何璐璐[1]2004年在《白血病细胞药物敏感实验和HSP70在耐药机制中作用的研究》文中指出多药耐药性的形成是白血病患儿化疗失败、复发的主要原因,在白血病细胞中大多存在HSP70与MDR1基因的异常表达,而且在多种应激刺激下二者的表达均在转录水平受HSF1的调节。目前国内外对HSP70与MDR1基因之间的相互关系还不十分清楚。因此本实验首先研究白血病患儿体外药物敏感性,观察初治患儿体外对多种化疗药物的原发耐药情况,继而研究化疗药物处理后白血病细胞的获得性耐药现象,探讨在此过程中白血病细胞HSP70与MDR1基因的表达情况,研究HSP70在白血病化疗耐药性中的作用,以及中药槲皮素逆转白血病细胞耐药性的机制,为小儿白血病的实验研究和临床治疗提供理论依据。 本研究分四部分。第一部分采用MTT法测定22例白血病患儿外周血或骨髓白血病细胞对阿糖胞苷(Ara-C)、的塞米松(DEX)、阿霉素(ADM)、柔红霉素(DNR)、长春新碱(VCR)、依托伯甙(VP-16)、左旋门冬酰胺酶(L-ASP)、环磷酰胺(CTX)等化疗药物的敏感性。结果:22例患者中S/S 15例,R/R 2例,S/R 3例,R/S 2例,体外药敏与体内疗效总符合率77.3%,阳性符合率83.3%,阴性符合率33.3%,敏感度78.9%,特异度40%。 第二部分采用恒温水浴法分别给予K562细胞非致死性的高温
李皓[2]2012年在《雷公藤甲素通过miR-21调节白血病细胞药物敏感性的分子机制》文中进行了进一步梳理耐药是临床治愈白血病的一个主要障碍。肿瘤耐药是一种多因子共同作用导致的现象,尽管发现药物灭活,药物外排,存活通路激活,凋亡机制缺陷等与耐药有关,但是耐药的决定性因素尚不清楚。近来,大量的研究发现microRNA在肿瘤发生和发展中发挥重要作用。其中,部分microRNA通过影响特定的信号通路影响肿瘤对化疗药物的敏感性。因此,microRNA在耐药形成中的作用日益受到学者们的关注。MiR-21是第一个在人类基因组中发现的microRNA,并且是唯一在所有恶性肿瘤均高表达的microRNA。MiR-21被发现与肿瘤的诊断标志和预后标志显着相关,因此其可能成为恶性肿瘤诊断和预后判断的生物学标记。此外,异常表达的miR-21可以预测肿瘤对传统化疗药物,如吉西他滨,多西他赛,替莫唑胺,5-氟尿嘧啶等的反应。最近,几项研究探讨了miR-21在髓细胞白血病和淋巴细胞白血病耐药中的作用。研究发现,miR-21反义寡核苷酸提高叁氧化二砷对急性髓细胞白血病细胞的毒性。抑制miR-21,增强叁氧化二砷和阿糖胞苷诱导的慢性髓细胞白血病细胞的凋亡。MiR-21的这些作用,部分是通过影响PDCD4表达行成的。雷公藤甲素是1972年首次从雷公藤根部提取的二萜类化合物,现在已经开发了人工合成的工艺。文献报道,雷公藤甲素具有抗炎,免疫抑制,抗生育和抗肿瘤作用。大量研究发现,雷公藤甲素在体外能够抑制多种肿瘤的增殖,诱导肿瘤的凋亡；在体内,雷公藤甲素可以抑制肿瘤生长和转移。研究证实,雷公藤甲素可以抑制细胞周期和细胞存活相关蛋白,包括cyclins D1, B1, and A1, Cdc-25; Bcl-X和c-Jun。雷公藤甲素还降低抗凋亡蛋白如XIAP, Bcl-2和Mcl-1等的表达。在白血病和卵巢癌细胞中,雷公藤甲素诱导caspase依赖的凋亡；在胰腺癌中,雷公藤甲素诱导caspase非依赖的自噬性死亡。研究目的：本研究的目的是观察雷公藤甲素是否通过miR-21影响白血病细胞对化疗药物阿霉素的敏感性,并且探讨其可能的分子机制。研究方法：(1)雷公藤甲素的毒性和耐药逆转作用采用MTT实验。(2)miR-21的表达采用SYBR green PCR方法。(3) NF-κB的活性采用EMSA方法检测。NF-κB与miR-21基因启动子区域结合采用ChIP方法。(4)miR-21模拟物和抑制物由化学合成,并且转染入K562细胞或K562/A02细胞。(5) P65, T-AKT, P-AKT, PTEN, BCL-2蛋白水平采用western blot检测。(6)细胞凋亡率采用流式细胞仪检测Annexin V/PI染色细胞。(7)流式细胞仪检测P糖蛋白表达。P糖蛋白功能检测采用罗丹明-123蓄积实验。(8)本研究假设,在K562细胞中,PTEN是miR-21的一个直接靶基因。为验证此假说,K562细胞共转染PTEN-3'非编码序列荧光素酶报告基因和miR-21.(9)为了探讨PTEN与阿霉素毒性的关系,PTEN siRNA被转染入K562细胞,接着采用一系列浓度的阿霉素作用。(10) P65, PTEN mRNA水平采用SYBR green PCR.方法检测。研究结果：(1)因为耐药逆转剂需要采用对受试细胞无抑制或无毒性的浓度,雷公藤毒性试验结果提示,5 nmol/L雷公藤甲素被用于后续耐药逆转试验。(2)雷公藤甲素降低miR-21在K562/A02细胞的表达水平。P65 mRNA水平和蛋白水平,以及P65转录活性,在雷公藤甲素作用后明显下降。(3) ChIP试验和EMSA试验均证明NF-κB能够与miR-21启动子区域结合。ChIP试验进一步证明,K562/A02细胞经雷公藤甲素作用后,NF-κB与miR-21启动子结合明显下降。(4) 5 nmol/L雷公藤甲素提高K562/A02细胞对阿霉素的敏感性。3μg/mL阿霉素诱导的K562/A02细胞凋亡率为4.3%,当与5 nmol/L雷公藤甲素联合应用时,凋亡率上升到18.5%。(5)雷公藤甲素明显抑制P糖蛋白在K562/A02细胞的表达。罗丹明-123蓄积试验表明,雷公藤甲素能够抑制P糖蛋白功能。(6)K562细胞转染miR-21模拟物后,miR-21水平明显上升；K562/A02细胞转染miR-21抑制物后,miR-21水平明显下降。K562细胞转染miR-21模拟物后,存活率明显升高；K562/A02细胞转染miR-21抑制物后,存活率明显下降。(7)K562细胞转染miR-21模拟物后,PTEN蛋白水平明显下降；K562/A02细胞转染miR-21抑制物后,PTEN蛋白水平明显上升。MiR-21降低K562细胞PTEN-3'非编码序列荧光素酶报告基因活性。(8)PTEN siRNA显着降低K562细胞PTEN蛋白水平。K562细胞转染PTEN siRNA后,细胞存活率升高,而且P糖蛋白的表达升高。(9)雷公藤甲素能够有效抑制BCL-2在K562/A02细胞的表达。K562细胞转染miR-21模拟物后,BCL-2表达水平明显上升；K562/A02细胞转染miR-21抑制物后,BCL-2表达水平明显下降。结论：(1)雷公藤甲素提高K562/A02细胞对阿霉素的敏感性。(2)雷公藤甲素抑制miR-21在K562/A02细胞的表达,从而升高PTEN蛋白水平。(3)雷公藤甲素通过PTEN/AKT通路抑制P糖蛋白表达和功能。(4)雷公藤甲素通过调节miR-21水平,抑制BCL-2在K562/A02细胞的表达,提高阿霉素诱导的细胞凋亡。
王弢[3]2004年在《逆转P糖蛋白介导的肿瘤多药耐药新逆转剂—五味子乙素的筛选、体外体内药效和分子机制研究》文中研究说明根据中医中药关于肿瘤生成发展的相关理论和实践，我们精选了50多种具有温中益气、活血化淤等特性的中药活性成分单体，建立初筛样品库。用本所建立的肿瘤多药耐药的体外模型k562／ADR等耐药细胞系进行体外筛查，发现五味子属植物中的一个活性单体五味子乙素(Schisandrin B，SchB)具有有效逆转肿瘤多药耐药(Multidrug resistance，MDR)的能力。SchB是从五味子果仁中提取的有效单体，属联苯环辛烯类化合物。根据初筛结果，本研究从以下五个方面对SchB的作用效果和机制分别研究。 1．体外逆转效果评价 本研究选用叁株耐药细胞K562／ADR，K562／VCR和KBV200，经验证均高表达P-gp。在初筛证明6ug／ml SchB可逆转K562／ADR对阿霉素(adriamycin，ADR)的基础上，用不同浓度的SchB进行ADR的体外逆转实验，表明在10ug／ml SchB时可与6ug／ml维拉帕米(verapamil，VER)相当，而相对应的毒性比VER小。为确认SchB是否具有广谱逆转特性，选择不同结构和机制的抗癌药物如蒽环类、生物碱类、表鬼臼毒素类、抗微管类、抑制蛋白合成类等进行体外细胞学的逆转实验，发现SchB在6ugm／l和10ug／ml时均能显着增强K562／ADR，K562／VCR和KBV200对药物的敏感性，10ug／mlSchB与阳性对照6ug／ml的VER效果相当。流式细胞仪检测证实SchB能明显增加阿霉素和柔红霉素在K562／ADR细胞中积聚，相较对照组有3-5倍以上的增加。HPLC检测阿霉素在K562／ADR细胞的外排，发现该化合物能有效降低阿霉素的外排，效果与浙江大学硕士学位论文阳性对照VER相当。Rh一123是一种具有荧光的P一gP底物，由于对细胞的毒性较荧光抗癌药物小，可真实的替代药物反映其在细胞内的积聚和外排。所以我们进一步采用Rh一123作为替代底物，通过流式细胞仪评估SChB对KBVZOO细胞外排与积聚Rh123的影响，实验发现SChB在10ug/ml时其积聚Rh123的能力显着增强，而外排能力被显着抑制，与通过MTT获得逆转工CSO的结果基本一致。 2.对P一gP高表达的耐药细胞中DNR异常分布影响 化疗药物在敏感细胞中一般呈弥散性分布，而在耐药细胞中表现为特定亚细胞器的异常分布，此现象是肿瘤耐药的一个常见因素和特征。本研究证明sChB和vER具有类似的效果，可有效改变DNR在P一gP介导的耐药细胞内的异常分布，恢复药物弥散性分布，推测这种异常分布及其恢复可能与药泵蛋白P一gp的功能相关。同时，用线粒体特异荧光探针Rh一123作为对照，发现 Rh一123在耐药细胞中的分布(主要为线粒体)与DNR的分布有明显区别，初步判断DNR不在线粒体中分布，SehB和VER均可恢复Rh一123在耐药细胞中的亚细胞分布异常，其中10ug/ml VER的恢复效果比IOug/ml SchB略好。但DNR等化疗药物在P一gp介导的耐药细胞中具体细胞器的分布还需要进一步的实验验证。 3.SchB和ADR联合用药的增敏效果 逆转剂的主要作用方式是增强化疗药物诱导肿瘤细胞凋亡的能力，因此该部分从凋亡增敏的方向研究SChB和ADR联合用药对KBVZOO的杀伤效果。主要采用了MTT，流式细胞术、PS检测、琼脂糖凝胶电泳技术检测阿霉素与五味子乙素合用时的诱导细胞凋亡的程度，实验结果显示单用lug/ml和sug/m1阿霉素只引起较少的细胞凋亡，而阿霉素与五味子乙素合用可极显着增加细胞凋亡的百分率(P<0.001)。所以，五味子乙素可有效增敏阿霉素诱导的人口腔鳞癌KBVZOO多药耐药细胞的凋亡。实验中还发现，无论是SChB还是VER都不能完全逆转KBV200的抗性至同浓度ADR诱导KB时的凋亡效果，提示在KBVZOO的耐药机制中除pgP高表达外，还可能有其它的耐药机制存在。浙江大学硕上学位论文 4.分子机制的初步研究 用流式细胞仪检测P一gP荧光抗体标记的叁种耐药细胞系，发现P一gp蛋白均高表达。COCI/DDP耐药细胞系为用顺铂(DDP)诱导的人卵巢癌耐药细胞，研究证实该细胞GST高表达而P一gP表达阴性。用DDP、5一FU、VCR等化疗药物作SChB的逆转MTT实验，发现无明显逆转效果，说明SchB可能不具有下调GST表达或抑制其功能的作用。通过RT一PCR证实SchB可一定程度下调mdrl基因的转录;流式细胞仪进行抗体检测发现P一gP蛋白表达亦有显着下调。我们分析，本论文第一部分研究发现SChB能增加药物积聚和阻滞外排，但通过下调基因或蛋白表达需要较长时间，所以不能说明其积聚药物减弱外排的作用，推测该化合物可能为P一gP的竞争性底物或别构调节物，经3H一azidopine的亲和标记实验证实SChB可竞争性抑制P一gP。至于是否同时有蛋白酶类、通路类的作用，有待进一步的研究证明。 5.动物体内药效研究 用体外原代培养的人淋巴细胞(单核细胞)、人成纤维细胞和人骨髓间充质细胞等验证不同浓度SChB的毒性反应，发现SChB在20ug/ml以下无任何可观测到的正常细胞毒害作用，4Oug/m1时的细胞毒作用仍然十分轻微，而vER在10一15ug/耐时就有明显的细胞毒性反应。用Balb/C裸鼠作动物毒性检验发现，20mg/鼠连续灌胃4天，随后观测10天，发现无可观察到的伤害。为验证SchB体内药效，我们用人耐药细胞KBV200接种Balb/c裸鼠，
许文前[4]2006年在《急性白血病bcl-2蛋白、p53蛋白、p170蛋白的表达水平及临床意义》文中研究指明目的 研究bcl-2蛋白、p53蛋白、p170蛋白在急性白血病(AL)的表达水平，分析其表达水平与急性白血病的某些临床特征、疗效、预后的天系，探讨叁种蛋白的表达对急性白血病的临床意义。 方法 以95例急性白血病病人为实验组，其中男性54例，女性41例，年龄16～74岁。所有患者均接受标准化疗方案，按治疗效果分为初治组55例、缓解组21例和复发难治组19例。以28例健康人或非恶性血液病患者为对照组。利用淋巴细胞分离液从骨髓中分离出单个核细胞，流式细胞仪检测其bcl-2蛋白、p53蛋白和p170蛋白的表达水平。采用统计软件包SPSS11.5进行统计分析。 结果 1．bcl-2蛋白、p53蛋白、p170蛋白在95例急性白血病患者的阳性率分别为49.5％、42.1％、69.5％。bcl-2蛋白在急性白血病的阳性率由高到低依次为：复发难治组＞初治组＞缓解组；p53蛋白在复发难治组的阳性率高于初治组及缓解组，后两者之间的阳性率差别无显着性；p170蛋白在初治组的阳性率低于复发难治组与缓解组，后两者之间的阳性率差别无显着性；初治组、复发难治组、缓解组的bcl-2蛋白、p53蛋白、p170蛋白的阳性率均高于对照组。 2．bcl-2蛋白、p53蛋白、p170蛋白在ANLL的阳性率分别为46.4％、51.8％、75.0％，在ALL的阳性率分别为53.8％、28.2％、61.5％，bcl-2蛋白、p170蛋白在ANLL与ALL的表达水平差别均无显着性意义，p53蛋白在ANLL的表达水平高于ALL；急性白血病患者bcl-2蛋白、p53蛋白、p170蛋白的表达水平与其性别、年龄、外周血白细胞总数、血红蛋白水平、血小板计数、骨髓原始细胞比例无相关性。 3．bcl-2阳性组患者和p170阳性组患者的化疗完全缓解率分别低于bcl-2阴性组患者和p170阴性组患者，且复发率较高、缓解期、生存期较短；p53阳性组患者与p53阴性组患者在完全缓解率、复发率、缓解期、生存期方面无显着差别。 4．在初治组55例患者中，其p170蛋白在化疗后的阳性率高于化疗前；其bcl-2蛋白、p53蛋白的阳性率在化疗前后差别无显着性意义。
高志学[5]2007年在《人骨肉瘤细胞多药耐药机制及其逆转剂的研究》文中提出骨肉瘤作为一种常见的骨源性恶性肿瘤,其化疗后的多药耐药现象严重影响患者的治疗效果和预后,其耐药机制和逆转剂的研究一直是研究的热点。在体外建立多药耐药的细胞模型已逐渐成为研究骨肉瘤多药耐药性的有利工具。氨甲蝶呤作为骨肉瘤化疗的基础药物,其在临床初始化疗缓解后常会产生耐药性。目前临床上己证实与肿瘤多药耐药有关的耐药基因主要有MDRl、MRP、LRP、GST-π、TOPOⅡa等。因此,检测U-2 OS/MTXr中这5个耐药基因及其表达产物表达水平的变化,基本能反映出骨肉瘤组织产生耐药时耐药基因表达水平的变化情况。放疗作为骨肉瘤化疗的辅助手段,也可以收到不错的治疗效果,但骨肉瘤放疗与其多药耐药的关系尚无人研究。骨肉瘤多药耐药逆转的研究也不是很多,这和以往的逆转剂效果不理想有关。本实验采用氨甲蝶呤大剂量冲击间歇诱导的方法建立了骨肉瘤多药耐药细胞模型,通过对耐药细胞的基本特征、交叉耐药、细胞生长曲线、细胞周期及凋亡以及5个耐药基因的表达变化情况、放疗与骨肉瘤多药耐药的关系、新的逆转剂的尝试等进行了研究。为进一步研究人骨肉瘤耐药机制和耐药逆转剂提供一定的帮助。
王琳[6]2008年在《热疗对紫杉醇抑制肺肿瘤细胞的促进作用及其机制》文中指出肺癌的发病率和死亡率正在迅速上升,在很多发达国家,肺癌的发病率占男性常见恶性肿瘤的第一位,女性常见恶性肿瘤的第二、叁位;肺癌的组织学类型也在发生显着变化,腺癌的发病率不断上升。虽然手术治疗、化学治疗、放射治疗、免疫治疗及综合治疗等都取得了长足发展,但在美国肺癌患者5年的生存率仅为15%,欧洲不过是10%,发展中国家则不到8.9%。化疗药物紫杉醇(TAX)抗肿瘤效果显着,取得了较好的临床疗效。肿瘤热疗在肿瘤综合治疗中显示了良好的效果,加热不会增加药物的细胞毒性效应,所以,热疗增加肿瘤细胞对化疗的敏感性受到越来越多的重视,因此,本研究旨在验证热疗促进TAX对肺肿瘤细胞抑制作用的发生及其机制。研究方法1.热疗与TAX联合应用对肺部细胞生物学特性的影响采用人肺腺癌A549细胞、人小细胞肺癌NCI-H446细胞和人呼吸道上皮BEAS-2B细胞,每种细胞分别采用3种方式处理,即对照组、TAX组和43℃+TAX组(见表1);倒置显微镜观察细胞形态,照相记录,噻唑蓝比色法检测细胞增殖率;提取细胞总蛋白,按LDH Kit要求检测LDH活力,划痕实验检测细胞损伤修复能力,荧光Hoechst33342/PI双染法以及提取细胞DNA Ladder检测细胞凋亡。2.细胞内重要信号传导通路在热疗与TAX诱导肺肿瘤细胞增殖过程中的作用及其相互关系采用人肺腺癌A549细胞和人小细胞肺癌NCI-H446细胞,每种细胞分别采用6种方式处理,即对照组、TAX组、43℃+TAX组(见表1)和SP600125组(43℃+TAX组加入JNK信号转导通路抑制剂SP600125)、wortmannin组(43℃+TAX组加入Akt通路抑制剂wortmannin)、NAC组(43℃+TAX组加入ROS抑制剂NAC);分别检测各组ROS、p-JNK、p-Akt以及Caspase-3等的表达变化,并用流式细胞术检测细胞凋亡率和细胞周期的变化,同时做体内实验的验证。3.HSP70在热疗与TAX抑制肺肿瘤细胞作用中的地位采用人肺腺癌A549细胞、人小细胞肺癌NCI-H446细胞和人呼吸道上皮BEAS-2B细胞。每种细胞分别采用4种方式处理,即对照组、TAX组、43℃+TAX组和43℃组(见表1);检测各组HSP70的表达变化,同时做体内实验的验证。4.GTSP1在热疗与TAX抑制肺肿瘤细胞过程中的作用构建重组质粒pcDNA3.0-GSTP1,转染A549细胞,热疗联合TAX处理转染和未转染细胞,倒置显微镜观察细胞形态,照相记录,噻唑蓝比色法检测细胞增殖率,流式细胞术检测各组细胞周期的变化。5.统计学分析采用SPSS 12.0进行统计分析,统计学处理采用t检验、单因素方差分析,多重比较采用LSD法,构成比的比较采用卡方检验,以α=0.05为检验水准。结果1.热疗与TAX联合应用对肺部细胞生物学特性的影响1.1热疗可以减少TAX对正常细胞的损伤作用(P＜0.05),明显增强TAX对肺肿瘤细胞的抑制作用(P＜0.05);1.2热疗造成肺肿瘤细胞膜损伤,使得大量LDH外漏,所以检测细胞内LDH发现,43℃+TAX组的LDH较对照组和TAX组明显减少(P＜0.05);1.3划痕后24h,对照组细胞开始向划痕区生长,其余各组划痕区中央均未见细胞生长,且有部分细胞死亡,TAX组细胞存活数目多于43℃+TAX组;划痕后48h,对照组细胞填满划痕区,TAX组细胞部分存活,存在较宽的划痕区,43℃+TAX组细胞大多死亡;1.4用Hoechst 33342结合PI染料对细胞进行双染色,在荧光显微镜下观察,呈现低绿色/低红色的是正常细胞,高绿色/低红色的是凋亡细胞,坏死细胞则为低绿色/高红色,对照组细胞呈低绿色和低红色,证明细胞并未发生坏死和凋亡,TAX组细胞则绿色数量增加,红色没有变化,证明已有凋亡发生,43℃+TAX组细胞呈现明显的亮绿色,证明细胞发生了明显的凋亡,而并没有发生坏死;1.5 43℃+TAX组细胞其DNA条带出现典型的DNA片段梯带现象(DNA ladder),而对照组细胞未出现DNA梯状条带,TAX组细胞的DNA梯状条带不明显,说明热疗可以诱导肺肿瘤细胞发生凋亡。2.细胞内重要信号传导通路在热疗与TAX抑制肺肿瘤细胞过程中的作用及其相互关系2.1 ROS产生水平的变化荧光法检测各组细胞内ROS,证明热疗可以明显提高细胞内ROS的表达(P＜0.05),ROS的增多可以改变细胞内氧化还原水平,损伤细胞膜,作为信号在细胞内传递,引起细胞内信号转导通路的一系列变化。2.2 MKK4表达和p-JNK水平的变化43℃+TAX组的JNK信号转导通路被激活,产生的MKK4和p-JNK高于对照组和TAX组(P＜0.05),SP600125组的p-JNK水平被抑制(P＜0.05),wortmannin组二者表达均未见明显变化(P＞0.05),NAC组二者的水平均低于43℃+TAX组(P＜0.05),说明热疗过程中产生的ROS可以激活JNK信号转导通路。2.3 p-Akt水平的变化43℃+TAX组的Akt信号转导通路被抑制,p-Akt的水平低于对照组和TAX组(P＜0.05),wortmannin组的p-Akt水平完全被抑制(P＜0.05),SP600125组的p-Akt水平低于43℃+TAX组(P＜0.05),NAC组的p-Akt水平明显高于43℃+TAX组(P＜0.05),说明热疗过程中产生的ROS可以抑制Akt通路的活化,同时,JNK信号转导通路的激活影响Akt通路的活化。2.4 Caspase-3表达水平的变化43℃+TAX组的Caspase-3表达水平高于对照组和TAX组(P＜0.05),SP600125组的Caspase-3表达水平低于43℃+TAX组(P＜0.05),wortmannin组的Caspase-3表达水平高于43℃+TAX组(P＜0.05),NAC组的Caspase-3表达水平完全被抑制(P＜0.05),说明热疗诱导的细胞凋亡是ROS通过JNK和Akt 2条通路传给caspase途径而引发的,且ROS、JNK信号转导通路对caspase有活化作用,Akt通路对其有抑制作用。2.5细胞凋亡率和细胞周期的变化43℃+TAX组G_0/G_1期和G_2/M期细胞增多,S期细胞减少(P＜0.05),wortmannin组S期细胞更少(P＜0.05),SP600125组和NAC组S期细胞数目增加(P＜0.05),G_2/M期细胞减少(P＜0.05);43℃+TAX组细胞凋亡率增加(P＜0.05),wortmannin组细胞凋亡率进一步增加(P＜0.05),而SP600125组和NAC组细胞凋亡率减少(P＜0.05)。3.HSP70在热疗与TAX抑制肺肿瘤细胞作用中的地位对照组和TAX组的HSP70表达水平几乎一致(P＞0.05),43℃组和43℃+TAX组的HSP70表达水平均较前两组增加(P＜0.05),且43℃+TAX组的HSP70表达水平低于43℃组(P＜0.05),说明热疗诱导产生的HSP70,对不同性质的细胞产生不同的效应,热疗联合TAX可能激活和/或抑制其他通路的激活,减弱了HSP70对肺肿瘤细胞的保护作用,但这个现象在正常细胞中没有观察到。4.GTSP1在热疗与TAX抑制肺肿瘤细胞过程中的作用成功构建pcDNA3.0-GSTP1真核表达载体后,转染A549细胞,获得转染与未转染的两种A549细胞,MTT结果示,GSTP1本身对细胞生长没有影响,转染与未转染细胞增殖率一致(P＞0.05),GSTP1能促进化疗药物的代谢,不同浓度TAX作用后,未转染组细胞增殖率低于转染组细胞(P＜0.05),43℃热疗联合不同浓度TAX作用后,未转染组细胞增殖率高于转染组细胞(P＜0.05);43℃热疗联合TAX作用于转染与未转染细胞,流式细胞仪检测发现,G_0/G_1期和G_2/M期细胞增多,S期细胞减少(P＜0.05)。结论及创新点1.在热疗的作用机制研究中,首次使用人呼吸道上皮BEAS-2B细胞作为研究对象,证明热疗可以减少化疗药物对正常细胞的损伤作用;热化疗联合应用可以明显增加化疗药物对肺肿瘤细胞生长的抑制作用,损伤肺肿瘤细胞膜,抑制肺肿瘤细胞的迁移,诱导肺肿瘤细胞凋亡的发生;2.通过使用通路抑制剂证明,热疗可以诱导ROS的产生,继而激活JNK信号转导通路和抑制Akt通路的活化,通过caspase途径诱导细胞凋亡的发生,热疗主要作用于肺肿瘤细胞的S期,并可使肺肿瘤细胞阻滞于G_2/M期,从而促进TAX对肺肿瘤细胞的抑制作用,同时发现,在热疗中,JNK信号转导通路的激活可以调节Akt通路的活化状态,以上结论在体内实验中得到证实;3.热疗诱导产生的HSP70,对不同性质的细胞产生不同的效应,热化联合的协同作用可能激活和/或抑制其他通路的激活,减弱了HSP70对肺肿瘤细胞的保护作用,因此比热疗能更好地抑制肺肿瘤细胞的生长,但在正常细胞中尚未观察到这个现象;4.首次构建了pcDNA3.0-GSTP1真核表达载体,并在A549细胞中进行表达;GSTP1能促进化疗药物的代谢,导致肺肿瘤细胞对化疗药物的抵抗性增高,热疗可以提高肺肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。
何嘉[7]2004年在《涎腺粘液表皮样癌的耐药相关因素及其产生机理和基因芯片的检测分析研究》文中研究说明手术治疗,放疗和化疗是当前治疗头颈部恶性肿瘤的基本而有效的方法。以上述手段为基础的抗癌综合治疗,是当前抗癌治疗方案最佳而有效的选择。但传统的观念和临床实践提示,化疗对涎腺恶性肿瘤,特别是粘液表皮样癌的治疗效果甚微,因此,临床主要采用根治性切除局部癌瘤,配合选择性放疗的方案。但关于涎腺粘液表皮样癌对化疗药物耐受的相关因素及其耐药机制的研究和认识极为有限。本研究目的在于探索涎腺粘液表皮样癌耐药性的相关因素及其产生的机制,以期合理地采用化疗,有效地提高化疗在粘液表皮样癌综合治疗中的效果。 大多体外实验中得到的耐药模型,其耐药倍数往往与临床实际并不相符,主要是因为耐药的细胞株其生存环境与活体的肿瘤并不完全一致。而在耐药荷瘤动物模型领域,技术已经比较完善,但粘液表皮样癌的耐药荷瘤动物模型至今未见报道。 基于以上原因,本研究结合了现有技术的利弊,采用逐渐加量法建立人涎腺粘液表皮样癌Mc3细胞株的耐药细胞模型,进而建立体内诱导的Mc3裸鼠移植瘤耐药实验动物模型,在此基础上采用MTT、RT-PCR、免疫组化和基因芯片等技术印证耐药性的产生,并检测了耐药细胞和(或)组织在蛋白及分子水平的变化。
车玉梅[8]2014年在《核仁素适配体修饰的雷公藤甲素体外抗胰腺癌作用研究及机制初探》文中指出目的：研究雷公藤甲素-核仁素适配体偶合物(简称偶合物)体外抗胰腺癌作用,并对其机制进行初步探索。方法：(1)采用CCK-8法检测不同浓度、时间点(24,48h)核仁素适配体细胞毒性,以及对比偶合物、雷公藤甲素,对MIA PaCa-2细胞增殖的抑制作用。(2)以吉西他滨耐药的胰腺癌胞系——-MIA PaCa-2,作为细胞模型,采用CCK-8法对比不同浓度、不同时间点(24,48,72h)偶合物和吉西他滨对MIA PaCa-2细胞增殖的抑制作用,计算药物IC50。(3)采用Annexin V/PI双染法、ELISA试剂盒检测刂Caspase-3氵舌性,检测偶合物对MIA PaCa-2细胞系凋亡诱导作用。(4)通过蛋白免疫印迹实验检测同时间点(12h,24h),不同浓度偶合物对HSP70在MIA PaCa-2中表达的影响。结果：(1)偶合物、雷公藤甲素以及核仁素适配体均可有效抑制MIA PaCa-2增殖,抑制作用具有时间和剂量依赖性。200nM核仁素适配体处理MIA PaCa-2细胞48h后,其抑制率达到38.19%。对在各个时间点,相同浓度下偶合物对MIA PaCa-2的抑制率均低于雷公藤甲素对MIA PaCa-2的抑制率,当药物作用浓度达到25nM,存在显着性差异,P<0.05。(2)在各时间点,不同浓度偶合物和吉西他滨对MIA PaCa-2均有增殖抑制作用,且具有时间和剂量依赖性。偶合物和吉西他滨IC50分别为97.86±12.52nM,142.5±31.26nM,具有统计学差异,P<0.05。(3) Annexin V/PI双染法检测结果表明,50-200nM偶合物与MIA PaCa-2共孵育24、48h后,细胞早期凋亡率为10.4%至1%；Caspase-3活性检测结果表明,50-200nM偶合物与MIA PaCa-2共孵育12、24h后,Caspase-3活性出现不同程度升高,最高可达约9.24倍。(4)免疫印迹结果表明,50-200nM偶合物与MIA PaCa-2共孵育12、24h后,细胞中HSP70表达量被显着降低。结论：核仁素适配体对雷公藤甲素的结构修饰,降低了偶合物的细胞毒性。偶合物对吉西他滨耐药的胰腺癌胞系-MIA PaCa-2有显着地抑制作用,其效果优于吉西他滨。偶合物对MIA PaCa-2可通过Caspase依赖途径诱导凋亡,其促凋亡机制可能是通过降低HSP70的表达实现。相较于吉西他滨,偶合物在体外抗胰腺癌方面表现出明显优势,有望被开发成为胰腺癌治疗药物。
周杰[9]2009年在《新中药成分在激光脑损伤保护及诱导胶质瘤细胞凋亡中的作用》文中研究指明激光致脑损伤是一种特殊类型的脑损伤,激光脑损伤的病理、生理变化特点目前尚不清楚,研究激光脑损伤的特点有重要意义。白藜芦醇是一种植物提取物,具有抗血小板聚集、抗炎、清除自由基、抗氧化及心血管保护等多种作用,但白藜芦醇是否对激光脑损伤具有神经保护作用仍不很清楚。海星皂甙-15是我国科学家自主分离获得的一种新的中药成分,它具有多种生物活性作用,包括溶血、抗病毒、抗肿瘤等,可其对胶质瘤增殖与分化的影响仍有待探索。本研究拟通过建立一种大鼠激光脑损伤模型,在明确激光脑损伤病理、生理变化的基础上,初步阐明白藜芦醇对激光脑损伤的保护作用机制;同时,体外培养胶质瘤细胞,探讨海星皂甙-15诱导胶质瘤细胞系U87MG细胞发生凋亡的分子机制,为临床利用新的中药成分治疗激光脑损伤和脑胶质瘤提供实验依据。第一部分.白藜芦醇对大鼠激光脑损伤后神经保护作用的研究激光武器是一种利用激光束摧毁飞机、导弹、卫星等目标并使其失效的定向能武器,是继核、电磁脉冲武器之外的另一种高能武器。这种武器产生的激光束具有快速、高能、穿透力极强等特点,可在瞬间穿透目标物体,将接触点汽化或熔解,从而对目标物体实现动能或热能性杀伤。高能激光武器在未来战争中的应用将会越来越普遍。激光武器对人的视力和肢体造成的损伤已有一些研究报道,但对颅脑损伤的研究则较少,因此,研究激光致颅脑损伤的特点具有重要意义。本研究以大鼠为实验动物,在建立一种稳定、可重复性激光脑损伤动物模型的基础上,检测大鼠激光脑损伤后的病理、生理变化,并探讨白藜芦醇作为激光脑损伤保护剂的作用,为战时激光颅脑损伤的救治提供实验理论依据。实验一、大鼠激光脑损伤模型的建立及生理变化目的建立一种稳定、可靠的大鼠激光脑损伤动物模型。方法成年SD大鼠100只,体质量220±30g,随机分为假手术组(n=25)和激光脑损伤组(n=75);激光脑损伤组分别用14J、28J和56J能量激光照射致伤动物,根据伤后处理时间点每组再分为5个亚组,即伤后6h、24h、48h、72h和7d组,每亚组动物5只;假手术组不予激光照射。检测照射后不同时间点动物血压、脉搏、神经功能评分和脑水肿指数变化。结果不同能量组伤后血压、脉搏、神经功能评分和脑水肿指数变化有所不同;假手术组则无明显改变。结论工作距离0.5cm、工作电流0.2mA、波长10.64μm的28J能量激光可造成稳定的激光脑损伤动物模型。实验二、大鼠激光脑损伤后的病理变化目的检测大鼠激光脑损伤后损伤区脑组织的病理变化特点,探讨激光脑损伤动物模型的特殊标记物。方法成年雄性SD大鼠36只,体质量220±30g,随机分为对照组(n=6)和激光脑损伤组(n=30);激光脑损伤组用工作距离0.5cm、工作电流0.2mA、波长10.64μm的28J能量激光照射而致伤动物,根据伤后处理时间点再分为5个亚组,即伤后6h、24h、48h、72h和7d组,每亚组6只动物;对照组不予激光照射。检测照射后不同时间点伤区脑组织HE、电镜病理形态变化,免疫组化法检测热休克蛋白70和小胶质细胞的表达。结果激光照射后不同时间点伤区脑组织HE染色显示形态变化不同;电镜病理形态变化主要表现在以血管内皮细胞受损改变为主及血脑屏障受损改变;免疫组化显示热休克蛋白70表达不同;OX-42免疫组化显示小胶质细胞激活的数量及形态变化均有异;对照组无明显改变。结论系统检测大鼠激光脑损伤后病理改变,揭示小胶质细胞可作为大鼠激光脑损伤的标记物。实验叁、白藜芦醇对大鼠激光脑损伤的神经保护作用目的检测大鼠激光脑损伤后生化指标改变,探讨白藜芦醇的神经保护作用。方法成年SD大鼠55只,体质量220±30g,随机分为假手术组(n=5)、激光脑损伤组(n=25)和白藜芦醇治疗组(n=25);激光脑损伤组和治疗组用28 J能量激光照射致伤动物,根据伤后处理时间点每组再分为5个亚组,即伤后6h、24h、48h、72h和7d组,每亚组5只;假手术组不予激光照射。检测各组动物在白藜芦醇处理前后不同时间点神经行为学评分、脑水肿指数变化;并用氨基酸分析仪检测多种氨基酸的变化;放射免疫法检测血清炎性因子的改变;免疫印迹法检测热休克蛋白70的表达。结果白藜芦醇治疗组神经行为学评分增加,脑水肿指数降低,兴奋性氨基酸水平下降,热休克蛋白70表达增多。结论白藜芦醇可作为大鼠激光脑损伤有效的神经保护剂。第二部分.海星皂甙-15通过线粒体途径诱导U87MG细胞凋亡的实验研究脑胶质细胞瘤是中枢神经系统最常见的原发性肿瘤,约占成人颅内肿瘤的40%～50%,其恶性度高,侵袭性很强,手术治疗后仍易复发;放疗和化疗虽然也有疗效,但患者总的预后仍无明显改善。目前,越来越多的学者开始致力于寻找对胶质瘤更有效的化疗药物研究,以期提高胶质瘤的治疗效果。海星皂甙-15是我国科学家从我国南海叁亚海域面包海星中分离鉴定的、具有生物活性的一系列海星皂甙中的第15个,该化合物分子式为C45H74O22S2Na2,分子量为1076,系统命名:(20R,24S)-6a-O-[3-O-甲基-b-D-吡喃奎诺糖基-(1?2)-b-D-吡喃木塘基-(1?3)-b-D-吡喃葡萄糖基]-5a-胆甾-9(11)-烯-3b,24-二硫酸钠盐。已有研究表明它具有多种生物活性,包括溶血、抗病毒、抗肿瘤等,本研究利用人脑胶质母细胞瘤细胞系U87MG细胞研究海星皂甙-15在体外对肿瘤细胞的影响,探索其作用机理,以期为临床发现新的、更有效的抗肿瘤化疗药物。目的探讨面包海星提取物海星皂甙-15对人胶质母细胞瘤U87MG细胞的影响及可能作用机理。方法体外培养人胶质母细胞瘤U87MG细胞,采用MTT实验检测海星皂甙-15对U87MG增殖的影响;DNA Ladder检测凋亡片段;透射电镜检测细胞和线粒体形态学改变;Hoechst33342和Tunel染色检测细胞核变化;流式细胞分析仪检测细胞凋亡、细胞周期及线粒体跨膜电位(△Ψm)的改变;Western blot分析细胞色素C、Caspase-3蛋白表达的变化。结果海星皂甙-15呈时间和剂量依赖性抑制U87MG细胞增殖,并诱导U87MG细胞凋亡,其作用在12h、24h、48h、72h的IC50分别为9.9、5.3、3.8、2.6μg/mL;海星皂甙-15引起线粒体结构损伤,出现线粒体嵴断裂、△Ψm下降、细胞色素C释放增多、Caspase-3蛋白活化。结论海星皂甙-15能抑制U87MG细胞增殖并诱导细胞凋亡,通过线粒体损伤途径可能是其作用机理。总结:1、建立一种稳定、可重复的大鼠激光脑损伤动物模型,系统观测了大鼠激光脑损伤后血压、脉搏、神经行为学评分及脑水肿改变;透射电子显微镜观察了伤区脑组织的超微结构改变;免疫组化法检测伤后热休克蛋白70和小胶质细胞激活的时程及形态变化规律;探讨了白藜芦醇对大鼠激光脑脑损伤的神经保护作用,指出白藜芦醇可以作为大鼠激光脑损伤的神经保护剂。2、体外培养人脑胶质母细胞瘤U87MG细胞,探讨不同浓度及作用时间海星皂甙-15对人脑胶质母细胞瘤U87MG细胞的影响。结果显示海星皂甙-15呈时间和剂量依赖性抑制人脑胶质母细胞瘤U87MG细胞增殖,并诱导U87MG细胞凋亡,线粒体损伤途径可能是其作用机理。
田彦璋[10]2011年在《葡萄糖神经酰胺合成酶参与肝癌细胞多药耐药的实验研究》文中研究指明研究背景：肝细胞性肝癌是常见的恶性肿瘤之一,严重危害人类的健康和生命,全球约半数的肝癌患者集中在中国。我国每年约有11万人死于肝癌,居恶性肿瘤病死率的第二位。其起病隐匿、早期诊断难,且侵袭性强、复发转移率高,因此预后较差。在肝癌的综合治疗中,化疗是其重要治疗手段之一,但多药耐药的发生常导致化疗失败。肿瘤多药耐药(MDR)是指一种药物作用于肿瘤使之产生耐药后,该肿瘤对其他结构无关、机制相异的多种抗肿瘤药物也具有耐药性。MDR的形成是肿瘤免受化疗药物攻击的细胞防御机制,也是肿瘤化疗失败的主要原因。近年来神经酰胺途径在多药耐药中的作用逐渐引起了人们的关注。神经酰胺作为第二信使参与调节细胞的凋亡。细胞内葡萄糖神经酰胺合成酶(GCS)是一种葡萄糖基转移酶,参与神经酰胺的代谢,可催化尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-glucose)上的葡萄糖基与神经酰胺结合,使神经酰胺糖基化成无细胞毒性的葡萄糖神经酰胺(GlcCer),从而降低了细胞内神经酰胺的含量,使细胞逃避神经酰胺介导的细胞凋亡作用,导致多药耐药的发生。GlcCer可被一系列糖基转移酶修饰,合成更高形式的鞘糖脂,这些鞘糖脂与肿瘤细胞的生物学行为密切相关,不仅维持着细胞的正常结构功能,还参与细胞增殖、分化、免疫识别和信号转导等,可以对抗药物诱导的细胞凋亡,亦使肿瘤细胞发生多药耐药。目前,国内外研究者对于GCS参与肿瘤耐药的研究主要集中在乳腺癌、白血病、胃癌、卵巢癌、黑色素瘤以及表皮样癌等恶性肿瘤,对于其在肝癌细胞多药耐药中作用机制尚无研究报道,GCS参与肿瘤细胞多药耐药的作用机制尚未完全清楚。在多药耐药逆转方面,已发现的一些耐药逆转剂在临床应用中特异性不高、毒副作用严重,其临床应用受到限制；目前的基因治疗也存在特异性不强、效率不高、临床应用困难等缺点。因此,寻找高效、低毒的耐药抑制剂成为目前研究的热点。研究目的：本研究旨在通过基因转染技术使肝癌细胞HepG2内GCS高表达,观察细胞耐药性的变化情况,明确GCS是否参与了肝癌的多药耐药；观察高表达GCS基因的细胞株HepG2/GCS内多药耐药基因MDR1的表达情况,明确GCS与MDR1在肝癌多药耐药中是否具有相关性,进一步探讨GCS在肝癌多药耐药中的作用机制；运用黄芪甲苷进行逆转耐药的研究,观察其对肝癌细胞多药耐药的逆转效果,探讨其可能的机制。研究方法：1.构建GCS基因的真核表达质粒pEGFP-GCS,应用脂质体转染法将其导入HepG2细胞,经G418筛选后建立稳定表达的肝癌细胞模型HepG2/GCS,以空载体转染细胞HepG2/pEGFP作为阴性对照；2.应用RT-PCR和WesternBlot法检测基因转染后HepG2细胞内GCS mRNA和GCS蛋白的表达；3.流式细胞仪检测基因转染后HepG2细胞在5-Fu作用下的凋亡情况；4.分别应用RT-PCR和WesternBlot法检测HepG2/GCS细胞内MDR1mRNA和P-gp的表达；5.通过MTT比色法检测HepG2细胞和HepG2/GCS细胞对阿霉素的敏感性,计算IC50；6.以MTT比色法检测黄芪甲苷的细胞毒性,及其对HepG2/GCS细胞药物敏感性的影响；7.应用Hoechst 33258染色检测黄芪甲苷联合阿霉素对HepG2/GCS细胞凋亡的影响；8.Western blot检测黄芪甲苷对细胞GCS蛋白和P-gp表达的影响及黄芪甲苷联合ADM对HepG2/GCS细胞Caspase3表达的影响；9.使用SPSS13.0软件进行统计分析,实验数据用均数±标准差(x±s)表示,组间均数比较采用t检验,P<0.05表示有统计学意义。结果：1.成功构建了GCS基因的真核表达质粒pEGFP-GCS,应用脂质体转染法将其导入HepG2细胞,应用G418抗生素筛选出稳定表达的细胞株HepG2/GCS;2. RT-PCR与WesternBlot结果表明,基因转染细胞HepG2/GCS的GCS mRNA的相对表达量为2.42±0.13,较HepG2/pEGFP细胞0.34±0.02和HepG2细胞0.41±0.03明显增加(P<0.05),HepG2/GCS细胞内GCS蛋白表达量为HepG2细胞的4.8倍,差异具有统计学意义(P<0.05),证明高表达GCS基因肝癌细胞株HepG2/GCS构建成功；3.流式细胞仪检测结果表明,经终浓度为200μg/ml的5-Fu作用后,HepG2/GCS细胞的凋亡峰明显低于正常细胞,HepG2/GCS细胞的凋亡率明显低于HepG2/pEGFP细胞和HepG2细胞(P<0.05)；4.基因转染细胞株HepG2/GCS的GCS mRNA、MDR1 mRNA表达较HepG2/pEGFP细胞和HepG2细胞均明显增加,差异有统计学意义(P<0.05),HepG2/GCS细胞内GCS蛋白和P-gp表达量分别为HepG2细胞的4.8倍、1.55倍,差异具有统计学意义(P<0.05)；5.MTT法检测结果显示,阿霉素对HepG2/GCS细胞和HepG2细胞的ICso值分别为(11.6±1.05)μg/ml和I(6.2±0.35)μg/ml,两者比较差异有统计学意义(P<0.05),耐药倍数为1.87；其对HepG2/pEGFP细胞和HepG2细胞的作用则无明显差异(P>0.05)；6.细胞毒性检测结果显示黄芪甲苷对HepG2/GCS细胞无明显毒性,经终浓度为40μg/ml的黄芪甲苷作用后,HepG2/GCS细胞对阿霉素的敏感性增强,其IC50值为(7.7±0.24)μg/ml,较未作用组HepG2/GCS细胞(11.6±1.05)μg/ml明显降低(P<0.05),逆转倍数为1.50；7. Hoechst 33258染色结果显示：经黄芪甲苷处理后,HepG2/GCS细胞对阿霉素敏感性增强,在阿霉素作用下,HepG2/GCS细胞发生凋亡、坏死,许多细胞脱离贴壁,无法观察到,而残余细胞大部分呈现出典型的凋亡形态；8. Western blot检测黄芪甲苷对细胞GCS蛋白表达的影响,结果显示经浓度为40μg/ml的黄芪甲苷作用后,HepG2/GCS细胞内GCS蛋白量为1.05±0.09,较作用前1.71±0.2明显下降(P<0.05),而细胞内P-gp的表达无明显变化；9. Western blot检测黄芪甲苷联合ADM对HepG2/GCS细胞Caspase3表达的影响,结果显示：联合使用黄芪甲营和ADM后,HepG2/GCS细胞内Caspase-3的含量上升为1.98±0.13,与单用ADM组1.17±0.15比较有显着差异(P<0.05)。结论：1、高表达GCS可以使肝癌细胞HepG2对化疗药物5一Fu、阿霉素的药物敏感性降低,提示GCS参与介导了肝痛细胞HepG2的多药耐药。2、在高表达GCS基因的耐药肝癌细胞株HepG2/GCS内,多药耐药相关基因MDR1表达上调,提示在肝癌细胞多药耐药过程中,GCS基因与MDR1基因具有『E相关性,这可能是GCS参与肝癌多药耐药的机制之3、黄芪甲苷可以提高耐药肝癌细胞株HepG2/GCS对阿霉素的敏感性,其机制可能是下调GCS的表达,激活caspases凋亡级联通路而增强了阿霉素诱导细胞凋亡的作用。实验表明,黄芪甲苷是一个低毒、有效的耐药逆转剂,有望进一步应用于临床研究。
参考文献：
[1]. 白血病细胞药物敏感实验和HSP70在耐药机制中作用的研究[D]. 何璐璐. 四川大学. 2004
[2]. 雷公藤甲素通过miR-21调节白血病细胞药物敏感性的分子机制[D]. 李皓. 江苏大学. 2012
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[4]. 急性白血病bcl-2蛋白、p53蛋白、p170蛋白的表达水平及临床意义[D]. 许文前. 福建医科大学. 2006
[5]. 人骨肉瘤细胞多药耐药机制及其逆转剂的研究[D]. 高志学. 吉林大学. 2007
[6]. 热疗对紫杉醇抑制肺肿瘤细胞的促进作用及其机制[D]. 王琳. 郑州大学. 2008
[7]. 涎腺粘液表皮样癌的耐药相关因素及其产生机理和基因芯片的检测分析研究[D]. 何嘉. 四川大学. 2004
[8]. 核仁素适配体修饰的雷公藤甲素体外抗胰腺癌作用研究及机制初探[D]. 车玉梅. 西南交通大学. 2014
[9]. 新中药成分在激光脑损伤保护及诱导胶质瘤细胞凋亡中的作用[D]. 周杰. 第四军医大学. 2009
[10]. 葡萄糖神经酰胺合成酶参与肝癌细胞多药耐药的实验研究[D]. 田彦璋. 山西医科大学. 2011
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