王强[1]2004年在《寄生虫感染后蜜蜂血淋巴中血细胞及总蛋白的动态变化研究》文中提出利用自制微孢子虫(Nosema apis)悬液(5.5×10~7个孢子／毫升)与50％的白糖水1：1混合，以每次20毫升剂量对幼年健康意蜂(Apis mellifera)进行感染，每日一次，连续21次，制作动态病理模型。从感染即日起，每日取血浆样品一份，共收集血淋巴样品30份。采用考马斯亮蓝法(Brodford method)，测定蜜蜂血浆蛋白总量；另分别随机抓取一定数量的患病蜜蜂及健康蜜蜂，利用血球计数法比较它们血淋巴中血细胞数量的差异。结果显示：病蜂血浆蛋白总量，在感染后1～10天呈上升趋势，然后逐渐下降，13～30天保持在感染前蜜蜂血浆总蛋白水平以下；同时患病蜜蜂的血淋巴中血细胞平均数量大大高于正常蜜蜂。这说明蜜蜂对于微孢子虫的侵染有一定的免疫防御能力，同时，微孢子虫的长期寄生造成蜜蜂血浆蛋白明显下降。 自然感染大蜂螨(Varroa)的青年意大利工蜂(Apis mellifera)和健康对照组，采用考马斯亮蓝法(Brodford method)法，测定其血淋巴蛋白质总量，并用高压等电点聚焦法进行血淋巴蛋白质分类。其结果表明，螨害组血淋巴蛋白质平均含量为19.25毫克／毫升，健康对照组为10.2毫克／毫升。螨害组与健康组血淋巴蛋白质含量差异极显着；高压等电点聚焦分析结果表明，自然感染大蜂螨后，成蜂血淋巴蛋白质组分与健康对照组相比较发生了明显的改变。
张忠[2]2005年在《蝶蛹金小蜂和丽蝇蛹集金小蜂毒液的生化特性与生理功能》文中指出本论文针对国内外有关寄生蜂毒液性质与功能研究主要限于姬蜂科和茧蜂科,而有关其它科寄生蜂研究甚少之现状,特对隶属金小蜂科的蝶蛹金小蜂和丽蝇蛹集金小蜂毒液的性质和功能进行了系统研究,主要结果概括如下: 1 蝶蛹金小蜂成蜂生殖系统抑制寄主细胞免疫因子的确定 蝶蛹金小蜂卵巢、卵子、输卵管、睾丸和雄性附腺提取物处理其寄主菜粉蝶蛹和柑桔凤蝶蛹血细胞后,其细胞延展率、死亡率及对Sephadex A-50微珠的包囊率与对照相比均无显着差异;而雌蜂毒液则可显着抑制血细胞延展及对Sephadex A-50微珠的包囊,并引起血细胞的显着死亡。可见,蝶蛹金小蜂毒液是抑制其寄主血细胞免疫的主要因子。此蜂毒液的功能显然不同于具多分DNA病毒(PDV)的茧蜂或姬蜂。 2 两种金小蜂毒器官发育动态及其与卵子发育的关系 饲以蜂蜜的蝶蛹金小蜂和丽蝇蛹集金小蜂雌蜂发育过程中,毒腺长度变化不大,毒囊变化明显,雌蜂刚羽化时,毒囊形态较瘪,随雌蜂的发育毒囊体积迅速膨大,蛋白含量迅速增加,3d后稳定于一定水平,并持续至死亡。未喂食蜂蜜水的蝶蛹金小蜂发育过程中,毒腺长度变化不明显,毒囊发育相对较慢,雌蜂寿命明显缩短。交配和喂食蜂蜜水对蝶蛹金小蜂和丽蝇蛹集金小蜂雌毒腺长度均无显着影响,交配不影响两种金小蜂雌蜂毒囊大小和毒液蛋白含量,但喂食蜂蜜水对此可产生显着正面影响。 喂食蜂蜜水并正常交配的蝶蛹金小蜂毒器官各组成部分的发育与其卵巢中成熟卵的数量均存在正相关关系,而与其卵巢中Ⅰ级卵和Ⅱ级卵的数量成负相关关系。毒器官各组成部分之间的发育也呈现相应的线性关系。丽蝇蛹集金小蜂毒囊直径发育与其卵巢中Ⅱ级卵数量存在相关关系,毒器官其它组分与卵巢中各级卵数量均无线性相关关系。毒器官各组成部分之间的发育呈线性关系。 3 两种金小蜂毒液的蛋白组成及分子特性 蝶蛹金小蜂毒液蛋白的梯度PAGE电泳结果显示由12条谱带组成,分子量为17.47～879.67kDa,其中7条带大于100kDa,蛋白含量以分子量为558.64kDa、308kDa和178.17kDa的叁条蛋白谱带为主。丽蝇蛹集金小蜂毒液蛋白的梯度PAGE图谱由9条带组成,分子量为17.62～809.94kDa,其中以分子量为246.20kDa蛋白含量为最高。SDS-PAGE分析表
张永亮[3]2008年在《野桑蚕等酚氧化酶的生化特性、基因克隆、表达及功能研究》文中研究说明酚氧化酶(Phenol Oxidase，简称PO，在哺乳动物中称为酪氨酸酶)广泛存在于生物体内，它是昆虫生命活动中的重要调节酶，在昆虫的变态发育和免疫系统中起着重要的作用。酚氧化酶催化完成的“醌鞣化”作用可以促进昆虫表皮的硬化与黑化，这个过程对于昆虫的成活至关重要。酚氧化酶抑制剂理论可以为开发以该酶为靶标的新型害虫控制剂提供重要的线索。野桑蚕和桑尺蠖是桑园的主要害虫，终年危害桑树，常爆发成灾。采用化学方法防治，存在害虫抗药性增强和污染环境等问题。因此，开发对环境友好和专一的酶抑制剂有着广阔的应用前景。本研究以鳞翅目的害虫野桑蚕和桑尺蠖以及典型的模式生物家蚕为试验材料，通过对野桑蚕和桑尺蠖酚氧化酶的分离纯化、生化特性、抑制动力学以及对野桑蚕酚氧化酶原基因克隆、生物信息学分析、半定量RT-PCR表达谱和家蚕酚氧化酶原基因表达谱差异比较及RNAi等的研究和分析，主要获得以下结果：1．采用0-40％饱和度的硫酸铵盐析沉淀对野桑蚕酚氧化酶进行了分离纯化，结果酶活力提高了2．33倍，然后用Sephadex G-100凝胶过滤层析技术对野桑蚕酚氧化酶进行了纯化，经两步纯化后，酚氧化酶活力提高了57．14倍。2．采用0-80％饱和度的硫酸铵盐析沉淀对桑尺蠖酚氧化酶进行了分离纯化，结果酶活力提高了1．55倍，然后用Sephadex G-100凝胶过滤层析技术对桑尺蠖酚氧化酶进行了纯化，经两步纯化后，酚氧化酶活力提高了6．28倍。3．野桑蚕酚氧化酶的最适pH值为7．0，在33℃-43℃的范围内，酶活性几乎无变化，其最适温度为37℃左右。70℃时保温15min，酶活力还有原活力的28％。4．桑尺蠖酚氧化酶的最适pH值为7．0，最适温度为37℃。70℃时保温15min，酶活力还有原活力的12％。5．以3种结构相似的多元酚作为底物研究野桑蚕和桑尺蠖酚氧化酶底物专一性的结果表明，野桑蚕酚氧化酶对邻苯二酚的亲和力高于L-多巴，对焦性没食子酸的亲和力最低，该酶对邻苯二酚、L-多巴和焦性没食子酸的K_m值分别为2．06mmol／L、3．17mmol／L和3．39mmol／L。而桑尺蠖酚氧化酶对L-多巴的亲和力高于邻苯二酚，对焦性没食子酸的亲和力最低，该酶对L-多巴、邻苯二酚和焦性没食子酸的K_m值分别为4．30mmol／L、6．82mmol／L和9．64mmol／L。另外，还分别研究了反应时间、底物浓度、酶浓度与反应速率的关系。6．研究EDTA-2Na和金属离子对野桑蚕和桑尺蠖酚氧化酶活力的影响，结果表明Mg~(2+)、Ca~(2+)和Zn~(2+)对野桑蚕酚氧化酶有较强的激活作用，EDTA-2Na和Cu~(2+)能强烈地抑制该酶的活性。而Mg~(2+)、Ca~(2+)对桑尺蠖酚氧化酶有较强的激活作用，EDTA-2Na、Zn~(2+)和Cu~(2+)对该酶有较强的抑制作用。7．研究有机溶剂和多种氧化酶抑制剂对野桑蚕和桑尺蠖酚氧化酶活力的影响，结果表明甲醇、乙醇、丙叁醇、异丙醇和多种氧化酶抑制剂对酶活力均有不同程度的抑制作用，且具有浓度依赖性。8．用槲皮素作抑制剂，研究其对野桑蚕和桑尺蠖酚氧化酶的抑制动力学。结果表明，槲皮素是野桑蚕和桑尺蠖酚氧化酶的竞争性抑制剂，其抑制常数(K_i)分别为44．61μmol／L和20．5μmol／L。9．用硫脲作抑制剂，研究其对野桑蚕和桑尺蠖酚氧化酶的抑制动力学。结果表明，硫脲是野桑蚕和桑尺蠖酚氧化酶的非竞争性抑制剂，其抑制常数(K_i)分别为0．07μmol／L和0．18mmol／L。10．通过RT-PCR技术，克隆了野桑蚕酚氧化酶原基因PPO1和PPO2，序列已在GenBank上登录，登录号分别为EU569724和EU047703，基因的cDNA长度分别为2086bp和2134 bp。其开放阅读框长度分别为2058 bp和2082 bp，分别编码685和693个氨基酸残基。PPO1和PPO2基因序列均具有与家蚕等其它鳞翅目昆虫PPO基因相似的丝氨酸蛋白酶酶切位点、2个高度保守的铜离子结合位点、位于铜离子结合位点内的6个保守的组氨酸残基及5个可能的N连接糖基化位点，无信号肽序列。在线工具预测野桑蚕PPO1和PPO2基因编码蛋白质的等电点和分子量分别为pI／Mw：6．28／78．703KDa和pI／Mw：5．62／80．075KDa。同源序列的多序列比对结果显示野桑蚕和家蚕PPO1和PPO2基因及其编码的氨基酸序列同源性很高，野桑蚕和家蚕PPO1基因只有14个碱基的差异，5个氨基酸的不同；PPO2基因只有21个碱基的差异，3个氨基酸的不同。在家蚕基因组中的BLASTN程序检索，发现两基因在基因组中均只有一个拷贝，cDNA与基因组序列比对，发现PPO1具有13个外显子、12个内含子；PPO2具有11个外显子，10个内含子，且外显子／内含子边界都符合GT-AG规则。系统进化树表明野桑蚕和家蚕的亲缘关系最近，与微生物和哺乳动物等的亲缘关系最远。这进一步说明了家蚕起源于野桑蚕。11．通过对PPO1和PPO2基因在野桑蚕和家蚕中的半定量RT-PCR表达谱差异比较分析表明PPO1和PPO2基因在野桑蚕和家蚕的不同组织及不同发育时期中的表达是有差异的，且基因表达的差异较大。这说明了PPO1和PPO2基因在野桑蚕和家蚕的生命活动中行使着不同的功能。12．本研究合成了野桑蚕PPO2基因部分编码区对应的dsRNA，通过注射上蔟前一天的野桑蚕，到化蛹第6天观察到蛹表皮的发育受到影响(表皮色淡柔软)，RT-PCR检测到了PPO2mRNA的减少，Northem blot未检测到信号，证明在蛹变态期发生了特异的RNAi现象。干涉结果揭示了野桑蚕PPO2基因与蛹表皮的硬化有关。
参考文献：
[1]. 寄生虫感染后蜜蜂血淋巴中血细胞及总蛋白的动态变化研究[D]. 王强. 中国农业科学院. 2004
[2]. 蝶蛹金小蜂和丽蝇蛹集金小蜂毒液的生化特性与生理功能[D]. 张忠. 浙江大学. 2005
[3]. 野桑蚕等酚氧化酶的生化特性、基因克隆、表达及功能研究[D]. 张永亮. 西南大学. 2008
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