邯郸市第一医院056002
[摘要]目的： 观察外周血人单个核细胞中MIF、HMGB1、NF-?B的表达，初步探讨关节松动的机制，为临床防治提供新的思路。方法： 按Ficoll密度梯度分离方法分离静脉血中PBMC，分别用生理盐水（空白对照组）、内固定患者血清（内固定对照组）及关节松动患者血清刺激培养后PBMC，用ELISA和RT-PCR方法检测PBMC中MIF、HMGB1mRNA、NF-?B的表达。应用SPSS13.0软件进行统计学处理数据，P<0.05为差异有统计学意义。MIF的量存在组间明显差异（F=135.633，P=0.000，P<0.05）；NF-?B的量同样也存在组间明显差异（F=436.75，P=0.000，P<0.05）；HMGB1mRNA在不同组别的表达有明显差异（F=11.935，P=0.006，P<0.05）。MIF与NF-?B表达（r=0.613，P<0.05）具有正相关，NF-?B与HMGB1mRNA表达正相关（r=0.437，P<0.05）。结果：MIF、HMGB1、NF-?B在三组表达均存在显著差异，且MIF 与NF-?B的表达、HMGB1与 NF-?B的表达呈正相关。结论：HMGB1通过信号转导通路激活NF-?B的活性，NF-?B可促进单核巨噬细胞合成和分泌MIF，MIF、HMGB1、NF-?B形成细胞炎性因子网络，可能参与关节松动的发生和发展。
关键词：人单核细胞 免疫炎性反应 MIF HMGB1 NF-?B
【中图分类号】R3921 【文献标识码】A
资料与方法
1.1临床资料 选取2006年-2013年发生关节松动的8例，同期内固定术8例，分别为关节松动组、内固定组、空白对照组。内固定组和正常对照组除外患有感染、内分泌疾患、免疫疾患及服用免疫抑制剂和激素类药物。
1.2方法
1.2.1 标本处理 抽取所有观察对象清晨空腹静脉血10ml，放入肝素抗凝管中（肝素用生理盐水稀释成500u／ml，抗凝人外周血肝素用量约为50单位/1ml血），3000r/min离心10min，取上清液置入-20℃冰箱保存。
1.2.2外周血单核细胞（peripheral blood monocytes,PBMC）的分离与培养 按Ficoll密度梯度离心法分离PBMC(人外周血淋巴细胞分离液为天津市灏洋生物制品科技有限公司生产)，使用前将PBMC数调整为1×107/ml，0.2％台盼兰染色，活细胞数＞95%。
1.2.3 实验分组 将所得PBMC接种于24孔板（细胞数5×106 /孔），放入37℃ 5%CO2培养箱中。实验分为空白对照组（生理盐水）、内固定组（内固定组上清液刺激）、关节松动组（关节松动组上清液刺激）。
1.2.4 MIF检测 收集培养24h后上清液，根据MIF ELISA试剂盒（美国R&D公司）说明书操作检测MIF浓度。
1.2.5 HMGB1mRNA水平检测 常规方法收集培养24h后的PBMC细胞，按照RNA提取试剂盒步骤提取各组样本RNA，测定浓度和纯度，每个样品取2mlRNA反转录合成cDNA，再各取1mlcDNA进行PCR扩增。人HMGB1上游引物：5'-AATACGAAAAGGATATTGCT-3'，下游引物：5'-GCGCTAGAACCAACTTAT-3'，扩增片段长度为226bp,退火温度55℃。b-actin上游引物：5'-CCTGGGCATGGAGTCCTGTG-3'，下游引物：5'-AGGGGCCGGACTCGTCATAC-3'，扩增片段长度为289bp。PCR反应的条件为：94℃4min、94℃30s、53℃30s、72℃30s，35个循环后，72℃延伸7min。取RT-PCR扩增产物5ml在2%琼脂糖凝胶上电泳30 min， UVP成像仪获取图像，用ImageJ1.48U软件分析，用相对灰度值（HMGB1灰度值/b-actin灰度值）表示样本HMGB1mRNA相对表达。
1.2.6 NF-?B检测收集培养24h后上清液，根据NF-?B ELISA试剂盒（北京方程生物经营公司）说明书操作检测NF-?B浓度。
1.2.7统计学方法 应用SPSS13.0软件进行统计学处理，数据以?s表示。数据进行正态性检验及方差齐性检验，组间采用单因素方差分析（one-way ANOVA），P<0.05为差异有统计学意义。
2.结果
外周血PBMC经过不同组别血清的刺激，PBMC分泌MIF的量存在组间明显差异（F=135.633，P=0.000，P<0.05）；NF-?B的量同样也存在组间明显差异（F=436.75，P=0.000，P<0.05）；HMGB1mRNA在不同组别的表达有明显差异（F=11.935，P=0.006，P<0.05）。见表1。MIF与NF-?B表达（r=0.613，P<0.05）具有正相关，NF-?B与HMGB1mRNA表达正相关（r=0.437，P<0.05）。
图1 HMGB1 mRNA的表达
表1不同组别PBMC的MIF、HMGB1、NF-?B的表达
注：a：MIF与NF-?B表达具有正相关性；b：HMGB1mRNA与NF-?B表达具有正相关性
结论
综上所述，MIF、HMGB1、NF-?B这三种细胞因子在关节松动组中的表达均与内固定组表达存在明显差异，提示这三种细胞因子在关节松动发病中起一定的作用；且MIF、HMGB1的表达与NF-?B表达正相关，提示NF-?B通路在关节无菌性松动发病中起作用。HMGB1作为固有免疫应答的启动因子，在关节松动的发病中起关键性作用，可以作为防治的靶目标。
参考文献
[1]Clohisy D. Cellular mechanisms of osteolusis[J]. J Bone Joint Surg(Am),2003:85-A(suppl):4-6
[2]Stros M. HMGB proteins: Interactions with DNA and chromatin [J]. Biochim Biophya Acta,2010,1799(1-2):101-113.
论文作者:赵丽 何磊 米娜,秦智敏
论文发表刊物:《中国耳鼻咽喉头颈外科》2015年5月第5期供稿
论文发表时间:2015/7/16
标签：关节论文; 差异论文; 引物论文; 细胞论文; 统计学论文; 方法论文; 肝素论文; 《中国耳鼻咽喉头颈外科》2015年5月第5期供稿论文;