浙江大学医学院附属第二医院干部保健科 浙江杭州 310009
摘要 将 KIF5B-RET序列连接到Lenti6.3-eGFP上，重组获得慢病毒载体，包装生产慢病毒并测定其滴度，再将此慢病毒转染肺癌细胞系并筛选验证。本实验成功构建了KIF5B-RET慢病毒载体，并建立稳定表达KIF5B-RET的肺癌细胞系。
关键词 KIF5B-RET基因；慢病毒载体；肺癌细胞
一、引言
RET（rearranged during transfection）融合基因是新发现的肺腺癌驱动基因，已成为独立的新的分子亚型[1]。Cabozantinib等几种市售的多靶点激酶抑制剂均能抑制RET激酶活性[2]，但特异的小分子抑制剂需进一步研究开发。慢病毒表达载体具有高转染效率，目的基因可整合到宿主细胞基因组中，且长期表达。本研究通过成功构建KIF5B-RET基因慢病毒载体，建立稳定表达 KIF5B-RET的肺癌细胞系，为药物开发及筛选奠定基础。
二、材料与方法
1.材料
慢病毒载体 pLenti6.3_MCS（图1）购自Invitrogen公司，KIF5B-RET融合基因质粒由本实验室保存。293T细胞购自中科院上海细胞库。限制性内切酶 PacI、AscI、T4 DNA ligase购自NEB公司。 Lipofectamine2000购自 Invitrogen 公司。质粒提取、胶回收试剂盒购自 Biomiga公司。
2. 慢病毒表达载体的构建及鉴定
用PacI / AscI把质粒37℃酶切2小时，电泳回收后，用T4 DNA ligase连接回收的片段与载体。取10ul连接产物转化感受态细胞DH5a。涂平板挑取单克隆摇菌，质粒中抽试剂盒提取质粒。
3. 病毒包装
取 293T细胞按照每个10cm的培养皿6x106个细胞数铺板。第2天，取9ug Packaging Mix和 3ug慢病毒质粒加入1.5ml Opti-MEM混匀。取36ul lipofectamine2000 加入1.5 ml Opti-MEM中，混匀后将3ml复合物加入到细胞中过夜，换用培养基后培养3 d，收获细胞培养上清，分装，－80℃保存。
4. 测定慢病毒液滴度
制备标准品，取10ul慢病毒原液分别用无菌水稀释至10倍、100倍、1000倍，作为LV-1、Lv-2、Lv-3。将标准品和慢病毒样品，通过QPCR检测。
2.4测定MOI值
按照每孔1x104A549细胞接种至12孔板，过夜后病毒液按照 MOI=2，5，10，20，50，100，200稀释Lenti6.3-eGFP并加入各细胞孔，72小时观察GFP表达情况。
6. 病毒感染
按照每孔4.5x105 A549细胞接种至六孔板中，按照 MOI=10稀释慢病毒后加入培养4小时，更换培养基，48小时后收集细胞抽提RNA检测目的基因表达情况。
7.稳转细胞的建立
在病毒感染48小时后重新铺板，加入抗生素Blastcidin筛选培养14天，再单克隆细胞株挑选培养并western验证。
三、结果
1.病毒滴度测定
将标准品和各稀释度的慢病毒样品，通过QPCR检测，并计算各稀释液中的病毒颗粒数，如果三个稀释度的CT值均在标准曲线范围内，则取其平均值。Lenti-RET滴度：{（9.71E+09）+（8.41E+09）+（9.69E+09）}/3=9.27E+09VP/ml。Lenti-KIF5B-RET滴度：{（1.91E+10）+（1.59E+10）+（1.93E+10）}/3=1.81E+10VP/ml
2. MOI值测定
慢病毒侵染A549细胞测定MOI值。使用培养基按照 MOI=2，5，10，20，50，100，200稀释Lenti6.3-eGFP，72小时后观察GFP表达情况。结果：MOI>5时，细胞的GFP比例在50%以上，且慢病毒对于细胞的形态影响不明显。对该细胞最佳感染MOI值选择5-10。
四、讨论
慢病毒载体是指以人类免疫缺陷病毒-1（H IV-1）来源的一种病毒载体。通过慢病毒载体能够将外源基因插入肺癌细胞基因组内，实现目的基因的稳定表达。本实验所采用的慢病毒载体 pLenti6.3_MCS，上面包括包装信号以及截短的HIV 3’及5’LTR，便于病毒包装。
慢病毒载体具有下列优点：①可实现目的基因高效转染靶细胞并能长期稳定表达；②包装工艺相对简单；③载体经改构后，不在宿主细胞繁殖，不易诱发免疫反应，不会导致宿主细胞死亡，被它感染的细胞能连续传代，生物安全性高，以慢病毒为基因转染载体，将外源基因导入肺癌细胞中是一种可靠有效的方法[3]。
实验将KIF5B-RET基因克隆至慢病毒表达载体pLenti6.3_MCS，包装后感染A549细胞获得稳定转染肺癌细胞系，证实了该重组病毒的活性及其转导肺癌细胞的可行性。同时建立了稳定表达KIF5B-RET的肺癌细胞系，可作为药物筛选及机制研究的有效细胞模型。为相关靶向药物模拟体内微环境，检测阳性肺癌细胞的增殖凋亡情况，为RET融合基因相关靶向药物的筛选及发现奠定了基础。
参考文献：
[1]Pao，W.，et al.，New driver mutations in non-small-cell lung cancer. Lancet Oncol，2011. 12（2）：p. 175-80.
[2]Drilon，A.，et al.，Response to Cabozantinib in patients with RET fusion-positive lung adenocarcinomas. Cancer Discov，2013. 3（6）：p. 630-5.
[3]张磊，等. 第三代慢病毒高效率包装系统的建立. 基因组学与应用生物学，2009，28（2）：326-330.
论文作者:钱盈盈
论文发表刊物:《健康世界》2017年15期
论文发表时间:2017/10/13
标签：病毒论文; 细胞论文; 载体论文; 基因论文; 肺癌论文; 细胞系论文; 质粒论文; 《健康世界》2017年15期论文;