ALV-A gp85亚单位疫苗抗原接种母鸡后,血清抗体和雏鸡母源抗体均显着升高,为其用于免疫种鸡场母鸡,诱导母源抗体阻断ALV-A垂直传播提供物质基础。以上结果可以看出,CpG不同结构影响其生物学活性,硫代化修饰可以增强其对ALV亚单位疫苗的免疫效果。
唐泰山[2]2001年在《新型免疫佐剂细菌核酸动物免疫增强试验》文中研究说明用细菌DNA单独或与不同疫苗配合免疫小鼠、豚鼠、犬、鸡等动物，证明细菌DNA具有强烈的免疫增强作用，能刺激多种动物特异性和非特异性免疫反应，并提高机体的体液免疫和细胞免疫，无不良反应，可望成为一种新型免疫佐剂。 用细菌DNA腹腔注射小鼠，能强烈地刺激小鼠脾淋巴细胞向S期与G2-M期转化，并且单链DNA的免疫刺激活性高于双链DNA，双链DNA与弗氏完全佐剂相当，弗氏完全佐剂明显高于弗氏不完全佐剂。 用细菌DNA分别与犬细小病毒灭活疫苗和猪链球菌溶血素配合，免疫小鼠或10日龄豚鼠，能增强小鼠和豚鼠的特异性体液免疫与细胞免疫，免疫增强效果明显高于铝胶与蜂胶等常规佐剂，与弗氏完全佐剂相当。合成的单链CpG-ODN免疫刺激活性高于细菌双链DNA。 用细菌DNA与犬瘟热病毒灭活苗配合，接种80只犬，用微量中和试验法抽查接种前后病毒中和抗体滴度，所诱导的特异性抗体明显高于铝胶与蜂胶佐剂组。 用细菌DNA作为鸡新城疫灭活苗的佐剂，接种15日龄雏鸡，用血凝抑制实验检测病毒特异性血凝抑制抗体，所诱导的特异性抗体与油佐剂相当。但细菌DNA组的雏鸡增重明显高于油佐剂组，显示细菌DNA对雏鸡生长无抑制作用。
宋新宇, 张七斤, 张和平, 孟和毕力格[3]2006年在《乳酸杆菌DNA对鸡新城疫油苗和禽流感油苗免疫增强作用的研究》文中提出本试验提取乳酸杆菌L.caseiZhang的DNA作佐剂,按每只鸡100ug剂量添加到新城疫油苗及禽流感病毒H5亚型油苗中。新城疫和禽流感试验分别设空白对照组(Ⅰ组)、无佐剂疫苗组(Ⅱ组)、细菌核酸佐剂组(Ⅲ组)、弗氏完全佐剂组(Ⅳ组)、弗氏完全佐剂核酸免疫协同组(Ⅴ组)5组进行免疫,分别于15和28日龄首免,两周后二免。二免后每周采样用血凝及血凝抑制法检测血清抗体水平,并用MTT法检测脾脏T淋巴细胞增殖反应。结果显示,添加核酸组鸡HI抗体和T淋巴细胞增殖反应均极显着高于单独免疫疫苗组(P<0.01);而免疫组均极显着高于空白对照组(P<0.01);细菌核酸组HI抗体略高于弗氏完全佐剂组,但T淋巴细胞转化率极显着高于弗氏完全佐剂组(P<0.01);同时弗氏完全佐剂核酸免疫协同组与核酸组无显着性差异。由此得出,乳酸杆菌L.caseiZhangDNA对新城疫油苗和禽流感病毒H5亚型油苗具有免疫增强作用;乳酸杆菌L.caseiZhangDNA与弗氏完全佐剂无明显的免疫协同作用。
赵现敏[4]2007年在《中药多糖的免疫增强活性及其对抗体生成影响的研究》文中提出为筛选新型免疫增强剂,并研究其在临床上的应用,用水提醇沉法从传统中草药板蓝根、黄芪、山药和牛膝中提取和制备了板蓝根多糖、黄芪多糖、山药多糖和牛膝多糖,采用体内试验与体外试验相结合的方法,研究了4种多糖对特异性免疫因素和非特异性免疫因素的影响,并通过动物试验比较了它们各自在临床应用时的免疫增强效果,试验成功地筛选出了免疫增强活性较好的中药多糖及其剂量,作为低毒、高效的新型免疫增强剂,以便为这些中药多糖作为畜禽免疫增强剂,尤其猪用免疫增强剂提供理论和临床依据。试验分为5部分,如下所述:试验1本试验用水提醇沉法从板蓝根、山药、黄芪和牛膝中提取和制备了板蓝根多糖、黄芪多糖、山药多糖和牛膝多糖,并用硫酸葸酮比色法测定了其含量。4种中药多糖的净含量分别为:板蓝根多糖,58%;山药多糖,73%;黄芪多糖,65%;牛膝多糖,54%。以此作为后面试验的材料,为整个试验研究打下了基础。试验2为从板蓝根多糖、山药多糖、黄芪多糖和牛膝多糖中初步筛选免疫活性较好的中药多糖,用小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能、血清溶血素和溶血空斑形成试验,观察了4种多糖对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能、血清溶血素和溶血空斑形成的影响。结果表明,4种多糖均能提高小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬率和吞噬指数,与对照组比较差异显着(P＜0.05和P＜0.01),能使小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能加强,从而加强机体的非特异性免疫作用;4种多糖也能显着提高小鼠血清溶血素含量和凝集素水平,与对照组比有极显着性差异(P＜0.01),说明这些多糖均能较好地提高小鼠的体液免疫水平,促进抗体的生成。试验3为筛选免疫活性较好的中药多糖和研制新型猪用免疫增强剂,用MTT比色法比较了不同浓度的板蓝根多糖、牛膝多糖、山药多糖和黄芪多糖对猪脾脏淋巴细胞增殖的影响。结果表明,IRPS,ABPS,CYPS,APS均能显着刺激ConA或LPS诱导的猪脾淋巴细胞增殖(p＜0.05),且4种多糖促进猪脾淋巴细胞增殖的作用与多糖浓度有关。试验4为选择具有免疫增强活性的中药多糖及其最佳作用剂量,用淋巴细胞转化试验测定了不同浓度的板蓝根多糖、黄芪多糖、山药多糖和牛膝多糖对体外培养猪脾脏淋巴细胞增殖功能的影响。结果表明,IRPS,APS,CYPS,ABPS均能显着地直接或协同LPS,ConA诱导的猪脾脏淋巴细胞增殖(P＜0.05);4种多糖促进猪脾脏淋巴细胞增殖的作用与多糖浓度密切相关,且不同多糖促进淋巴细胞增殖的最佳剂量不同。试验5为研究免疫增强剂在临床上的应用,用板蓝根多糖、黄芪多糖、山药多糖和牛膝多糖在PRRSV灭活疫苗免疫小猪后,将高、低剂量的4种中药多糖,一天一次,连续3天分别皮下注射,然后用ELISA试剂盒检测血清中的抗体水平,观察各种多糖对PRRSV灭活疫苗的免疫增强效果。结果发现,四种中药多糖的峰值抗体水平由高到低的顺序依次为IRPS＞CYPS＞APS＞ABPS,各组平均值均显着高于疫苗对照组(P＜0.05),表明IRPS、CYPS、APS和ABPS均具有明显提高猪特异性抗体的作用。上述研究结果表明,板蓝根多糖、山药多糖、黄芪多糖和牛膝多糖能够有效地促进小鼠的免疫机能,促进猪脾淋巴细胞增殖,提高猪抗体水平,表明4种中药多糖具有非特异性免疫、细胞免疫和体液免疫增强作用,从而为这些中药多糖作为畜禽免疫增强剂,尤其猪用免疫增强剂提供理论和临床依据。
张德庆[5]2011年在《C3d分子佐剂核酸疫苗的构建与免疫效果研究》文中研究表明近年来,随着分子生物学、免疫学理论和技术的发展,运用基因重组表达技术研制预防、治疗用生物制品己经成为免疫学领域研究的热点,其中核酸(DNA)疫苗倍受青睐。该疫苗是继灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗及基因工程疫苗后的新一代疫苗。核酸疫苗具有同时激发机体体液和细胞免疫应答、使用安全、易于生产等优点,并可将多种基因联合在一起制成基因联合疫苗。然而由于DNA疫苗蛋白表达量低,激发的免疫应答较弱,从而限制了其开发应用速度。因此,提高DNA疫苗的免疫效果已成为基因免疫研究中急需解决的问题;目前常采用新型分子佐剂,如白细胞介素、干扰素、胸腺肽和补体分子佐剂等是提高DNA疫苗免疫效果的重要措施,其中补体C3d分子佐剂倍受人们的关注。补体C3d分子是补体C3被抗原激活以后的最终裂解片段,能够促进抗原提呈细胞对抗原的摄取、提呈作用,增强机体的免疫应答能力。因此,C3d已经成为核酸疫苗有效的新型分子佐剂。但是C3d作为分子佐剂具有种属差异性,不同种动物间C3d免疫增强作用的差异性需要作进一步的研究。PRRSV GP5基因编码的GP5蛋白为糖基化囊膜蛋白,该蛋白具有较好的免疫原性,能诱导机体产生特异性体液免疫和细胞免疫。invH基因是沙门氏菌A-E群的高度保守基因,编码吸附和侵袭上皮细胞表面的蛋白,该蛋白决定沙门菌对肠粘膜细胞的侵袭力。本研究首先对哺乳动物猪、鼠的C3d基因进行克隆及序列测定分析,并探讨了不同种动物(猪、鼠、鸡、鸭)间补体C3d在基因水平上的相关性和差异性,然后以PRRSV GP5为模型基因,利用鼠、猪(哺乳动物)C3d的受体结合功能区p28和鸡、鸭(禽类动物)C3d的受体结合功能区p29作为分子佐剂,构建了C3d-p28(29).n(n=2、4、6)多聚体分子佐剂PRRSV GP5核酸疫苗和沙门氏菌pcDNA3.1-invH-mC3d -p28.6核酸疫苗;用构建的核酸疫苗免疫小鼠并对其免疫效果进行了体液和细胞免疫主要指标的检测,探讨不同动物C3d-p28(29)对核酸疫苗的免疫增强作用。本研究主要包括四部分内容:1、哺乳动物猪、鼠补体C3d基因的克隆及序列分析:为了获得哺乳动物(猪、鼠)的补体C3d基因克隆并比较同禽类动物(鸡、鸭)C3d基因序列的差异性,首先从哺乳动物鼠、猪的肝组织中提取总RNA,通过RT-PCR扩增C3d基因的cDNA,琼脂糖凝胶电泳鉴定后直接克隆到pMD18-T载体,构建pMD18-T-C3d重组质粒,转化大肠杆菌,酶切鉴定并进行序列测定,然后进行C3d序列和CR2结合区同源性比较分析。电泳结果显示,分别在936bp和888bp处呈现明亮的条带,成功获得了鼠和猪的C3d基因克隆。序列分析结果表明,哺乳动物(猪、鼠)和禽类(鸡、鸭)的补体C3d基因同源性仅为64%;进化树显示,哺乳动物与禽类的亲缘关系越近,C3d基因进化关系也越近。哺乳动物(猪、鼠)与禽类(鸡、鸭)C3d基因的CR2结合区比较分析发现,禽类为29个氨基酸,而哺乳动物为28个氨基酸,两类动物该区氨基酸的同源性仅为62%,而鼠、猪两种哺乳动物之间、鸡、鸭两种禽类动物之间的同源性分别达82.8%和84%,证明补体C3d及CR2结合区具有种属的差异性。2、不同动物C3d分子佐剂PRRSV GP5核酸疫苗的构建:为探明不同动物C3d分子佐剂在核酸疫苗中的免疫增强作用,在上述试验克隆了动物C3d cDNA的基础上,设计引物克隆C3d-p28(29)至pUC19载体,利用同裂酶BamHⅠ和BglⅡ构建多聚体C3d-p28(29).n,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)上;然后以RT-PCR扩增的PRRSV GP5基因作为模式基因,定向克隆至真核表达载体pcDNA3.1-C3d-p28(29).n中p28(29).n上游,构建pcDNA3.1-GP5-C3d-p28 (29).n重组质粒。酶切结果显示,电泳后在807、987、1167bp处分别出现了明亮的条带,表明成功构建了含有补体C3d-p28(29)多聚体分子佐剂的PRRSV GP5核酸疫苗(pcDNA3.1-GP5-C3d-p28(29).n)。3、不同动物C3d分子佐剂对PRRSV GP5核酸疫苗免疫增强效果研究:为了探索不同动物C3d分子佐剂对PRRSV GP5核酸疫苗的免疫增强作用及差异性,在构建了鼠、猪、鸡、鸭四种动物补体C3d-p28(29).n PRRSV GP5核酸疫苗(pcDNA3.1-GP5-C3d-p28(29).2.4.6)及pcDNA3.1-GP5核酸疫苗的基础上,分别提取质粒,通过脂质体转染至Marc145细胞进行瞬时表达,并免疫BALB/c小鼠,然后利用不同ELISA试剂盒分别检测各免疫组小鼠的GP5抗体水平和IL-4、IFN-γ含量。结果表明,以补体C3d-p28(29).n为分子佐剂的PRRSV GP5基因重组疫苗均可在Marc145细胞内进行表达;连接不同动物C3d-p28(29)2,4,6聚体的核酸疫苗免疫鼠血清中GP5抗体水平、IL-4和IFN-γ含量均比空载体(pcDNA3.1)和pcDNA3.1-GP5对照组的升高,差异均显着(P<0.05),其中以pcDNA3.1-GP5-p28(29).6组的效果最佳,但均不如PRRSV油乳剂灭活苗组的效果好。另外,含有C3d-p28(29).n(n=2,4,6)相同聚体的疫苗免疫组小鼠血清中的GP5抗体水平、IL-4和IFN-γ含量两两比较无差异性。4、鼠C3d分子佐剂沙门氏菌invH基因核酸疫苗的构建及免疫效果研究:为了进一步探讨分子佐剂C3d在细菌核酸疫苗中的免疫增强作用,以沙门氏菌invH为核酸疫苗的模式基因,构建了pcDNA3.1-invH-mC3d-p28.6重组质粒,免疫BALB/c小鼠并检测了小鼠血清中invH抗体和IL-4、IFN-γ的含量,然后进行小鼠攻毒保护试验。结果表明,小鼠血清中invH抗体水平、IL-4和IFN-γ的含量与pcDNA3.1、pcDNA3.1-invH对照组比较,差异均显着(P<0.05)。通过攻毒试验结果表明,pcDNA3.1-invH-mC3d-p28.6核酸疫苗对小鼠的免疫保护率高于pcDNA3.1-invH组,差异显着(P<0.05),与空白组和pcDNA3.1组比较,差异均极显着(P<0.01),但核酸疫苗的保护效果不及灭活疫苗。本研究结果探明了动物C3d分子佐剂对病毒及细菌核酸疫苗的免疫增强作用,为开发利用不同动物C3d分子佐剂研制其他病原的核酸疫苗提供了理论依据和技术支持。
孔庆波[6]2005年在《转移因子增强犬细胞免疫功能的作用机理研究》文中研究说明转移因子(transfer factor,TF)由T 淋巴细胞产生,分子质量小,化学本质为小肽与寡聚核苷酸复合物。TF 能够将供体的细胞免疫功能转移给受体,尤其是非特异性TF 能够提高受体天然免疫和特异性免疫功能的特性使其在人类和多种动物疾病防治中获得普遍应用。弄清TF 增强犬免疫功能的细胞和分子机制,无疑将为TF 临床用于犬病尤其是犬传染病的防治提供理论依据和指导。本研究首先提取制备了研究所需要的猪、犬TF,然后选择杂种牧羊犬作为实验犬,用淋巴细胞转化增殖试验MTT 法、流式细胞技术、ELISA、吞噬杀伤试验MTT 法,检测了实验犬注射猪TF、犬TF 前后不同时间的淋巴细胞增殖效果、T 细胞亚群的变化、在免疫应答调控中起重要作用的细胞因子(IL-2、IL-12、IL-4 和IFN-γ)分泌量的变化、外周血中性粒细胞吞噬杀伤活性的变化。在此基础上,用猪TF 等联合治疗人工感染和自然发病的犬细小病毒病,对猪TF 的效果进行评估。试验获得如下结果:1.制备的猪、犬TF 理化性质相似,所制备的TF 可供本研究使用。2.淋转试验中,PHA-P 在12.5μg/mL 时对犬淋巴细胞有促进增殖的作用,但t 检验分析表明,其促进淋巴细胞增殖的效果并不显着。ConA 在浓度为0.5～2.5μg/mL 范围内均可以显着刺激T 细胞的增殖(P<0.05),且在浓度为2.5μg/mL 时刺激效果最佳。LPS在浓度为40μg/mL 时,能够显着刺激B 细胞增殖;同种、异种TF 均可以单独刺激犬淋巴细胞增殖,但同种TF 的作用效果要优于异种TF。在协同PHA-P 刺激淋巴细胞增殖时,同种TF 的作用在较大的浓度范围内(0.097～12.5mg/mL)能够显着刺激犬淋巴细胞的增殖,而异种TF 只在较小的浓度范围内(0.097～3.125mg/mL)能够显着刺激犬淋巴细胞的增殖;但在协同ConA 刺激淋巴细胞增殖时,同种TF 的作用却在较小的浓度范围内(0.097～0.78mg/mL)能够显着刺激犬淋巴细胞的增殖,而异种TF 只在浓度范围0.78～3.125mg/mL 内能够显着刺激犬淋巴细胞的增殖。注射异种TF 后,在6～10d 内,犬淋巴细胞单独增殖的能力越来越强。注射了异种TF 的犬,其淋巴细胞再次受到TF 单独或协同丝裂原刺激时,淋巴细胞的增殖能力呈现早期(4～6d)下降趋势,后期(6d 后)受到抑制的现象。3.同种、异种TF 均可提高犬外周血淋巴细胞数量,CD4/CD8 比值变化分析证实,外周血增加的淋巴细胞中主要为CD4+ T 细胞。犬注射同种、异种TF 后在20d 内CD4+ T 细胞呈现持续增加的规律。同种TF 促进犬外周血CD4+ T 细胞上升的作用优于异种TF。4.犬注射同种、异种TF,均可提高淋巴细胞分泌IFN-γ。注射犬TF 后第10 天,犬
刘栋[7]2010年在《畜禽补体C3d基因克隆及序列分析和重组鸡C3d免疫佐剂效果研究》文中认为在生产实践中,传统的疫苗(弱毒苗、灭活苗)对防治动物疫病发挥了重要作用,但近年来该类疫苗暴露出来的免疫效果不佳等缺陷,使研制更安全、高效、廉价的新型疫苗显得非常迫切和必要。基因疫苗主要由真核表达载体和保护性抗原基因构成,此种疫苗与传统疫苗相比,具有设计灵活、安全性高、性质稳定、成本低、同时诱导体液免疫和细胞免疫等优点。然而核酸疫苗存在的问题是产生抗体慢且水平低,需要加入有效的佐剂才能克服这些缺陷;核酸疫苗的佐剂需用分子佐剂,分子佐剂主要有干扰素分子佐剂、白细胞介素分子佐剂、胸腺肽分子佐剂及C3d分子佐剂等,其中C3d分子作为一种新型分子佐剂日益引起人们的关注。补体C3是机体补体激活的经典途径、替代途径以及甘露聚糖结合凝集素(MBL)途径的交汇点的中心成分,是宿主防御机能的一个分子。C3d片段是补体C3的裂解片段之一,是C3分子α链不能被蛋白酶再裂解并仍保持与抗原共价连接的最小片段,具有广泛的免疫学功能。其可以直接与抗原递呈细胞(APC)上的CR2受体结合,从而降低淋巴细胞的活化阈,提高抗原分子的免疫原性。因此,C3d被认为是一种具有研究、开发应用价值的核酸疫苗分子佐剂。鉴于上述研究背景,本研究在对不同动物补体C3d基因克隆及序列测定比较分析的基础上,探讨了补体C3d在不同畜禽间基因水平上的相关性和差异性;验证了鸡补体C3d原核表达重组蛋白(rChC3d)对大肠杆菌疫苗和新城疫灭活油乳苗的免疫增强作用;然后采用新城疫病毒F基因为试验材料、以鸡补体C3d的受体结合功能区P29作为分子佐剂,构建了C3d-P29.n(n=2、4、6)多聚体分子佐剂新城疫F基因疫苗,并经过检测证明了其具有较好的免疫保护效果。本研究成果为以后研制禽类的其他有效细菌及病毒性疫苗提供了理论基础和技术支撑。本研究主要内容如下:1、不同畜禽补体C3d基因的克隆及序列分析:从不同畜禽的肝细胞提取总RNA,通过RT-PCR扩增出C3d基因的cDNA,琼脂糖凝胶电泳鉴定后直接克隆到pMD18-T载体,构建pMD18-T-C3d重组质粒,转化大肠杆菌,酶切鉴定后进行序列测定,然后进行C3d序列比较、CR2结合区同源性分析比较。结果表明,畜禽补体C3d基因同源性相差较大,进化树反映出C3d基因具有种的多样性,亲缘关系越近,进化关系也越近。对CR2结合区分析发现,禽类的该区为29个氨基酸,而哺乳动物的为28个氨基酸,两类动物该区氨基酸的同源性仅为40%,而哺乳动物之间的同源性高达80%,证明补体C3d及CR2结合区具有种属的特异性。另外,用生物学软件对补体C3d基因编码的氨基酸序列以及蛋白结构进行了分析、用ESyPred 3D同源建模等软件对补体C3d的叁级结构进行了叁维结构预测和分子特征分析,分析结果显示,C3d 3D模型是一种由核心和外层构成的桶状分子结构。本研究为进一步研究动物C3d分子佐剂基因疫苗奠定了基础。2、鸡补体C3d原核表达载体的构建及其重组蛋白的纯化:补体C3d是补体系统(Complement system,CS)中补体C3的最终裂解产物。为研究其免疫增强的生物学功能,利用RT-PCR技术从罗曼蛋鸡肝脏总RNA中扩增出C3d cDNA,经克隆测序证实所得基因为C3d。然后,将其连接至表达载体pET-32a(+),转化E. coli BL21(DE3),通过IPTG诱导表达。SDS-PAGE分析结果表明,目的基因在大肠杆菌中以包涵体的形式进行了高效表达,Western-blotting证实目的蛋白为C3d。包涵体蛋白通过尿素溶解液洗涤并溶解后,经硫酸铵盐析、透析、浓缩和Sephadex G-200凝胶过滤层析,重组C3d蛋白得到纯化。最后,SDS-PAGE及Western-blotting检测验证该C3d表达蛋白得到很好的纯化,并且纯化后的表达蛋白仍具有良好的反应原性。本研究为进一步研究、利用鸡补体C3d蛋白提供了保证。3、鸡补体C3d重组蛋白对大肠杆菌疫苗的免疫增强作用研究:从SDS-PAGE凝胶中分离纯化原核表达的重组C3d蛋白,用戊二醛将其与大肠杆菌抗原连接,免疫注射SPF鸡;对照组鸡免疫注射完全弗氏佐剂大肠杆菌疫苗。分别在免疫后的第2、3、4、5、6、7、8、9周采血,用ELISA方法测定血清中的抗体含量,同时测定血清中总补体活性。结果表明,免疫后3周,弗氏佐剂大肠杆菌疫苗诱导鸡体产生的抗体效价高于C3d佐剂疫苗组,但至第4周,弗氏佐剂疫苗组的抗体水平达到高峰(OD值=0.273±0.044),然后迅速下降,到第9周降至0.200±0.055,而C3d疫苗组鸡免疫后的抗体水平持续上升,从免疫后第2周的0.099±0.030上升到第9周的0.275±0.020。证明原核表达的C3d能够促进免疫记忆细胞的产生,并能够使细菌抗原给予免疫细胞持续稳定的刺激,从而使鸡体维持高水平抗体的时间延长。研究结果为研制有效的家禽细菌性疫苗提供了理论依据。4、鸡补体C3d重组蛋白对新城疫病毒灭活油乳苗的免疫增强作用研究:为进一步探讨重组鸡补体C3d蛋白的佐剂作用,本试验观察了原核表达纯化后的重组鸡补体C3d蛋白和新城疫灭活油乳苗共同免疫鸡群之后,重组鸡补体C3d蛋白对新城疫灭活油乳苗的免疫协同作用。将7日龄雏鸡分为叁组进行免疫注射,作用结果显示联合免疫灭活油乳苗和重组鸡补体C3d蛋白的鸡群,在免疫后1～7周(即14～57日龄)整个观察期内,不但其胸腺T淋巴细胞对ConA、法氏囊B淋巴细胞对PMA的反应均明显强于单纯油乳苗免疫组(其中除在接种后第1周时两组鸡的B淋巴细胞增殖OD值差异不显着外,其余各检测时间两组间均表现为差异显着(P<0.05)或极显着(P<0.01),特别是T淋巴细胞增殖情况在接种第2周后均表现为差异极显着(P<0.01));而且联合免疫组的HI抗体效价水平也持续性高于单纯油乳苗免疫鸡群,并在免疫接种后5～7周时差异显着(P<0.05)。在免疫接种后第7周时进行的攻毒保护试验中,联合免疫组的保护率为100%,而单纯油乳苗免疫组鸡在观察期内则有3只发病,保护率为83.3%,且有1只死亡。总之,本试验所用重组鸡补体C3d蛋白和灭活油乳苗联合免疫可显着提高机体的体液免疫和细胞免疫水平,产生了较好的免疫协同作用,使机体对新城疫病毒的综合免疫保护能力得到进一步的增强,从而初步验证了重组C3d蛋白的免疫佐剂作用。5、新城疫病毒C3d-P29分子佐剂F基因疫苗的构建及其表达:C3d是补体C3的裂解产物之一,与抗原相连时可以明显提高抗原分子的免疫原性。CR2/CD21在其功能发挥过程中起到重要作用,P29为编码C3d与CR2结合区域的基因。在克隆出C3d cDNA基础上,设计引物克隆P29至pUC19载体,利用同裂酶BamH I和Bgl II构建pUC-P29.n。酶切获得P29.n,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)。最后RT-PCR扩增新城疫F基因,定向克隆至真核表达载体pcDNA-P29.n中P29.n的上游,构建完成新城疫F基因疫苗,用IFA法检测pcDNA-F-C3d-P29.n可在CEF中大量表达。本研究为进一步研究补体C3d的分子佐剂效应以及开发和利用鸡C3d奠定了基础。6、鸡C3d-P29重组质粒特异性增强鸡补体总活性与C3含量的初步研究:为验证鸡补体C3d-P29分子佐剂作用,本试验比较研究了免疫注射含有鸡C3d-P29基因重组表达质粒之后的鸡血清中补体水平及其补体C3含量与含有异种动物(如小鼠)CR2结合区基因序列重组质粒或空白对照之间的差异,以探讨鸡补体C3d基因重组质粒能否特异性的增强鸡补体总活性与补体C3含量。根据构建的真核表达重组质粒不同分为五组对鸡进行免疫注射,具体为空白对照(PBS)组;pcDNA3.1空质粒组;含有新城疫F基因的pcDNA3.1-F组;含有新城疫F基因以及鸡CR2结合区(P29)基因序列C3d-P29六聚体的pcDNA3.1-F-ChC3d-P29.6组;含有新城疫F基因以及小鼠CR2结合区(P28)基因序列C3d-P28六聚体的pcDNA3.1-F-MC3d-P28.6组。分别采取各组经二免后成年鸡的新鲜血清,测定其补体总活性;利用生化合成的C3α链N端21肽,经免疫家兔后制备的抗鸡C3抗体,具有能够与鸡血清中的补体C3发生特异性反应的特性,用来测定注射过不同真核表达质粒后鸡血清中C3含量差异。结果表明,空白对照(PBS)组;pcDNA3.1空质粒组; pcDNA3.1-F组; pcDNA3.1-F-ChC3d-P29.6组和pcDNA3.1-F-MC3d-P28.6组五个试验组鸡血清中的补体C3含量分别为0.34±0.005mg/mL、1.47±0.008mg/mL、1.70±0.005mg/mL、1.78±0.007mg/mL和4.18±0.008mg/mL。免疫鸡补体C3d(pcDNA3.1-F-ChC3d-P29.6组)的鸡血清中补体总活性和C3含量都远远高于其他组,差异极显着(P<0.01);并且鸡C3d重组质粒能特异性增强鸡补体总活性与C3含量,差异极显着(P<0.01)。7、新城疫补体C3d分子佐剂疫苗免疫效果的研究:在克隆了鸡C3d cDNA和新城疫F48E9株F基因cDNA的基础上,构建编码CR2结合区P29基因的多聚体,以此多聚体为分子佐剂构建了新城疫F基因疫苗pcDNA3.1-F-C3d-P29.2、pcDNA3.1-F-C3d-P29.4、pcDNA3.1-F-C3d-P29.6及pcDNA3.1-F,通过了实验室安全检验和效力检验。将含有不同个数P29基因的多聚体作为分子佐剂的新城疫F基因疫苗、新城疫油乳剂灭活苗以及质粒载体作为对照分别免疫SPF鸡,利用MTT法、血凝抑制法(HI)和ELISA等分别检测不同疫苗免疫后的细胞免疫和体液免疫水平,并在免疫后第五周进行了攻毒试验。最后,还进行了重组鸡补体C3d质粒(pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6)及原核表达重组C3d蛋白(rChC3d)对外周血T淋巴细胞增殖效果对比试验。结果表明,以补体C3d-P29为分子佐剂的新城疫F基因重组疫苗安全性好;虽然免疫后抗体水平和保护率不如新城疫油乳剂灭活苗,但是能够抵抗致死量病毒的攻击,具有较好的保护作用,其中以pcDNA3.1-F-C3d-P29.6效果更好;MTT法测定T淋巴细胞转化结果表明,补体C3d-P29.6佐剂能显着促进淋巴细胞转化,多数时间点与油佐剂的效果相当,部分时间点显着强于油佐剂。MTT法检测pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6与rChC3d对外周血T淋巴细胞增殖效果显示pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6免疫组峰值较rChC3d协同免疫组出现时间稍晚,但随后质粒免疫组可维持在更高的水平值。这表明pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6在体内持续的时间更长。本研究中C3d分子佐剂疫苗免疫效果的验证,为进一步开发和利用鸡C3d奠定了基础。
宋新宇[8]2007年在《L.casei Zhang DNA免疫协同作用的研究》文中研究指明本研究给小鼠腹腔注射L.casei zhang DNA,观察L.casei zhang DNA对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬率、吞噬指数、巨噬细胞C3b补体的影响和小鼠的毒性试验。把L.casei zhang DNA作为佐剂和弗氏完全佐剂分别添加到鸡新城疫油苗和禽流感油苗制成L.casei zhang DNA佐剂鸡新城疫油苗和禽流感油苗及弗氏完全佐剂鸡新城疫油苗和禽流感油苗分别于免疫小鸡。二免后每周采样连续采8周,用血凝抑制试验、间接ELISA试验检测鸡血清中HI效价、IgG含量;用MTT法检测鸡脾脏T淋巴细胞转化率;用RT-PCR检测不同佐剂禽流感油苗二免后第七天鸡脾淋巴细胞中IL-2和IFN-γmRNA表达量。小鼠腹腔巨噬细胞吞噬试验结果显示,试验组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬率、吞噬指数、巨噬细胞C3b补体花环形成率显着高于对照组(p<0.05);毒性试验结果显示,连续观察一周注射L.casei zhang DNA组小鼠无耸毛、消瘦或食欲不振等现象,且全部存活。L.casei zhang DNA对鸡新城疫油苗和禽流感油苗的免疫协同作用研究结果显示,试验组鸡血清中HI抗体效价、T淋巴细胞转化率、血清中IgG含量均显着或极显着高于对照组(p<0.05、p<0.01);加佐剂组显着或极显着高于油苗单独免疫组(p<0.05、p<0.01);加佐剂组之间(除淋巴细胞转化率外)无显着性差异。鸡脾淋巴细胞中IL-2和IFN-γmRNA表达量检测结果显示,无论是免疫组还是对照组鸡脾脏淋巴细胞,均能检测到不同程度IL-2和IFN-γ的表达。所有试验组IL-2和IFN-γ的表达量显著或极显著高于对照组(p<0.05、p<0.01);所有添加佐剂组IL-2和IFN-γ的表达量显著或极显著高于禽流感油苗免疫组(p<0.05、p<0.01);添加佐剂各组之间无显着性差异(p<0.05)。
袁明涛[9]2007年在《免疫分子CD154对猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸疫苗的免疫增强作用研究》文中研究说明猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive andrespiratory syndrome virus，PRRSV)引起的一种严重危害养猪业的病毒性传染病，主要导致妊娠母猪流产、死胎、木乃伊胎、弱仔等繁殖障碍和仔猪的大量死亡。该病自从1987年在美国首次报导以来，现已遍及世界各主要养猪国家，并已成为危害养猪业最严重的传染病之一。由ORF5基因编码的GP5蛋白是PRRSV最主要的结构蛋白和免疫原性蛋白之一，并能诱发最强的中和抗体，是研制PRRS新型疫苗的良好靶蛋白，但以天然ORF5基因构建的多种新型疫苗均难以诱发较早和较高水平的抗体，特别是保护性的中和抗体。CD154分子是一种Ⅱ型跨膜糖蛋白，为肿瘤坏死因数超家族(TNRF)成员，其表达谱广泛，主要表达于CD4~+T细胞表面，也表达在其它T细胞，如CD8~+或CD45RO~+／CD45RA~+T细胞、Tc1／Tc2细胞或B细胞表面。CD154与CD40分子之间相互作用与T淋巴细胞和B淋巴细胞活化、增殖、抗体产生、生发中心形成有关，近年有研究表明，CD154与疫苗联合运用能显着增强疫苗免疫效果。本研究以PRRSV ORF5基因为靶基因，构建了与CD154基因融合表达和共表达的ORF5基因核酸疫苗，探讨了CD154基因对PRRSV ORF5核酸疫苗的免疫增强作用。具体研究内容如下：1、猪CD154基因的克隆及其在大肠杆菌及真核细胞中的表达利用RT-PCR方法从湖北白猪外周血单核细胞中分离克隆猪CD154基因的完整编码区，进一步PCR扩增获得缺失信号肽(1-22aa)和跨膜区(23-46aa)的基因片段tCD154，将其克隆至原核表达载体pQE-80L的6×His下游，获得原核表达质粒pQE-tCD154，转化大肠杆菌DH5α诱导表达出分子量约29kD的融合表达蛋白6×His-tCD154，Western-blot证实表达的融合蛋白能与抗6×His的单抗发生特异性反应。同时，将完整CD154基因克隆至真核表达载体pEGFP-C1的EGFP基因下游，获得融合表达质粒pEGFP-C1-CD154，转染Hela细胞，荧光显微镜观察发现EGFP-CD154融合蛋白的表达主要定位于细胞膜，表明猪CD154是一种膜蛋白。2、猪CD154基因与PRRSV ORF5基因共表达和融合表达DNA疫苗的构建及其免疫效果以PRRSV ORF5基因为目标基因，以pCI-neo为载体，构建两种不同的DNA疫苗：第一种为猪CD154基因与PRRSV ORF5基因共表达的DNA疫苗pCI-ORF5-CD154，第二种为猪CD154基因与PRRSV ORF5基因融合表达的DNA疫苗pCI-ORF5n60-tCD154，比较两种疫苗与单独表达ORF5基因的PRRSV DNA疫苗pCI-ORF5的免疫效果差别。间接免疫荧光证实两种质粒在体外培养的HeLa细胞中均可正确表达GP5蛋白，与抗PRRSV的高免猪血清具有特异性反应。小鼠免疫试验结果表明，与猪CD154共表达或融合表达的DNA疫苗pCI-ORF5-CD154、pCI-ORF5n60-tCD154诱导的抗GP5蛋白ELISA抗体和淋巴细胞增殖反应均明显优于单独表达ORF5的DNA疫苗pCI-ORF5，而且以与CD154共表达的DNA疫苗pCI-ORF5-CD154效果最好，说明猪CD154基因对PRRSV ORF5 DNA疫苗具有免疫增强作用，CD154是一种极具应用前景的免疫增强分子。
宋新宇, 张七斤, 张和平, 孟和毕力格[10]2007年在《乳酸杆菌DNA对鸡新城疫油苗和禽流感油苗免疫增强作用的研究》文中提出提取2株乳酸杆菌L.casei zhang和MG2-1的DNA作佐剂,按不同剂量添加到新城疫油乳剂灭活疫苗及禽流感(H5)亚型油乳剂灭活疫苗中。用上述2种加佐剂的油乳剂灭活疫苗对鸡进行免疫,每组20只,分别于15日龄和28日龄进行新城疫(ND)组和禽流感(AV)组首免,再分别于首免后2周加强免疫,在二免的第7天与第14天检测血清HI抗体水平。结果表明,与对照组相比,试验各组抗体水平达到显着或极显着水平,可提高抗体水平20.16～22.67。说明,2株乳酸杆菌DNA对新城疫油乳剂灭活疫苗和禽流感(H5)亚型油乳剂灭活疫苗具有免疫增强作用。
参考文献：
[1]. 鸡CpG核酸免疫活性分子的筛选及其对ALV亚单位疫苗的免疫增强作用[D]. 任庆亚. 山东农业大学. 2014
[2]. 新型免疫佐剂细菌核酸动物免疫增强试验[D]. 唐泰山. 南京农业大学. 2001
[3]. 乳酸杆菌DNA对鸡新城疫油苗和禽流感油苗免疫增强作用的研究[J]. 宋新宇, 张七斤, 张和平, 孟和毕力格. 中国动物检疫. 2006
[4]. 中药多糖的免疫增强活性及其对抗体生成影响的研究[D]. 赵现敏. 河南农业大学. 2007
[5]. C3d分子佐剂核酸疫苗的构建与免疫效果研究[D]. 张德庆. 山东农业大学. 2011
[6]. 转移因子增强犬细胞免疫功能的作用机理研究[D]. 孔庆波. 西北农林科技大学. 2005
[7]. 畜禽补体C3d基因克隆及序列分析和重组鸡C3d免疫佐剂效果研究[D]. 刘栋. 山东农业大学. 2010
[8]. L.casei Zhang DNA免疫协同作用的研究[D]. 宋新宇. 内蒙古农业大学. 2007
[9]. 免疫分子CD154对猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸疫苗的免疫增强作用研究[D]. 袁明涛. 华中农业大学. 2007
[10]. 乳酸杆菌DNA对鸡新城疫油苗和禽流感油苗免疫增强作用的研究[J]. 宋新宇, 张七斤, 张和平, 孟和毕力格. 畜牧与饲料科学. 2007
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