杨斌
邛崃医疗中心医院内三科，四川成都 611530
摘要：目的 通过观察乙醛刺激的肝星状细胞生长速度的变化以及细胞中Wnt信号通路中主要下游分子及目的基因mRNA表达的改变，探讨乙醛刺激对肝星状细胞活化的作用机制。方法 用乙醛刺激大鼠肝星状细胞，与同时正常培养的大鼠肝星状细胞为对照[1]。由MTT法绘制细胞生长曲线并对比。同时采用RT-PCR从mRNA水平观察Wnt信号通路相关指标的变化。结果 从细胞生长曲线的对比可以清晰发现：大鼠肝星状细胞在乙醛刺激后的生长和增殖速度明显高于正常细胞组。在乙醛刺激的大鼠肝星状细胞中，Wnt信号通路中β- catenin（β一链蛋白）的mRNA表达增强[2]。结论 乙醛通过对大鼠肝星状细胞中Wnt信号通路的活化刺激大鼠肝星状细胞的增殖。
关键词 乙醛；肝星状细胞；Wnt信号通路。
Abstract： Objective We explored the influence of acetaldehyde to rat hepatic stellate cells by observe the proliferation in rat hepatic stellate cells and the diversity of downstream molecules’ mRNA expression in wnt signaling pathway.
Methods we pretreat the rat hepatic stellate cell with acetaldehyde，using normal rat hepatic stellate cell as control. Drawn the cell growth curve using the method MTT，meanwhile RT-PCR methods were used in the study of downstream molecules’ mRNA expression in wnt signaling pathway.
Results From the contrast of the cell growth curve，we found clearly that growth and proliferation rate of rat hepatic stellate cells stimulated by acetaldehyde is faster than normal rat hepatic stellate cell as control..We also found that β-catenin（β-catenin）gene expression are enhanced in rat hepatic stellate cell stimulated by acetaldehyde. Conclusion The acetaldehyde can enhance the rat hepatic stellate cell’s proliferation through stimulating the wnt signaling pathway in cell.
Key Words：hepatic stellate cells；Wnt Signaling pathway；salidroside
肝星状细胞的活化是肝纤维化的核心环节，是临床肝纤维化的基础。长期大量饮酒是肝纤维化甚至肝硬化的重要病因，探讨乙醇的体内主要分解产物乙醛对肝细胞的刺激作用对临床上找到治疗酒精性肝纤维化的有效方法有重要意义。近年研究发现Wnt信号通路与肝星状细胞（HSC）活化及肝纤维化发生相关[3]。当Wnt经典通路活化时，Wnt与受体蛋白Frizzled结合并使未磷酸化的β-catenin在胞质中积累并转运到核中，从而激活转录因子，进一步激活细胞周期蛋白Cyclin-D基因等开始进行转录，刺激细胞增殖、永生化，去分化和转化等[4，5]。本实验运用RT-PCR的方法，在RNA水平上，对经乙醛刺激的大鼠肝星状细胞中经典Wnt信号通路的代表分子β-catenin进行检测和比对。进一步探讨乙醛对大鼠肝星状细胞活化的影响。
1、材料和方法
1．1实验材料
大鼠HSC-T6细胞株，DMEM F-12 1：1培养基、小牛血清购自HyClone（Thermo），40%乙醛购自成都市科龙化工试剂厂，RT-PCR试剂盒购至Takara公司，β-catenin单克隆抗体购自Santa Cruze公司。
1．2 实验方法
1.2.1细胞的复苏和培养 将大鼠HSC-T6细胞复苏。用DMEM F-12 1：1完全培养基（20%小牛血清）培养，待细胞覆盖90%瓶底时，分瓶传代，用25ml培养瓶继续培养细胞，备实验使用。
1.2.2实验分组 大鼠HSC-T6细胞传代24小时后供实验，分为二组，为正常组、乙醛处理组。每组四瓶细胞。正常组用DMEM F-12 1：1完全培养基（20%小牛血清）培养48小时，乙醛处理组直接用200umol/ml的乙醛加2ml完全培养基培养24小时（终浓度为120umol/ml）。培养完成后，收集以上各组细胞供下一步实验。
1.2.3显微镜观察各组细胞形态变化并绘制生长曲线 各组细胞在生长过程中，通过显微镜观察细胞形态的变化，记录分析。用MTT法检测细胞并绘制生长曲线。
1.2.4 RT-PCR 检测各组细胞β-catenin的mRNA表达。
将各组细胞用trizol裂解收集后，氯仿、异丙醇提取总RNA，用RT-PCR试剂盒并按试剂盒说明书操作逆转录，两步法行RT-PCR，将总RNA逆转录为cDNA后，以天根酶系比例加入试剂，各组总RNA分别加入β-catenin、的引物和Taq酶，每反应体系20UL，放入PCR仪，先确定各检测指标的最适温度，最后各组细胞对检测指标共同检测。
1.2.6 统计学处理
RT-PCR 检测得出各组指标中mRNA指数（RI），数据以均数±标准差（x±s）表示.用SPSS 10.0软件进行分析。组间比较用秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义。两样本比较用t检验对数据进行统计分析，以P<0.05为差异有统计学意义.
2、结果
2．1 细胞生长情况 正常组细胞形态为星形贴壁生长，中央可见细胞核，细胞内脂滴少，乙醛处理组的细胞显微镜下形态均出现明显变化，细胞增殖明显，细胞内脂滴明显增多。并且在用trizol裂解收集细胞时，细胞裂解缓慢，和培养瓶壁附着紧密，不易脱落，需用细胞刮刮下。见细胞图片1、2（附后）。先调整细胞浓度为一致，用96孔板每孔加入100ul细胞悬液，5%CO2，37℃孵育，以32孔为一组，至细胞贴壁，按分组方案加入药物. 在 5%CO2，37℃条件下培养孵育，分别于24小时、48小时、72小时、144小时，加入20ulMTT溶液、二甲基亚砜，以未接种细胞只加培养基孔为空白对照并调零，在酶联免疫检测仪OD490nm（570nm）处测量各孔的吸光值，实验重复三次，取各组平均质，以培养时间为横轴，吸光度为
纵轴，绘制细胞生长曲线如下：
从细胞生长曲线发现：经乙醛刺激后的大鼠肝星状细胞生长速度相对于正常组明显加快。
2．2 RT-PCR检测结果：
RT-PCR实验结果经琼脂糖凝胶电泳电泳后，各检测指标条带清晰，各组目的基因PCR扩展后的片段长度和预想长度一致。各检测指标RI作为各组细胞中检测指标mRNA的相对含量。实验结果表明：与正常组相比，大鼠肝星状细胞中的β-catenin mRNA表达在乙醛刺激后均不同程度的出现增高。表明Wnt信号通路参与了乙醛对大鼠肝星状细胞的刺激活化过程（P<0.05）。（见图片3）
附 图片：
3、讨论
乙醛可明显促进肝纤维化[7]，但是其发生机制还需进一步研究。Wnt信号通路是近年来在分子生物学、细胞生物学和肿瘤研究中的一大热点。有研究表明Wnt信号通路与肝星状细胞的活化及肝纤维化的发生相关。Zeng等[8]发现Wnt信号通路参与HSC的活化。由于肝星状细胞（HSC）的活化是肝纤维化发生的中心环节，因此有必要深入探讨乙醛刺激肝星状细胞增殖、活化与Wnt信号通路活化之间的联系机制，并找到能抑制酒精性肝纤维化的药物[9，10]。
本实验通过观察细胞生长曲线及Wnt信号通路中重要下游分子mRNA 表达情况，在细胞和分子水平上了解乙醛刺激的大鼠肝星状细胞的变化。实验结果认为：1、乙醛能有效刺激大鼠肝星状细胞的增殖。大鼠肝星状细胞经乙醛刺激后生长速度相对于正常组明显加快。2、乙醛刺激的大鼠肝星状细胞中Wnt信号通路的β-catenin mRNA 表达明显增强，表明乙醛刺激可能导致大鼠肝星状细胞中Wnt信号通路的活化，并通过Wnt信号通路的活化刺激体外培养的大鼠肝星状细胞的增殖和活化。
参考文献：
[1]、Ha MH，Wei L，Rao HY，Liu F，Wang XY，Feng B，Fei R，Chen HS，Cong X，Effect of interferon-gamma on hepatic stellate cells stimulated by acetaldehyde，Hepatogastroenterology. 2014；55（84）：1059-1065
[2]、Pérez-Carreón JI，Martínez-Pérez L，Loredo ML，etal.. Inhibition of hepatic damage and liver fibrosis by brain natriuretic peptide，FEBS Lett. 2012 18；583：2067-2070
[3]、Shin HW，Park SY，Lee KB，Jang JJ，Down-regulation of Wnt signaling during apoptosis of human hepatic stellate cellsHepatogastroenterology..2009；56：208-212
[4]、R?hrs S，Kutzner N，Vlad A，Grunwald T，Ziegler S，Müller O，Chronological expression of Wnt target genes Ccnd1，Myc，Cdkn1a，Tfrc，Plf1 and Ramp3，Cell Biol Int. 2014，33：501-508.
[5]、Wang J，Wang X，Gong W，Mi B，Liu S，Jiang B，Increased expression of beta-catenin，phosphorylated glycogen synthase kinase 3beta，cyclin D1，and c-myc in laterally spreading colorectal tumors，J Histochem Cytochem. 2013；57：363-371
[6]、Gao H，Le Y，Wu X，Silberstein LE，Giese RW，Zhu Z，VentX，a novel lymphoid-enhancing factor/T-cell factor-associated transcription repressor，is a putative tumor suppressor，Cancer Res. 2010 1；70（1）：202-211
[7]、Krieghof E，Behrens J，Mayr B．Nucleo—cytoplasmic distribution of beta-catenin is ergulated by retention[J]．J Cell Sci，2010，119 （7）：1453-1463.
[8]、Zeng G，Awan F，Otruba W，etal. Wnt'er in liver：expression of Wnt and frizzled genes in mouse. Hepatology，2007，45：195-204.
[9]、Zhang Y，Liu Y. Study on effects of salidroside on lipid peroxidation on oxidative stress in rat hepatic stellate cells，Zhong Yao Cai. 2005；28（9）：794-796
[10]、何益，熊伍军，刘菲. Wnt信号传导通路与肝纤维化.国际消化病杂志，2010，28：57-59.
论文作者:杨斌
论文发表刊物:《健康世界》2015年第14期供稿
论文发表时间:2015/11/20
标签：细胞论文; 乙醛论文; 星状论文; 大鼠论文; 信号论文; 培养基论文; 肝纤维化论文; 《健康世界》2015年第14期供稿论文;