一、Transcription and Translation of Dickkopf-1 in Endometrium of Pregnant Mice during the Peri-implantation Period（论文文献综述）
张亮,潘红梅,郭宗义[1]（2021）在《分娩启动前后孕激素调控子宫肌层静息与收缩分子机制研究进展》文中进行了进一步梳理雌性哺乳动物卵巢/胎盘产生的类固醇激素孕酮（P4）在维持妊娠和分娩中起着至关重要的作用。在妊娠期间孕酮（P4）通过阻断促炎症反应途径和抑制肌肉收缩相关蛋白基因（CAP）的表达,在维持子宫肌层静息中起主导作用。该作用主要通过P4与其受体（PR）结合后,在不同促炎性基因（如NF-κB、AP-1）以及CAP基因（如CX43等）启动子上招募共抑制子来实现。其中,还包括上调促炎性转录因子激活抑制剂（IkBa、MKP-1）和诱导CAP基因转录抑制因子（如ZEB1）等途径。当发生早产或胎儿足月时,P4/PR出现功能性阻断,引发PR-A亚型和P4代谢酶的表达增加,炎性转录因子（如NF-κB、AP-1）激活及PR协同激活因子的表达使其和共抑制子急剧减少等一系列分子事件,通过促进子宫肌层向高度协调的收缩单位转化从而引起分娩。本文详细综述了妊娠期间P4/PR通过不同途径维持子宫肌层静息的主要机制,分析了P4/PR功能性阻断引起子宫肌层收缩并最终导致分娩的主要因素。为进一步了解哺乳动物分娩启动的分子机制,更精准控制生产性动物分娩时间提供有益的参考。
李文超[2]（2021）在《梅山猪胚胎附植早期子宫内膜miRNA组分析及2个关键miRNAs功能研究》文中提出梅山猪作为太湖猪的一种,是世界公认产仔数最高的猪种之一。梅山猪的母体效应对于繁殖力的影响巨大,其繁殖力的调控机制与胚胎附植过程中的低胚胎丢失率相关。miRNAs可负向调控许多基因的表达,并在许多生理过程中,包括在胚胎附植的过程中均发挥重要的调控作用,然而miRNAs在猪胚胎附植过程中的作用机制尚不清楚。而猪胚胎附植早期是发生胚胎丢失的重要阶段,因此筛选影响胚胎附植的关键miRNAs对提高产仔数有重要的意义。本课题使用Illumina高通量测序技术,分析梅山猪胚胎预附植期（妊娠第9,12天及空怀第12天:MS9、MS12和MS12K）和胚胎附植早期（妊娠第15天:MS15）的子宫内膜组织中的miRNA组谱,筛选影响胚胎附植的关键miRNAs,通过双荧光素酶基因报告系统、扫描电镜、Western Blot、流式细胞术、转录组测序分析和小鼠子宫角注射等技术研究miRNAs对猪子宫内膜上皮细胞和间质细胞的调控作用,以及对胚胎附植的影响。主要研究结果如下:1.测序分析了MS9、MS12、MS15和MS12K四个阶段的子宫内膜组织中的miRNA组谱,得到了312个已知的miRNAs和211个潜在的新miRNAs。2.在梅山猪四个妊娠阶段的对比,MS12 vs MS9、MS15 vs MS12、MS15 vs MS9和MS12 vs MS12K中分别筛选得到15、22、40和1个差异表达miRNAs（DE miRNA）。妊娠第12天和空怀第12天的子宫内膜组织中筛选得到的差异转录本数量最少。KEGG分析结果显示MS15 vs MS9的差异表达miRNAs显着富集至Wnt信号通路。top 25高表达的miRNAs的靶基因显着富集至凋亡通路、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、mTOR信号通路及Wnt信号通路。此外,ssc-miR-21是在梅山猪四个阶段的表达水平最高的miRNA。3.进行品种间关联分析,在梅山猪和大白猪两品种间同妊娠时间点分别筛选得到40、41、36和38个DE miRNA。梅山猪和大白猪妊娠第12天的DE miRNAs的靶基因富集至p53信号通路和Wnt信号通路。ssc-miR-451、ssc-miR-204、ssc-miR-199a-5p和ssc-miR-199b-5p是妊娠第12天的种间DE miRNAs,同时也属于top 25高表达的miRNAs,是胚胎附植过程中潜在的功能miRNAs。4.在小鼠妊娠的第3天,子宫角注射miR-199a-5p antagomir后会显着降低胚胎附植数,且观察到胞饮突的形成受到影响,说明小鼠子宫内膜的容受性受到损伤,而注射miR-199a-5p agomir不会降低胚胎附植数,且未观察到胞饮突的形成受到影响。超表达miR-199a-5p后,检测到猪子宫内膜上皮细胞和间质细胞中子宫内膜容受性的标志基因β3-integrin、OPN和LIF的上调表达。以上结果表明miR-199a-5p在子宫内膜容受性的建立过程中发挥重要作用。5.通过对转染miR-199a-5p antagomir和NC后子宫内膜上皮细胞转录组测序分析,筛选获得65个上调表达和9个下调表达的差异表达基因。GO富集分析发现发现差异表达基因富集至免疫相关的生物学过程。KEGG富集分析发现显着富集至细胞因子-细胞因子受体互作通路、趋化因子信号通路、IL-17信号通路及MAPK信号通路。以上结果表明干涉miR-199a-5p的表达,会影响子宫内膜上皮细胞的免疫反应状态,进而可能干扰子宫内膜容受性的建立。6.在小鼠妊娠的第3天,子宫角注射miR-451 antagomir和miR-451 agomir后均会显着降低胚胎附植数。超表达ssc-miR-451后,检测到子宫内膜上皮细胞的细胞周期受到阻滞,而子宫内膜上皮细胞和间质细胞的细胞凋亡数显着增加。生物信息学分析发现CUL4B是细胞周期和细胞凋亡过程中的关键基因,体外实验证明ssc-miR-451与CUL4B的靶向关系,并且ssc-miR-451可在转录后水平抑制CUL4B的蛋白表达水平。以上试验结果提示miR-451可通过调节CUL4B的蛋白表达,影响细胞凋亡的平衡,从而影响胚胎附植。综上所述,我们解析了梅山猪胚胎附植早期的miRNA组谱,筛选得到了调控猪胚胎附植的关键miRNAs和信号通路。发现并印证了miR-199a-5p和miR-451均是胚胎附植过程中的关键功能miRNAs。本课题的研究结果为进一步研究miRNAs介导猪胚胎附植过程中的分子调控机制提供新的理论依据,对提高猪产仔数的研究具有重要的理论指导意义。
张涛[3]（2021）在《IFN-τ和生物力激活YAP维持奶牛生殖能力的作用及机制研究》文中指出生育力低和不育是哺乳动物繁殖领域普遍存在的问题。子宫作为生殖系统主要器官和胎儿生长发育的重要场所,其功能紊乱引发的胚胎死亡和病理性损伤是制约母体生殖能力的关键因素。包括奶牛子宫在内的哺乳动物组织器官,均受来自其周围的生化和生物力信号的双重刺激,但目前对子宫功能的研究多集中于类固醇类激素等可溶性化学信号对子宫的调节。既往研究表明,生物力是胚胎发育中形态发生、组织结构定义和组织动态平衡维持的主要驱动力,然而关于生物力调节奶牛子宫生殖能力的研究鲜有报道。本研究从整体水平上,系统的解析子宫内环境中生化信号协同生物力对奶牛早期妊娠的维持和对损伤后修复的驱动及其中机制,拓展了对动物生殖性能的理解,有助于改善奶牛生产实际问题,提高养殖效益。此外,它们介导的子宫无疤痕修复机制也对再生医学领域具有重要的借鉴意义。1.本文对GEO公共数据库中奶牛早期妊娠和未孕子宫内膜RNA-seq数据（GSE107891、GSE107891和GSE46274）进行二次挖掘,通过GO分析发现细胞外基质（ECM）成分、细胞-细胞黏附、细胞-ECM黏附等条目发生了显着改变,预示子宫内生物力发生了改变。采集动情期和妊娠期奶牛子宫样本,利用免疫荧光（IF）技术和蛋白质免疫印迹（WB）验证了这一结果,且发现YAP（Yes-associated protein）的蛋白水平和基因水平在妊娠子宫内膜中均显着高表达。IF与免疫组化（IHC）实验观察YAP亚细胞定位发现,妊娠子宫YAP存在核转移现象,并且在奶牛子宫内膜上皮细胞（b EECs）中最为明显。2.为揭示生物力介导妊娠的分子机制,本研究建立了密度梯度模型和ECM刚度模型。对低密度（<40%）、高密度（>80%）、低ECM刚度（1 k Pa）和高ECM刚度（40 k Pa）培养的b EECs进行核浆蛋白分离,发现低密度和高ECM刚度显着增强YAP表达和亚细胞定位核转移,即诱导了YAP活化。另外,敲低经典Hippo-YAP途径上游调节因子LATS 1/2可明显阻断低密度诱导的YAP活化,但无法阻止高ECM刚度对YAP的激活。结果表明,ECM刚度信号传导独立于Hippo通路,但细胞密度信号的传导依赖于Hippo通路。进一步研究发现,F-actin聚合抑制剂Lat.A可阻断细胞密度和ECM刚度对YAP的激活,这表明生物力转导需要F-actin的参与。IFN-τ是反刍动物特有的妊娠识别信号,本研究推测IFN-τ作为特殊的可溶性化学信号,参与对YAP活性的调节。实验结果证实YAP可依浓度依赖性方式被IFN-τ激活,且不改变其磷酸化水平。结合课题组对IFN-τ刺激b EECs后的mi RNA测序数据和生物信息学软件分析,显示YAP是mi R-16a的靶标。双荧光素酶报告实验证实这一结果。通过体外转染mi R-16a模拟物/抑制剂后可干扰IFN-τ诱导的YAP活化,揭示了b EECs中IFN-τ/mi R-16a/YAP这一化学信号传导机制。3.在体外利用ECM刚度、IFN-τ、si YAP和过表达质粒干扰YAP的表达,可知YAP活化诱导b EECs的增殖、促进EMT进程和早期妊娠期间弱炎性环境的建立。基于以上结果,本研究利用模式动物小鼠,建立正常妊娠、假孕、IFN-τ单独干预模型,基于WB、IF等技术,验证了早期妊娠小鼠宫内生物力和IFN-τ诱导YAP的活化。另外,腹腔注射YAP抑制剂Verteporfin（VP）或宫内注射si YAP均可抑制子宫内膜细胞增殖,降低胚胎数量,进而破坏小鼠早期妊娠的建立。4.子宫损伤后的快速修复是维持奶牛繁殖能力和缩短产犊间隔最为关键的因素。为探索上述生物力在子宫损伤后修复的作用,本研究构建了临床常见的损伤模型,根据修复期的形态学指标、组织病理学评分、分子生物学修复标记等标准,为下一步研究界定两种模型的修复时间。结果显示,在连续3次间隔7d宫腔注射的3×LPS模型中,第18 d为修复起始,20 d修复高峰期,22 d修复基本完成。对应的产后修复时间是0 d,5 d,10 d。为探索生物力是否参与损伤后的修复,本研究对公共RNA-seq数据进行整合（GSE111976和GSE40312）,基因集富集分析（GSEA）显示修复期细胞间和细胞-ECM间粘附,ECM成分调控基因异常变化。IF检测上皮极性指标αPKC和E-cadherin、细胞连接指标ZO-1以及F-actin,并辅以体外子宫全组织培养24 h后的面积变化数据,可知生物力参与子宫内膜修复。进一步研究发现,YAP在修复期呈现活化趋势,并且在VP和si RNA干扰YAP活化后明显延长了子宫修复时间。5.为探索修复期生物力转导机制,本研究分离子宫内膜基质细胞（ESCs）作为体外载体。与以往研究不同,本研究发现Rap1a介导了ECM刚度对YAP活化的调控,并且Rho GAPs家族成员ARHGAP35与Rap1a在接种于1 k Pa水凝胶上的ESCs内相结合。敲低ARHGAP35可破坏因低ECM刚度或Rap1a过表达引起的YAP胞质滞留。进一步研究表明,Rho A参与ARHGAP35介导的生物力传导。在体内和体外两个层面上运用Rho A抑制剂C3,Y27632和F-actin抑制剂Lat.A,Cytochalasin B（Cyto.B）,实验结果揭示一条新的生物力信号转导机制,即Rap1a/ARHGAP35/Rho A/F-actin/YAP,干扰该途径的传导直接延长子宫损伤后的修复时间。结论:子宫内膜细胞中YAP响应生物力和化学信号的传导,通过调控子宫损伤后的修复进程和早期妊娠的建立,参与雌性动物生殖力的维持。
华仁武[4]（2021）在《猪胚胎附植阶段子宫腔液中细胞外囊泡小RNA测序分析及miR-92b-3p功能研究》文中提出胚胎附植的成功与否是影响母猪产仔数高低的关键因素,在子宫腔液中的细胞外囊泡（Extracellular vesicles,EVs）可以通过介导胚胎与母体子宫内膜之间的交流来影响胚胎附植。我们以妊娠第10、13和18天（D10、D13和D18）的子宫腔冲洗液（Uterine flushing fluids,UFs）中的EVs为研究对象,然后提取子宫腔冲洗液中的细胞外囊泡（UFs-EVs）的小RNA进行测序和生物信息学分析。为进一步了解UFsEVs对猪子宫内膜上皮细胞（EEC）和胚胎滋养层细胞（PTr2）的影响,我们将D13的UFs-EVs处理EEC和PTr2细胞后,提取两组细胞的RNA进行转录组测序和分析。最后,我们筛选出在D10、D13和D18的UFs-EVs中差异表达的mi R-92b-3p,并研究了来源于EEC的EVs包裹的mi R-92b-3p（EVs-mi R-92b-3p）对PTr2细胞的功能影响及其调控机制。主要得到以下结果:（1）通过透射电镜观察到在胚胎附植期间的猪子宫内膜组织中包裹多个杯状囊泡类结构的多泡内泌体。通过扫描电镜发现在胚胎附植期的胚胎表面具有直径为100-400 nm球状小囊泡黏附。免疫组织化学试验表明与EVs分泌和摄取相关的蛋白CD9在猪胚胎附植过程的D10、D13和D18的子宫内膜腔上皮细胞中和D18的胎盘滋养层细胞中都有表达。（2）本研究对D10、D13和D18母猪的UFs-EVs进行了分离,并使用蛋白免疫印迹、透射电镜和纳米粒子粒径分析技术鉴定出UFs-EVs为CD63、CD9和HSP70阳性,Calnexin阴性以及粒径为40-160 nm的杯状EVs。然后对这些UFs-EVs中的小RNA表达谱进行了全面的分析。共鉴定出152个已知的micro RNA（mi RNA）、43个新的mi RNA、6248个已知的piwi-interacting RNA（pi RNA）和110个新的pi RNA。RT-q RCR结果表明,在这些小RNA中,ssc-let-7f-5p、ssc-let-7i-5p和ssclet-7g在三个时期差异表达。生物信息学分析表明,D10 vs D13、D13 vs D18和D10vs D18的3个比较组中差异表达的mi RNA参与了与免疫调控、子宫内膜容受性和胚胎发育相关的生物学过程和通路。（3）将UFs-EVs在PKH67标记之后与EEC和PTr2细胞共培养12h和24h。激光共聚焦观察发现荧光标记的UFs-EVs可以被EEC和PTr2细胞摄取。（4）本研究对D13的UFs-EVs处理过的EEC和PTr2细胞进行转录组测序。在UFs-EVs处理EEC和PTr2细胞后,分别有1793和6279个基因的m RNA表达水平发生了显着的改变。通过RT-q PCR检测发现了ID2、ITGA5、CXCL10、CXCL11在两细胞的对比组中都差异表达。生物信息学分析表明EEC和PTr2细胞在处理后差异表达的基因与免疫调控、细胞迁移、细胞黏附以及EVs的分泌和摄取相关。（5）从EEC细胞培养基中分离出EVs,并通过鉴定了蛋白免疫印迹、透射电镜和纳米粒子粒径分析技术鉴定了EEC细胞释放的EVs。我们使用CM-Dil对来源于EEC细胞的EVs进行染色并与PTr2细胞共培养,通过激光共聚焦观察发现荧光标记的EVs可以被PTr2细胞摄取。（6）通过Transwell共培养体系发现FAM标记的mi R-92b-3p转染的猪原代EEC细胞可以通过EVs的形式传送mi R-92b-3p到PTr2细胞中,并且EVs-mi R-92b-3p可以被PTr2细胞摄取使得mi R-92b-3p在PTr2细胞中的表达水平显着上调。EVsmi R-92b-3p和mi R-92b-3p都可以显着促进PTr2细胞的增殖、迁移和黏附。双荧光素酶分析发现mi R-92b-3p可以靶向TSC1和DKK3,且mi R-92b-3p可以抑制TSC1和DKK3的m RNA和蛋白质的表达。功能回复试验表明TSC1和DKK3的3’UTR载体可以回复mi R-92b-3p对PTr2功能的影响。此外,在小鼠子宫内干涉mi R-92b-3p会导致胚胎附植数量的降低。
张宏硕[5]（2021）在《O-GlcNAc修饰介导能量代谢变化对子宫内膜细胞功能及妊娠结局的影响》文中研究表明一.背景及目的O-GlcNAc修饰是在蛋白质的丝氨酸或苏氨酸残基上添加单个O-linked-DNacetylglucosamine的翻译后修饰方式,在真核细胞细胞核、细胞质、线粒体蛋白中广泛存在。O-GlcNAc对蛋白质的修饰作用只受到两种酶的动态调控,糖基转移酶O-GlcNAc transferase（OGT）负责O-GlcNAc的添加,糖苷酶O-GlcNAcase（OGA）负责O-GlcNAc的去除。O-GlcNAc修饰需要己糖胺生物途径（HBP）的终产物UDP-GlcNAc作为供体,O-GlcNAcylation被认为是一个营养传感器和信号整合子,通过响应外界营养和应激压力参与信号转导与细胞代谢状态的调节。O-GlcNAcylation直接或间接的调节糖酵解。尽管细胞摄入的葡萄糖有大约2-5%进入糖酵解的HBP分支途径,但细胞内超过4000种蛋白需经O-GlcNAc修饰来调控关键的细胞过程,如调节信号、转录、线粒体活动、细胞骨架功能、蛋白质降解等,进而调控多种生理过程,O-GlcNAc修饰异常与多种疾病的发生密切相关,但O-GlcNAc修饰在妊娠过程中的作用罕有报道。哺乳动物“胚胎着床”是指胚泡经过与子宫内膜的识别、定位、黏附以及穿过基底膜等一系列行为而植入子宫内膜的过程。成功的胚胎着床是建立持续妊娠的关键事件,需要子宫内膜进行适当分化并进入接受状态。本实验室前期结果表明,人分泌期子宫内膜O-GlcNAcylation增高,有研究表明人类多种妊娠并发症与子宫内膜糖代谢异常有关,而胚胎植入前O-GlcNAcylation是如何协调葡萄糖代谢影响子宫内膜细胞生理变化并为着床准备的在很大程度上仍然未知。Aquaporin-3（AQP3）作为水通道蛋白（AQPs）家族中的一员,在细胞膜上转运水和溶质方面起着重要作用。水通道蛋白根据序列相似性和底物选择性,可分为三类（传统水通道蛋白、水/甘油通道蛋白和超级水通道蛋白）,AQP3属于水/甘油通道蛋白。AQP3在肿瘤转移、信号转导中起着关键作用,但目前对AQPs在生殖系统的作用研究尚处起步阶段。本实验室前期结果表明,人分泌期子宫内膜AQP3高表达,并通过与Ezrin蛋白的相互作用改变细胞骨架影响细胞形态,导致EMT的发生,进而参与子宫内膜的侵袭和迁移。而鉴于AQP3转运甘油的能力,其在子宫内膜细胞增殖过程高表达是否调控子宫内膜甘油代谢进一步调控妊娠母体能量需求我们并不清楚。特异性蛋白1（Sp1）被鉴定为是与SV40启动子结合的转录因子。Sp1不同程度地调控了许多关键因素,并在疾病进程中发挥重要作用,同时,Sp1的功能可以通过多种翻译后修饰调控。本实验室发现Sp1可以特异性的结合到AQP3启动子区域,激活AQP3的转录。已有报道并经预测,Sp1可被O-GlcNAc修饰,并且具有多个潜在O-GlcNAcylation位点。Sp1的O-GlcNAcylation是否参与AQP3的表达调控、具体哪个修饰位点发挥关键作用有待确定。胚胎成功着床子宫内膜接受状态的建立与17β-雌二醇（E2）和孕酮（P4）的动态相互作用密不可分。适当的葡萄糖代谢对于子宫内膜进入接受状态的生理变化至关重要。葡萄糖转运体（GLUTs）负责细胞内对葡萄糖的摄取,是葡萄糖代谢的第一步。有文献报道子宫内膜存在GLUTs。然而,我们仍然不了解这一过程的具体机制。本研究旨在探讨O-GlcNAc修饰对子宫内膜能量代谢及对胚胎着床的影响。我们分析了子宫内膜O-GlcNAc修饰水平;调控O-GlcNAc修饰对糖酵解、HBP途径中GLUT1、关键调节酶表达变化,以及O-GlcNAc修饰对乳酸、甘油、ATP等相关产物的影响;分析了子宫内膜细胞糖酵解途径及能量代谢变化与子宫内膜容受状态和妊娠结局相关性;子宫内膜AQP3及介导的甘油转运是否参与子宫内膜细胞糖酵解来补偿能量需求;Sp1激活AQP3表达与功能发挥是否与其潜在的O-GlcNAc修饰位点相关;容受性子宫内膜中葡萄糖代谢及能量需求中是否受激素调控;逐步揭示O-GlcNAc修饰介导的能量代谢变化对子宫内膜细胞功能及妊娠结局影响的分子机制。二.方法（一）.着床期GLUT1通过HBP诱导的O-GlcNAc修饰升高影响子宫内膜变化和妊娠结局1)免疫组化分析人增生期、分泌期子宫内膜组织O-GlcNAc、GLUT1、GFAT、Glycogen表达情况。2)CCK-8、Transwell检测调控子宫内膜细胞O-GlcNAc修饰对细胞增殖、迁移、侵袭情况。3)体外着床模型检测调控O-GlcNAc修饰对细胞黏附效率的影响。4)孕鼠子宫角注射siOGT下调O-GlcNAc修饰,检测对胚胎植入效率的影响。5)临床自然流产、人工流产子宫内膜组织qPCR检测OGT mRNA表达差异。6)免疫组化检测孕鼠D1-D5子宫内膜GLUT1、GFAT、Glycogen表达情况。（二）.O-GlcNAc修饰通过AQP3介导的糖酵解补偿调控代谢重编程1)用生物能量分析仪（Seahorse）检测细胞外酸化率（ECAR,近似糖酵解）,氧消耗速率（OCR,近似线粒体呼吸）2)用C13标记的葡萄糖LC-MS分析糖酵解、磷酸戊糖途径、己糖胺生物途径、三羧酸循环相关代谢产物变化。3)使用试剂盒检测子宫内膜组织和细胞中甘油、丙酮酸、乳酸、ATP含量。4)转录组测序检测OGT调控的代谢相关基因和途径。5)2-NBDG检测细胞葡萄糖摄入情况。6)免疫组化分析人和小鼠子宫内膜组织着床期甘油激酶GYK表达情况。7)D3孕鼠子宫角注射siAQP3,检测胚胎植入效率。（三）.转录因子Sp1的S491位点O-GlcNAc修饰激活AQP3的表达1)免疫沉淀检测Sp1的O-GlcNAc修饰水平。2)免疫荧光法检测Sp1表达定位。3)将Sp1的潜在O-GlcNAc修饰位点S491、S612、T640、S641、S698、S702)均或分别突变为丙氨酸,构建突变质粒。4)子宫内膜细胞转染突变质粒,通过Western blotting和qPCR检测Sp1、AQP3,验证O-GlcNAc修饰对自身稳定性以及对AQP3转录活性的影响。（四）.孕激素通过GLUT1调控糖代谢促进子宫内膜容受性1)建立去卵巢小鼠模型,通过免疫组化确定孕激素对GLUT1的影响。2)WB检测不同浓度孕激素处理下细胞的GLUT1、G6PD表达情况,3)2-BNDG检测不同浓度孕激素处理下细胞葡萄糖摄入情况。4)试剂盒检测孕激素处理细胞中丙酮酸、乳酸、ATP含量。5)CCK-8、Transwell检测细胞增殖、侵袭情况。6)生物能量分析仪（Seahorse）检测细胞外酸化率（ECAR,近似糖酵解）。7)JAR细胞模拟胚胎体外检测黏附效率。8)子宫角注射siGLUT1,检测胚胎植入效率。三.结果（一）.着床期GLUT1通过HBP诱导的O-GlcNAc修饰升高影响子宫内膜变化和妊娠结局1.O-GlcNAc修饰对细胞功能以及妊娠结局具有重要意义1)人子宫内膜中O-GlcNAc修饰水平在分泌期高于增生期。2)在模拟低、高接受态的HEC-1A、RL95-2细胞中,调控O-GlcNAc修饰水平能够影响细胞的增殖、迁移、侵袭功能。3)在体外调控O-GlcNAc修饰水平,影响JAR细胞对HEC-1A、RL95-2的黏附效率。4)孕鼠体内子宫角注射OGT siRNA显着降低胚胎植入率。5)人类自然流产（胎亡流产）的子宫内膜组织中OGT mRNA表达显着低于人工流产子宫内膜。2.着床期子宫内膜高表达的GLUT1通过HBP增加O-GlcNAc修饰水平1)人子宫内膜样本以及孕鼠模型显示GLUT1在着床窗口期升高。2)人子宫内膜样本以及孕鼠模型显示Glycogen糖原在着床窗口期升高。3)高糖（15mM、25mM）能够增加HEC-1A、RL95-2细胞的O-GlcNAc修饰水平。4)对HBP通路的激活和抑制能够影响O-GlcNAc修饰水平。5)人子宫内膜样本以及孕鼠模型显示HBP关键酶GFAT在着床窗口期升高。（二）.O-GlcNAc修饰通过AQP3介导的糖酵解补偿调控代谢重编程1.O-GlcNAcylation调控糖代谢1)调控子宫内膜细胞O-GlcNAcylation影响糖酵解水平。2)O-GlcNAcylation的下调增加了细胞的OCR（近似有氧呼吸）。3)13C-标记葡萄糖代谢物检测发现,O-GlcNAcylation的升高,普遍增加了糖酵解、PPP和HBP的代谢物,而TCA循环代谢物减少。4)人子宫内膜分泌期ATP,乳酸含量明显高于增生期。2.OGT下调细胞的转录组学分析1)下调OGT的RL95-2细胞中,共鉴定26429个转录本,其中1587个转录本上调,2266个转录本下调。2)GO分析显示,大部分被调控的基因属于核糖体代谢、核苷酸生物合成、能量代谢产物生物合成和蛋白稳定。3)KEGG通路的富集分析发现,被调节的基因多数参与了中心碳代谢通路。4)下调OGT的RL95-2细胞中,测序检测到的SLC2（GLUTs）家族的转录本中,SLC2A1（编码GLUT1）的下调最为显着。5)O-GlcNAcylation通过c-Myc调控GLUT1的表达。6)抑制OGT、OGA可以影响细胞的葡萄糖摄入。7)下调OGT的RL95-2细胞中,测序检测到的AQPs家族的转录本中,只有AQP3的表达降低。3.AQP3为子宫内膜糖代谢提供能量补偿1)对HBP通路的激活和抑制影响O-GlcNAcylation调控AQP3的表达。2)人子宫内膜分泌期甘油含量明显高于增生期。3)调控O-GlcNAcylation能够影响细胞对甘油的摄入。4)含有甘油的培养环境提高了细胞的糖酵解水平。5)人子宫内膜样本以及孕鼠模型显示甘油激酶（GYK）在着床窗口期升高。6)孕鼠体内子宫角注射AQP3 siRNA能够降低胚胎植入率。7)在敲低AQP3的RL95-2细胞中,含有甘油的培养环境也提高了细胞的糖酵解水平8)调节AQP3可以影响细胞中葡萄糖的摄取,也会影响c-Myc和GLUT1的表达。（三）.转录因子Sp1的S491位点O-GlcNAc修饰激活AQP3的表达1.Sp1的O-GlcNAc修饰促进AQP3表达1)转录因子Sp1特异性调控AQP3的表达。2)OGT、OGA抑制剂Alloxan、PUGNAc影响Sp1的O-GlcNAc修饰水平。3)O-GlcNAc修饰影响Sp1的核内移位。4)通过突变质粒调控Sp1的O-GlcNAc修饰,影响AQP3表达。2.Sp1的S491位点O-GlcNAc修饰影响自身稳定性1)对HBP通路的激活和抑制能够影响AQP3的表达。2)Sp1的O-GlcNAc修饰增加了自身稳定性。3)Sp1在S491位点的O-GlcNAc修饰影响其稳定以及对AQP3的转录活性。（四）.孕激素通过GLUT1调控糖代谢促进子宫内膜容受性1.孕激素（P4）诱导GLUT1表达并影响糖代谢和细胞功能1)着床期子宫内膜GLUT1表达升高。2)去卵巢小鼠模型显示,孕激素诱导GLUT1表达。3)孕激素促进了细胞糖酵解和磷酸戊糖途径。4)孕激素促进细胞的增殖和侵袭能力。2.GLUT1下调抑制糖酵解和胚胎植入1)GLUT1下调抑制细胞葡萄糖的摄入和糖酵解水平。2)GLUT1下调抑制JAR细胞对内膜细胞的黏附。3)小鼠体内子宫角注射GLUT1 siRNA显着降低胚胎植入率。四.结论1.着床期子宫内膜O-GlcNAc糖基化修饰升高增加了糖酵解、PPP和HBP的代谢物,降低TCA循环的代谢物,影响细胞代谢重编程。2.O-GlcNAcylation通过调控GLUT1、AQP3影响子宫内膜糖酵解代谢。3.AQP3通过甘油的转运和增加GLUT1的表达为糖酵解代谢提供补偿。4.Sp1的O-GlcNAcylation影响自身稳定以及对AQP3的转录。5.孕激素通过GLUT1调控糖代谢并影响细胞功能。
杨丽春[6]（2021）在《circRNA211/miR-431/CSF1网络对奶山羊子宫内膜容受性建立的影响》文中进行了进一步梳理哺乳动物的健康胚胎只有在子宫内膜处于容受性状态（容受期）才能成功植入,此时子宫内膜上皮细胞被重塑,以接受胚胎的附植。因此,子宫内膜容受性的建立是胚胎成功植入的重要前提条件。奶山羊情期子宫内膜容受性异常会导致胚胎植入失败,本课题组前期通过高通量测序技术发现circRNA211和miR-431在奶山羊子宫内膜容受期差异表达。而且有文献报道CSF1是子宫内膜容受性的标记基因,但其对奶山羊子宫内膜容受性建立的影响尚未见研究报道。生物信息学分析发现:circRNA211序列中含有miR-431的靶向结合位点;circRNA211的宿主基因FBXO18（F-box protein,helicase,18,F-box蛋白家族18）的CDS区上和CSF1基因（colony stimulating factor 1,巨噬细胞集落刺激因子1）的3’UTR上也有miR-431的靶向结合位点。因此,本试验以奶山羊子宫内膜上皮细胞（GEECs）为研究对象,通过双荧光素酶报告系统、RT-q PCR、Western Blot、CCK-8、Ed U染色和流式细胞术等技术,探究circRNA211/miR-431/CSF1网络对奶山羊子宫内膜上皮细胞的调控机制以及容受性建立的影响。本试验主要结果如下:1.miR-431抑制小鼠子宫内膜容受性的建立与右侧对照组相比,小鼠左侧子宫角注射miR-431 agomir后的子宫内膜组织厚度明显变薄,子宫内膜表面胞饮突的数量减少;子宫内膜容受性标志基因VEGF（vascular endothelial growth factor,血管内皮生长因子）和OPN（osteopontin,骨桥蛋白）显着下调（P<0.01）;MUC1（mucin antigen 1,黏蛋白1）显着上调（P<0.01）。此外,胚胎附植试验发现miR-431明显抑制小鼠胚胎的植入。因此,小鼠体内试验表明miR-431可以通过阻碍子宫内膜容受性建立来抑制胚胎植入。2.在奶山羊子宫内膜上皮细胞中存在circRNA211/miR-431/CSF1调控网络双荧光素酶活性试验发现,circRNA211靶向吸附miR-431;而miR-431能与CSF1和FBXO18靶向结合（P<0.01）。RT-q PCR试验结果表明,过表达FBXO18显着增强circRNA211的表达（P<0.01）,干扰circRNA211的表达后,FBXO18的表达没有影响。此外,miR-431过表达和circRNA211干扰均显着降低了CSF1的m RNA和蛋白水平（P<0.05）;而过表达circRNA211和FBXO18显着上调CSF1的m RNA和蛋白水平（P<0.05）。总之,FBXO18促进了circRNA211的表达,而circRNA211抑制miR-431,且miR-431靶向下调CSF1和FBXO18。3.circRNA211/miR-431/CSF1网络促进GEECs的增殖CCK-8和Ed U染色结果发现,过表达FBXO18、circRNA211和CSF1显着促进GEECs的增殖,而共转染miR-431则在一定程度上减弱了这种增殖作用（P<0.01）。相反,过表达miR-431或干扰CSF1/circRNA211后显着抑制了细胞的增殖（P<0.01）。同时,流式细胞术和Western Blot结果均表明,过表达CSF1、circRNA211和FBXO18明显抑制GEECs的凋亡,而miR-431或干扰circRNA211后却明显促进GEECs的凋亡作用。综上所述,FBXO18正向调控circRNA211,而circRNA211作为ce RNA吸附miR-431,从而减弱miR-431对靶基因CSF1和FBXO18的负调控作用。本研究结果揭示了circRNA211/miR-431/CSF1调控网络及其对奶山羊子宫内膜上皮细胞的影响,并且小鼠活体试验发现,miR-431抑制小鼠子宫内膜容受性的形成。本研究为深入探究奶山羊子宫容受性的调控机理提供了试验依据,为提高奶山羊繁殖率提供理论基础。
梁晶婕[7]（2021）在《小鼠胚胎着床相关microRNA的筛选及miR-192-5p调控子宫内膜容受性的机制》文中研究指明早期胚胎流失是导致哺乳动物妊娠失败的主要原因之一。研究表明,绝大多数胚胎流失发生在胚胎着床阶段,这一现象普遍存在于高产奶牛、母猪等家畜,严重影响了动物的繁殖效率。辅助生殖技术的诞生使得体外授精和胚胎移植成为可能,但移植后着床率低下的问题依然没有得到显着改善。因此明确胚胎着床的调控机制对于提升哺乳动物的妊娠效率至关重要。影响胚胎着床的因素主要包括胚胎的活性、子宫内膜容受性的建立及二者之间有效的交流对话。其中,子宫内膜容受性的建立是胚胎着床启动的必要前提,也是调控着床进程的主导因素。子宫内膜容受性是指母体子宫在其生殖周期有限时间段内所达到的一种能够接纳胚胎附着的特殊生理状态。研究表明,尽管物种之间采用的着床方式不同,着床早期阶段子宫内膜容受性的建立机制却具有相似之处。然而,由于子宫内膜中各个组分在容受阶段的作用不同,其背后的分子调控网络也十分复杂,目前对于子宫内膜容受性建立的具体机制尚未明确。MicroRNA（miRNA）是一类短链非编码小RNA分子,因其能在转录后水平同时靶向调控多个基因的表达而广泛参与多种生物学进程。目前已有许多研究表明miRNA参与胚胎着床的调控,但其在子宫内膜容受性建立过程中的作用还不清晰。考虑到物种间胚胎着床早期阶段的相似性,本研究利用模式动物小鼠作为实验对象,采用小RNA测序技术对容受前期、容受期和着床期小鼠子宫内膜中的miRNA表达谱进行分析,随后结合荧光定量PCR检测技术和子宫角注射miRNA agomir或antagomir的方法筛选出差异表达且能够影响着床进程的miRNA确立为目标miRNA。随后对目标miRNA在小鼠妊娠早期的时空表达情况进行检测,并且通过建立不同小鼠模型探究影响其呈现特异表达趋势的因素。最终通过体内体外实验调控miRNA的表达,探究其对子宫内膜容受性的影响及其分子调控机制。本研究所得到的主要实验结果如下:（1）对小鼠不同妊娠时期子宫内膜组织中的miRNA表达谱进行分析,结果显示共有42个miRNA在容受前期（妊娠第1天）、容受期（妊娠第4天）和着床期（妊娠第5天）的表达呈现显着差异（|log2（Foldchange）|≥1.5且FDR<0.05）,对部分差异表达的miRNA进行荧光定量PCR验证和体内miRNA表达量干扰后发现,miR-192-5p在容受期和着床期的小鼠子宫内膜中表达量极显着降低（P<0.001）,瞬时上调着床期间子宫内膜中miR-192-5p的表达水平将导致着床失败,提示其可能参与小鼠胚胎着床的调控。（2）miR-192-5p在小鼠妊娠早期（妊娠第1-7天）呈现出持续下滑的表达趋势,在着床期及之后一直维持低水平表达。原位杂交结果显示miR-192-5p主要表达于子宫内膜腔上皮和腺上皮层,且随着子宫进入容受期,腔上皮中miR-192-5p的表达量显着降低。检测正常妊娠小鼠模型、假孕小鼠模型、延时着床模型、人工诱导蜕膜模型中miR-192-5p的表达发现胚胎因素不是导致其在着床期间子宫内膜中表达下调的主要原因;在未孕小鼠的自然发情周期内,miR-192-5p在发情期表达量升高,在间情期表达量降低,提示其表达水平更倾向于受到子宫内膜自身周期性生理变化的影响。（3）通过构建卵巢摘除小鼠模型,并给予不同规模的激素处理发现,雌激素（β-Estradiol,E2）能够显着诱导子宫内膜上皮层中miR-192-5p的表达上调;而孕酮（Progesterone,P4）在单独作用时具有下调miR-192-5p的趋势但尚未达到显着水平,当与E2共同作用时能够极显着抑制miR-192-5p的表达。采用E2和P4共同处理小鼠以模拟容受期间子宫中的激素环境,结果显示miR-192-5p的表达受到显着抑制,提示着床期间子宫内膜中miR-192-5p表达下调是由E2和P4共同影响所致。（4）体内研究表明,上调容受期间子宫中miR-192-5p的表达致使子宫内膜容受性受损,具体表现为细胞表面微绒毛的数量得以维持、胞饮突的形成减少等;此外,部分表达于上皮层中的容受性标记分子的表达出现异常,提示miR-192-5p主要干扰了容受期间上皮细胞的转化行为。体外实验表明,miR-192-5p在非容受性子宫内膜上皮细胞系（HEC-1-A细胞）中的表达极显着高于容受性子宫内膜上皮细胞系（Ishikawa、RL95-2细胞等）。抑制HEC-1-A细胞中miR-192-5p的功能致使细胞形态变圆、细胞间连接蛋白（E-cadherin、ZO-1等）的表达水平降低、细胞骨架相关结构（如应力纤维、表面微绒毛等）发生重排,最终导致上皮细胞极性减弱。此外,抑制miR-192-5p的表达导致细胞表面抗黏附蛋白Mucin1的表达下调,进而提升了细胞表面接纳胚胎附着的能力。探索miR-192-5p的潜在靶基因结果显示,转录因子抑制因子E盒结合锌指蛋白2（Zinc finger E-box-binding homeobox 2,ZEB2）和细胞骨架相关调控因子Rho GTP酶激活蛋白19（Rho GTPase-activating protein 19,ARHGAP19）是 miR-192-5p 的靶基因。二者的蛋白均在容受状态下的子宫组织和细胞中高表达,且改变子宫组织、子宫内膜上皮细胞系中miR-192-5p的表达水平能够导致二者内源性蛋白出现相应的表达变化。此外,在非容受性细胞中过表达ARHGAP19能够部分重现抑制miR-192-5p后产生的表型现象,包括细胞骨架结构的重排、细胞间E-cadherin表达量降低等。不仅如此,过表达ARHGAP19能够促使细胞间E-cadherin表达分布发生变化,细胞呈现出堆积生长的趋势。这些表型与容受期间子宫内膜上皮细胞中发生的变化相类似,提示该分子的表达上调可能促使非容受性细胞向容受性表型过渡。综上所述,本研究探索了小鼠妊娠早期在胚胎着床阶段子宫内膜中差异表达的miRNA谱,并且针对其中一个miRNA,即miR-192-5p在小鼠胚胎着床时期子宫内膜容受性建立过程中的调控作用展开了深入研究。本研究证实了 miR-192-5p高表达于非容受状态的子宫内膜上皮细胞中,参与维持上皮细胞极性和细胞表面的抗黏附特性。妊娠期间,在雌激素和孕激素的共同作用下,miR-192-5p的表达水平被显着抑制,导致细胞表面抗黏附因子表达下调;此外一些调控细胞形态和细胞骨架相关的靶基因如ZEB2、ARHGAP19等的表达水平得以释放,促使细胞连接蛋白和细胞骨架发生重排,最终导致上皮细胞极性减弱,细胞状态向容受态过渡,使得胚胎着床得以启动。这些研究成果进一步揭示了 miRNA介导下子宫内膜容受性建立的分子机制,为提升哺乳动物的胚胎着床率和妊娠率提供了新的理论参考。此外,miR-192-5p还有望作为一个新的分子标记用于辅助生殖中子宫内膜容受性的评估和诊断。
黄济[8]（2020）在《多组学联合鉴定猪胚胎定向附植相关基因和调控功能分析》文中认为产仔数在养猪生产中是影响养猪效率的重要因素之一,而猪妊娠过程中的胚胎死亡会很大程度影响产仔数。在猪中大部分胚胎死亡都发生在胚胎附植期。子宫腔从空间上分为系膜侧和系膜对侧,系膜侧直接与母体相连接,负责输送氧气、营养物质等给胚胎。在胚胎附植期间,猪胚胎会经历延伸并移动到系膜侧子宫内膜发生定向附植（Ross et al.2009,Kridli et al.2016）,因此猪子宫系膜侧和系膜对侧子宫内膜会分别为定向附植的胚胎做出不同的响应。本研究以胚胎附植期（妊娠12天和15天）梅山母猪为研究对象,首先采集子宫制作切片并进行HE染色观察母胎界面特征,随后采集子宫系膜侧和系膜对侧子宫内膜样品分别进行RNA-seq和mi RNA-seq测序,并鉴定了时空特异表达的m RNA、mi RNA和lnc RNA,通过对三套数据的整合分析,分析影响胚胎定向附植的lnc RNA-mi RNA-m RNA互作调控网络,并进行初步的验证。具体结果如下:1. 猪胚胎附植期胚胎定向附植表型的鉴定通过全切片扫描系统对猪胚胎附植期子宫HE染色结果进行扫描,我们发现在妊娠12天,线状胚胎悬浮于子宫中并向系膜侧子宫移动,但尚未与子宫内膜发生接触。到妊娠15天,子宫内膜相互嵌合将子宫腔闭合,从而将胚胎移动的范围限制在系膜侧子宫,同时进一步延伸的线状胚胎与系膜侧子宫内膜腔上皮细胞接触并成功附植。2. 猪胚胎附植期子宫内膜中调控胚胎定向附植相关基因的筛选及功能分析通过对妊娠12天与15天子宫系膜侧和系膜对侧子宫内膜RNA-seq测序数据进行分析,我们在妊娠12天与15天子宫系膜侧子宫内膜中得到1753个时期间差异表达基因,在妊娠12天与15天子宫系膜对侧子宫内膜中得到1535个时期间差异表达基因。同时,我们在妊娠12天子宫系膜侧与系膜对侧子宫内膜间得到5个差异表达基因,在妊娠15天子宫系膜侧与系膜对侧子宫内膜间得到240个差异表达基因。这些结果说明在猪妊娠12天与15天子宫内膜中,除了大量时期特异表达的基因以外,系膜侧和系膜对侧子宫内膜间还存在大量部位特异表达的基因参与调控胚胎定向附植的过程。并且在妊娠15天子宫系膜侧与系膜对侧子宫内膜间差异表达的基因中,趋化因子及其受体（CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL14、CXCR3、CXCR4、CXCR7）、整合素及其相关基因（ITGB2、ITGAL、ITGAM、ICAM1）、选择素及其配体（SELL、SELE、SELP、CD34）等与免疫细胞募集相关的基因都在妊娠15天子宫系膜侧子宫内膜上调表达。这些妊娠15天部位间差异表达的基因可能通过定向募集免疫细胞等方式调控胚胎定向附植。3. 猪胚胎附植期子宫内膜中调控胚胎定向附植相关基因的mi RNA筛选及功能分析通过对妊娠12天与15天子宫系膜侧和系膜对侧子宫内膜的mi RNA-seq数据进行分析,我们在妊娠12天与15天子宫系膜侧子宫内膜中得到45个时期间差异表达mi RNA,在妊娠12天与15天子宫系膜对侧子宫内膜中得到41个时期间差异表达mi RNA。同时,我们发现妊娠12天子宫系膜侧与系膜对侧子宫内膜间没有差异表达mi RNA,在妊娠15天子宫系膜侧与系膜对侧子宫内膜间得到17个差异表达mi RNA。通过整合RNA-seq和mi RNA-seq的数据,我们发现在妊娠12天与15天子宫内膜间差异表达且具有反向表达模式的ALCAM-mi R-142-3p与STMN1-mi R-101具有潜在调控关系,在妊娠15天子宫系膜侧与系膜对侧子宫内膜间差异表达且具有反向表达模式的CXCL11-mi R-9、CXCR4-mi R-9、ITGB8-mi R-142-3p具有潜在调控关系,并使用双荧光素报告酶系统进行了验证。这些结果说明在猪妊娠12天与15天子宫系膜侧和系膜对侧子宫内膜中,mi RNA也存在与基因类似的时空特异表达模式,并可能通过调控其靶基因参与调控胚胎定向附植的过程。4. 猪胚胎附植期子宫内膜中调控胚胎定向附植相关基因的lnc RNA筛选及功能分析通过对妊娠12天与15天子宫系膜侧和系膜对侧子宫内膜链特异性建库的RNA-seq数据中的lnc RNA进行鉴定与分析,我们在妊娠12天与15天子宫系膜侧子宫内膜中得到193个时期间差异表达lnc RNA,在妊娠12天与15天子宫系膜对侧子宫内膜中得到210个时期间差异表达lnc RNA。同时,我们在妊娠12天子宫系膜侧和系膜对侧子宫内膜间得到14个差异表达lnc RNA,在妊娠15天子宫系膜侧和系膜对侧子宫内膜间得到49个差异表达lnc RNA。通过对m RNA与lnc RNA共表达模式进行分析,并结合lnc RNA与m RNA的位置关系,同时考虑mi RNA与靶基因的反向表达模式,我们得到了mi RNA-m RNA-lnc RNA在妊娠12天与15天子宫系膜侧和系膜对侧子宫内膜中的调控互作网络。此外,通过预测可能作为ce RNA的lnc RNA,我们发现GTF2H1-AS、CNOT2-AS和TCNOS＿00080623与mi R-9在妊娠15天系膜侧与系膜对侧子宫内膜间具有反向表达模式且它们的序列中都存在mi R-9的潜在结合位点,随后我们使用双荧光素报告酶系统对这种ce RNA的调控关系进行了验证。这些结果说明在猪妊娠12天和15天子宫内膜中,lnc RNA也存在与基因类似的时空特异表达模式,并可能通过与基因的互作或内源性竞争结合mi RNA来调控与胚胎定向附植相关基因来影响胚胎定向附植的过程。5. 猪胚胎附植期调控猪胚胎定向附植相关候选通路的筛选通过整合lnc RNA-mi RNA-m RNA的数据,我们推测在妊娠15天子宫系膜侧子宫内膜高表达的GTF2H1-AS、CNOT2-AS和TCNOS＿00080623可以作为ce RNA竞争性结合在妊娠15天子宫系膜对侧子宫内膜高表达的mi R-9,这会导致mi R-9的靶基因CXCL11和CXCR4在妊娠15天子宫系膜侧子宫内膜高表达,最终在系膜侧子宫内膜形成更高的趋化因子浓度。更多的免疫细胞会募集到拥有更高趋化因子浓度的系膜侧子宫内膜,这最终为系膜侧子宫内膜达到免疫平衡状态来接受胚胎定向附植提供了重要保障。并且,我们还通过免疫组化结果验证了更多的CD3+免疫细胞募集到妊娠15天子宫系膜侧子宫内膜的现象。6. 与猪胚胎定向附植相关基因中SNP位点与母猪繁殖性状的关联分析我们从猪胚胎定向附植相关候选通路中选择了与猪胚胎定向附植相关的6个基因（CXCR4、CXCL11、ALCAM、STMN1、ITGB8、MMP8）,并鉴定了这6个基因中8个SNP位点。通过在丹系大白猪群体中对这些SNP位点进行基因分型并与母猪繁殖性状（总产仔数、产活仔数、有效活仔数、5日龄活仔数、死胎数、木乃伊胎数、妊娠期长和胎间距）进行关联分析,我们发现这6个基因中的8个SNP位点均与母猪繁殖性状显着关联。这些结果说明这些SNP位点在育种实践中可以作为母猪繁殖性状选育的潜在分子标记。
曹丁壬[9]（2020）在《MiR-183-5p对小鼠胚胎着床的影响和机制研究》文中进行了进一步梳理MicroRNA（miRNA）是一种由内源性基因编码的18-24个核苷酸的非编码单链RNA,通过与靶基因3’非翻译区（3’UTR）特异性互补结合抑制翻译,在转录后水平调控靶基因的表达。已有研究表明,miRNA在胚胎着床期的转录后调控中起着重要作用。但哪些miRNA在着床期发挥调控作用尚不清楚,miRNA调控胚胎着床的分子机制尚待解析。本研究以小鼠作为研究对象,利用小RNA测序法挖掘妊娠第一天（D1）、第四天（D4）、第五天胚胎着床点（D5IMS）和第五天非着床点（D5IIS）的小鼠子宫组织差异表达miRNA。对差异表达的miRNA进行功能注释和通路分析,通过构建假孕小鼠模型、激素小鼠模型、延时着床模型和延时着床激活模型,探究影响miR-183-5p表达变化的因素;通过Transwell迁移侵袭试验、划痕愈合试验和细胞凋亡试验研究miR-183-5p的生物学功能。预测miR-183-5p下游靶基因,采用双荧光素酶报告系统对预测的miR-183-5p靶基因进行靶向关系验证。主要研究结果如下:（1）在小鼠妊娠早期D1、D4、D511S和D5IMS子宫组织中共筛选出10个差异表达的miRNA。其中8个为下调miRNA（miR-182-5p、miR-183-5p、miR-375-3p、miR-192-5p、miR-429-3p、miR-210-3p、miR-31-5p、miR-200a-5p）,2 个为上调 miRNA（miR-199b-5p、miR-218-5p）。MiR-183 家族（miR-183-5p、miR-96-5p和miR-182-5p）在小鼠妊娠早期的表达变化趋势一致。与妊娠D1相比,小鼠子宫中miR-183家族成员的表达量在D1-D4逐渐降低（P<0.001）,胚胎着床位点（IMS）的表达量低于非着床位点（IIS）的表达量。（2）MiR-183-5p在妊娠早期的变化主要是母体子宫自身妊娠调节的结果。无胚胎时,假孕个体子宫组织中miR-183-5p的表达水平显着降低（P<0.01）,但降低程度小于正常妊娠小鼠子宫组织在妊娠D4的降低程度（P<0.001）。活性胚胎的存在能够进一步降低miR-183-5p的表达量。激素模型结果显示,孕激素（P4）能够降低miR-183-5p的表达量（P<0.05）。胚胎着床前（D1-D4）,miR-183的表达位置逐渐由上皮细胞转移到基质细胞。胚胎着床后（D5）,胚胎着床位点的miR-183-5p主要在浅层基质细胞中表达,非着床位点的miR-183-5p主要在腔上皮细胞和腺上皮细胞中表达。提高子宫内miR-183-5p的表达水平后胚胎着床位点基本消失,小鼠子宫接受胚胎着床的容受能力降低。过表达miR-183-5p抑制胚胎的着床可能与其降低细胞的迁移侵袭能力和细胞活性有关。（3）Hbegf、Lamc1、Zeb1、Zeb2 和 Arid5b 是预测的 miR-183-5p 靶基因,在小鼠妊娠早期五个预测靶基因的mRNA表达量变化与miR-183-5p的表达量变化趋势相反。Hbegf和Lamc1为miR-183-5p的下游靶基因。过表达miR-183-5p提高了 Zeb1和Zeb2蛋白的表达量。综上所述,miR-183-5p在胚胎着床过程中抑制胚胎着床。在妊娠早期,小鼠子宫中miR-183-5p的表达量会在母体自身、胚胎、激素等条件下逐渐降低,初步表明miR-183-5p可能抑制胚胎着床。通过对miR-183-5p的功能和下游靶基因分析证实Hbegf和Lamc1是其下游靶基因,进一步说明miR-183-5p通过降低子宫与胚胎的相互识别和粘附能力,抑制了胚胎的着床。本研究揭示了小鼠妊娠早期子宫组织miRNA的变化规律,并初步阐明了 miR-183-5p在胚胎着床中的影响与作用机制,为提高胚胎着床效率提供新的靶点和研究策略。
谭强[10]（2020）在《妊娠早期子宫内膜来源外泌体miRNAs对胚胎着床的影响》文中进行了进一步梳理胚胎着床是在有限的时间内发生的复杂过程,是哺乳动物建立妊娠的重要步骤。成功的胚胎着床需要在着床窗口期母体子宫与胚泡之间的同步交流。研究显示,无论是人还是家畜,大多数的妊娠失败发生在着床早期。胚胎植入错误也会导致许多不良后果,例如自然流产和其他妊娠疾病。因此,了解胚胎植入过程母胎交流机制对于妊娠成功至关重要。外泌体是细胞分泌的包含特异性蛋白和核酸等分子的直径40～200nm的细胞外囊泡,能够介导细胞间通讯。同时外泌体及其内容物也是反映机体生理病理状态的标志分子。虽然有很多研究提出外泌体在生殖或其他生物学过程中介导细胞间通讯起着至关重要的作用,但是它们在胚胎着床调控中的作用仍然不清楚。本研究利用超速离心法提取了来自容受态（Ishikawa）和非容受态（HEC-1-A）子宫内膜细胞系分泌的外泌体,检测外泌体对HTR8/SVneo滋养层细胞的功能（迁移、侵袭和增殖）以及着床的影响。发现容受态子宫内膜细胞相比于非容受态细胞,分泌更多的外泌体,而且能被滋养层细胞摄取。小鼠子宫角注射实验显示HEC-1-A来源外泌体对胚胎着床具有明显的抑制作用。而容受态子宫内膜细胞来源外泌体激活滋养层细胞FAK和JNK磷酸化,显着促进滋养层细胞的迁移、侵袭以及增殖能力。体外血管生成实验发现,容受态子宫内膜细胞来源外泌体促进血管的生成。之后,通过小RNA高通量测序,筛选容受态和非容受态子宫内膜细胞系来源外泌体中差异表达miRNA。发现miR-100-5p在容受态子宫内膜细胞来源外泌体中富集,而且在着床窗口期子宫内膜中的表达显着上调。细胞转染实验证明miR-100-5p促进滋养层细胞的迁移、增殖和侵袭能力,同时miR-100-5p促进HUVEC的迁移能力和体外血管生成。说明容受态子宫内膜细胞来源外泌体miR-100-5p对胚胎着床具有重要的调控作用。此外,利用小鼠模型,成功分离了着床前期（D2）,着床期（D4）和着床后期（D5）小鼠子宫来源外泌体。与细胞系结果一致,在着床窗口期,子宫内膜外泌体的分泌显着增加。同时利用qRT-PCR方法分析了小鼠子宫来源外泌体miRNA 表达谱,发现 miR-34c-5p、miR-210、miR-369-5p、miR-30b 和 miR-582-5p在着床期显着富集。利用R语言分析了人反复性流产芯片数据集,筛选出于着床显着相关的关键基因GAS1。而miR-34c-5p靶向GAS1调控其表达,且对着床具有重要调控作用。miR-34c-5p在着床期子宫内膜中几乎不表达,但是注意到miR-34c-5p在着床窗口期子宫内膜来源外泌体中显着上调,说明小鼠子宫来源外泌体miR-34c-5p可以作为一种反映母体子宫容受性生理状态的标记分子。上述研究结果证实容受态子宫内膜细胞来源外泌体miR-100-5p促进胚胎的着床。子宫来源的外泌体miR-34c-5p可以作为小鼠胚胎成功着床的生物标记分子。这些研究结果对进一步研究胚胎着床期母胎交流以及调控机制具有重要的科学意义,对解决家畜或女性因胚胎着床失败导致的妊娠率下降具有一定的理论指导意义。
二、Transcription and Translation of Dickkopf-1 in Endometrium of Pregnant Mice during the Peri-implantation Period（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Transcription and Translation of Dickkopf-1 in Endometrium of Pregnant Mice during the Peri-implantation Period（论文提纲范文）
（1）分娩启动前后孕激素调控子宫肌层静息与收缩分子机制研究进展（论文提纲范文）
| 1 雌性动物分娩与子宫肌层炎性反应或母体炎症负担增加有关 |
| 2 P4/PR通过多种途径来保持子宫肌层静息状态 |
| 2.1 P4/PR通过诱导促炎转录因子激活抑制剂(IκBα、MKP-1)的表达来抑制NF-κB和AP-1的活化 |
| 2.2 P4/PR通过募集共抑制因子抑制炎症前转录因子活性和CAP基因表达 |
| 2.3 P4/PR通过诱导上调CAP基因转录阻遏物ZEB1/2和STAT5b的表达维持肌层静止 |
| 2.3.1 ZEB1/2和miRNAs在P4/PR功能性阻断引发分娩过程中发挥重要作用 |
| 2.3.2 信号转导子和转录激活子STAT5b |
| 2.4 P4/PR可能通过诱导Caspase级联反应活化并降解CAP蛋白以维持肌层静息状态 |
| 3 雌性哺乳动物P4/PR功能性阻断引起分娩启动的主要机制 |
| 3.1 子宫肌层细胞通过PR-A丰度的变化及其对PR-B的反式抑制转录活性来降低对P4的反应性 |
| 3.2 通过翻译后修饰调节PR的活性，调控抗炎和CAP基因等转录因子(如NF-κB和AP-1)的表达 |
| 3.3 妊娠晚期子宫肌层PR抗炎活性的转录共抑制子减少 |
| 3.4 P4在子宫肌层和子宫颈中的代谢水平增加导致PR功能下降和分娩 |
| 4 结论与研究展望 |
| 4.1 妊娠期间，P4/PR在维持肌层静止中的关键作用主要是由其抑制炎症途径和抑制CAP基因表达的能力介导 |
| 4.2 妊娠后期各种因素导致PR功能性阻断是子宫肌层从静息状态向活化状态转变的关键信号 |
| 4.3 展望 |
（2）梅山猪胚胎附植早期子宫内膜miRNA组分析及2个关键miRNAs功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略表(Abbreviation) |
| 第一章 前言 |
| 1.研究问题的由来 |
| 2.胚胎附植过程 |
| 3.胚胎附植的主要调控因子 |
| 3.1.细胞生长因子 |
| 3.2.粘附相关因子 |
| 3.3.免疫相关因子 |
| 4.胞饮突:容受性子宫内膜的标志物 |
| 5.胚胎附植相关miRNA |
| 5.1.miRNA的调控机制 |
| 5.2.miRNAs参与介导胚胎附植 |
| 5.3.miR-199与miR-451的研究进展 |
| 6.目的与意义 |
| 第二章 梅山猪胚胎附植早期子宫内膜miRNA文库构建及测序分析 |
| 1.引言 |
| 2.试验材料 |
| 2.1.试验动物 |
| 2.2.主要仪器和设备 |
| 2.3.主要试剂 |
| 2.4.常用试剂配制 |
| 2.5.生物信息学分析 |
| 2.6.生物技术服务 |
| 3.试验方法 |
| 3.1.RNA提取与质检 |
| 3.1.1.RNA提取 |
| 3.1.2.RNA质量检测 |
| 3.2.建立文库及测序 |
| 3.3.测序结果注释 |
| 3.3.1.测序数据过滤 |
| 3.3.2.比对与注释 |
| 3.3.3.miRNA表达量的计算 |
| 3.4.DEmiRNA分析 |
| 3.5.聚类分析 |
| 3.6.功能富集分析 |
| 3.6.1.靶基因预测 |
| 3.6.2.GO功能富集和KEGG通路富集分析 |
| 3.7.实时荧光定量PCR |
| 3.7.1.RNA反转录 |
| 3.7.2.引物设计及退火温度的确定 |
| 3.7.3.实时荧光定量 |
| 4.结果与分析 |
| 4.1.原始数据 |
| 4.2.miRNA特征分析 |
| 4.2.1.长度分布 |
| 4.2.2.sRNA注释分类 |
| 4.3.miRNA靶基因预测 |
| 4.4.miRNAs表达量及高表达miRNAs的功能富集分析 |
| 4.5.聚类分析 |
| 4.5.1.PCA聚类 |
| 4.5.2.热图聚类 |
| 4.6.DEmiRNA分析及功能注释 |
| 4.6.1.梅山猪四个妊娠时期DEmiRNA分析 |
| 4.6.2.品种间DEmiRNA分析 |
| 4.7.测序数据的实时荧光定量PCR验证 |
| 5.讨论 |
| 第三章 miR-199a-5p调控子宫内膜细胞转录组分析及功能研究 |
| 1.引言 |
| 2.试验材料 |
| 2.1.试验动物 |
| 2.1.1.母猪子宫 |
| 2.1.2.SPF小鼠 |
| 2.2.主要仪器和设备 |
| 2.3.主要试剂耗材 |
| 2.4.常用试剂配制 |
| 2.5.数据库与分析软件 |
| 2.6.生物技术服务 |
| 3.试验方法 |
| 3.1.细胞培养 |
| 3.2.细胞转染 |
| 3.3.细胞RNA抽提 |
| 3.4.实时荧光定量检测 |
| 3.5.转录组测序分析 |
| 3.5.1.文库构建 |
| 3.5.2.基因差异表达分析,聚类及功能注释 |
| 3.6.细胞周期测定 |
| 3.7.细胞凋亡测定 |
| 3.8.扫描电镜观察 |
| 3.9.小鼠子宫角注射 |
| 4.结果与分析 |
| 4.1.miR-199a-5p调控EECs转录组分析 |
| 4.2.miR-199a-5p调控EECs和ESCs细胞周期 |
| 4.3.miR-199a-5p调控EECs和ESCs细胞凋亡 |
| 4.4.miR-199a-5p对子宫内膜容受性相关基因的影响 |
| 4.5.miR-199a-5p影响小鼠胚胎附植 |
| 5.讨论 |
| 第四章 miR-451调控子宫内膜细胞功能研究 |
| 1.引言 |
| 2.试验材料 |
| 2.1.试验动物 |
| 2.2.载体、菌株、细胞 |
| 2.3.主要仪器和设备 |
| 2.4.主要试剂耗材 |
| 2.5.常用试剂配制 |
| 2.6.数据库与分析软件 |
| 2.7.生物技术服务 |
| 3.试验方法 |
| 3.1.细胞培养 |
| 3.1.1.猪原代子宫内膜上皮细胞和间质细胞分离与培养 |
| 3.1.2.PTr2细胞培养 |
| 3.2.细胞转染 |
| 3.3.细胞RNA提取 |
| 3.4.实时荧光定量PCR |
| 3.5.Western blotting |
| 3.5.1.蛋白浓度测定 |
| 3.5.2.SDS-PAGE电泳 |
| 3.5.3.转膜 |
| 3.5.4.免疫反应 |
| 3.5.5.化学发光及成像 |
| 3.6.靶基因3’UTR双荧光素酶报告载体的构建 |
| 3.6.1.引物设计 |
| 3.6.2.双荧光素酶报告载体的构建 |
| 3.6.3.突变型双荧光素酶报告载体的构建 |
| 3.7.细胞周期检测 |
| 3.8.细胞凋亡检测 |
| 3.9.小鼠子宫角注射 |
| 4.结果与分析 |
| 4.1.miR-451调控EECs细胞周期 |
| 4.2.miR-451调控EECs和ESCs细胞凋亡 |
| 4.3.miR-451对子宫内膜容受性相关基因的影响 |
| 4.4.miR-451影响小鼠胚胎附植 |
| 4.5.miR-451靶向CUL4B和PSAT1 |
| 5.讨论 |
| 第五章 总结 |
| 1.本研究的主要结论和意义 |
| 2.本研究的特色和创新点 |
| 3.本研究的不足之处与后续研究建议 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（3）IFN-τ和生物力激活YAP维持奶牛生殖能力的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表(ABBREVIATION) |
| 第一章 文献综述 |
| 前言 |
| 1 奶牛妊娠 |
| 2 子宫内膜损伤 |
| 2.1 病理性损伤 |
| 2.1.1 子宫内膜炎 |
| 2.1.2 胎衣不下 |
| 2.2 生理性损伤 |
| 2.2.1 分娩—产后子宫损伤 |
| 2.2.2 子宫复旧延迟 |
| 2.3 其他 |
| 3 子宫微环境中的调控因子 |
| 3.1 .可溶性化学调控因子 |
| 3.1.1 类固醇类激素 |
| 3.1.2 IFN-τ |
| 3.1.3 气体小分子 |
| 3.2 子宫内生物力调控信号 |
| 3.2.1 ECM刚度 |
| 3.2.2 细胞接触与细胞形状 |
| 3.2.3 流体力学 |
| 3.2.4 外部机械力 |
| 4 Hippo信号通路 |
| 4.1 Hippo及其生物学作用 |
| 4.2 调节Hippo信号通路的主要因素 |
| 4.2.1 生物力信号 |
| 4.2.2 化学信号 |
| 5 研究目的及意义 |
| 第二章 YAP活化参与奶牛早期妊娠建立 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要仪器设备 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要溶液配制 |
| 2.1.4 样品采集 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 原代奶牛子宫内膜上皮细胞(bEECs)培养 |
| 2.2.2 体外ECM刚度模型建立 |
| 2.2.3 IF和IHC实验 |
| 2.2.4 总RNA的提取与反转录 |
| 2.2.5 Western blot |
| 2.2.6 细胞培养与细胞转染 |
| 2.2.7 细胞处理 |
| 2.2.8 双荧光素酶报告实验 |
| 2.2.9 细胞增殖实验 |
| 2.2.10 小鼠妊娠模型的建立 |
| 2.2.11 小鼠假孕模型的建立 |
| 2.3 数据统计与分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 YAP在妊娠早期奶牛子宫内膜中活化 |
| 3.2 bEECs间粘附力参与YAP活化的调控 |
| 3.2.1 低bEECs密度诱导YAP活化 |
| 3.2.2 细胞密度对YAP的调控依赖Hippo信号通路 |
| 3.3 ECM刚度调控bEECs中YAP的活化 |
| 3.3.1 高ECM刚度诱导YAP活化 |
| 3.3.2 bEECs中ECM刚度独立于Hippo通路调控YAP活化 |
| 3.3.3 细胞密度及ECM刚度调控YAP依赖于F-actin |
| 3.4 IFN-τ参与bEECs中YAP活性的调控 |
| 3.4.1 IFN-τ诱导YAP活化 |
| 3.4.2 IFN-τ降低靶向YAP的miR-16a表达 |
| 3.4.3 IFN-τ诱导YAP的活化依赖于miR-16a |
| 3.5 bEECs中 YAP活化提供早期妊娠所需环境 |
| 3.5.1 YAP活化参与子宫内膜重构 |
| 3.5.2 YAP活化参与子宫内膜微环境调节 |
| 3.6 小鼠模型验证YAP活化及其对妊娠建立的贡献 |
| 3.6.1 YAP在早期妊娠小鼠子宫内膜细胞中活化 |
| 3.6.2 IFN-τ诱导小鼠子宫内膜YAP的激活 |
| 3.6.3 生物力介导小鼠假孕模型中YAP的活化 |
| 3.6.4 小鼠早期妊娠的建立需要YAP活化 |
| 4 讨论 |
| 第三章 YAP参与子宫损伤的修复 |
| 1 引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要仪器设备 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要溶液配制 |
| 2.1.4 样品采集 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 原代奶牛和小鼠子宫内膜基质细胞(ESCs)培养 |
| 2.2.2 体外ECM刚度模型建立 |
| 2.2.3 IF和IHC实验 |
| 2.2.4 总RNA的提取与反转录 |
| 2.2.5 Western blot和免疫共沉淀(co-IP) |
| 2.2.6 细胞培养与细胞转染 |
| 2.2.7 细胞处理 |
| 2.2.8 小鼠子宫损伤模型的构建 |
| 2.3 数据处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 小鼠子宫损伤模型的构建以及修复期的确定 |
| 3.1.1 小鼠子宫炎症损伤模型的构建 |
| 3.1.2 小鼠子宫炎性损伤模型修复期的确定 |
| 3.1.3 长期炎症损伤模型的建立及修复时间的确定 |
| 3.1.4 小鼠产后损伤模型的建立及修复时间的确定 |
| 3.2 生物力介导子宫损伤后的修复 |
| 3.3 YAP参与子宫损伤后的修复 |
| 3.3.1 YAP在子宫修复期活化 |
| 3.3.2 抑制YAP延长子宫内膜修复时间 |
| 3.4 ESCs经 Rap1a/ARHGAP35/Rho A/F-actin/YAP轴响应生物力信号 |
| 3.4.1 Rap1a介导bESCs中YAP对生物力的响应 |
| 3.4.2 ESCs中ARHGAP35参与Rap1a对YAP活化的调控 |
| 3.4.3 RhoA与F-actin介导Rap1a对YAP的调控 |
| 3.5 阻断生物力传导途径延迟小鼠子宫损伤修复时间 |
| 4 讨论 |
| 第四章 全文总结 |
| 1 本研究主要结论 |
| 2 本研究的不足之处及进一步工作建议 |
| 参考文献 |
| 附录:作者简介 |
| 致谢 |
（4）猪胚胎附植阶段子宫腔液中细胞外囊泡小RNA测序分析及miR-92b-3p功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表(Abbreviation) |
| 1 前言 |
| 1.1 研究问题的由来 |
| 1.2 文献综述 |
| 1.2.1 胚胎附植期间的母胎交流 |
| 1.2.2 细胞外囊泡 |
| 1.2.3 细胞外囊泡中小RNA调控胚胎附植的研究进展 |
| 1.3 研究目的和意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 技术路线 |
| 2.2 试验材料 |
| 2.2.1 猪子宫腔液及子宫内膜组织和胚胎样品 |
| 2.2.2 细胞系、载体和菌株 |
| 2.2.3 主要试剂 |
| 2.2.4 主要溶液的配制 |
| 2.2.5 主要仪器设备 |
| 2.2.6 主要分子生物学软件和数据库 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 细胞外囊泡的提取 |
| 2.3.2 透射电镜 |
| 2.3.3 扫描电镜 |
| 2.3.4 免疫组织化学 |
| 2.3.5 纳米粒子粒径分析技术 |
| 2.3.6 小RNA提取 |
| 2.3.7 小RNA测序 |
| 2.3.8 蛋白的抽提及WesternBlot |
| 2.3.9 来自猪胚胎和子宫内膜的小RNA数据集的分析 |
| 2.3.10 时序性分析 |
| 2.3.11 细胞外囊泡染色后摄取分析 |
| 2.3.12 Clue GO分析 |
| 2.3.13 String分析 |
| 2.3.14 RNA提取 |
| 2.3.15 转录组测序 |
| 2.3.16 细胞转染 |
| 2.3.17 引物设计 |
| 2.3.18 miRNA mimic和miRNA inhibitor合成 |
| 2.3.19 cDNA的合成 |
| 2.3.20 荧光定量PCR |
| 2.3.21 无细胞外囊泡的血清获取 |
| 2.3.22 Transwell共培养体系 |
| 2.3.23 野生双荧光载体的构建 |
| 2.3.24 突变型3’UTR的 PmirGLO双荧光素酶报告载体构建 |
| 2.3.25 双荧光素酶活性的测定 |
| 2.3.26 细胞迁移测定 |
| 2.3.27 细胞增殖测定 |
| 2.3.28 细胞黏附测定 |
| 2.3.29 小鼠子宫角注射 |
| 2.3.30 数据统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 细胞外囊泡在猪胚胎附植期的子宫中的发现 |
| 3.2 细胞外囊泡的鉴定 |
| 3.3 CD9的在子宫内的免疫组织化学检测 |
| 3.4 小RNA测序 |
| 3.4.1 小RNA测序数据质控 |
| 3.4.2 小RNA长度分布和类别 |
| 3.4.3 高表达miRNA的功能预测 |
| 3.4.4 miRNA的聚类分析 |
| 3.4.5 差异表达miRNA的功能预测 |
| 3.4.6 时序性分析 |
| 3.5 细胞外囊泡对EEC和PTr2细胞的转录组调控 |
| 3.5.1 细胞外囊泡的摄取 |
| 3.5.2 转录组测序数据质控 |
| 3.5.3 差异表达基因 |
| 3.5.4 差异表达基因的聚类分析 |
| 3.5.5 差异表达基因功能预测 |
| 3.5.6 差异表达基因的蛋白互作 |
| 3.6 细胞外囊泡包裹的miR-92b-3p对胚胎附植的影响 |
| 3.6.1 子宫内膜上皮细胞源的细胞外囊泡(EECs-EVs)的鉴定 |
| 3.6.2 EECs-EVs的摄取 |
| 3.6.3 miR-92b-3p的表达谱 |
| 3.6.4 EVs-miR-92b-3p的转移 |
| 3.6.5 EEC细胞外囊泡源的miR-92b-3p对PTr2细胞的影响 |
| 3.6.6 miR-92b-3p对PTr2细胞的影响 |
| 3.6.7 mi R-92b-3p的靶基因验证 |
| 3.6.8 PmirGLO-TSC1-3’UTR和pmirGLO-DKK3-3’UTR可以挽救mi R-92b-3p在PTr2 细胞上的效果 |
| 3.6.9 miR-92b-3p对胚胎附植相关基因的调控 |
| 4 讨论 |
| 4.1 猪胚胎附植期子宫腔液中存在细胞外囊泡 |
| 4.2 猪胚胎附植期子宫腔液冲洗液中细胞外囊泡的小RNA分子调控机制的预测 |
| 4.2.1 猪子宫腔液中细胞外囊泡的小RNA表达水平的变化可能与胚胎发育和附着有关 |
| 4.2.2 猪UFs-EVs中高表达的已知miRNAs可能在胚胎附植时期调节囊胚激活、胚胎发育和子宫内膜容受性 |
| 4.2.3 猪UFs-EVs中差异表达的miRNAs在胚胎附植过程中可能对子宫内膜容受性、免疫功能和胚胎发育有影响 |
| 4.2.4 猪子宫腔液中细胞外囊泡中具有piRNA的存在 |
| 4.2.5 猪胚胎附植期UFs-EVs对EEC和PTr2细胞的转录水平调控机制 |
| 4.3 EEC细胞释放的EVs-miR-92b-3p靶向TSC1和DKK3调控PTr2 细胞的功能 |
| 5 小结 |
| 5.1 本研究的主要结论和意义 |
| 5.2 本研究的特色和创新点 |
| 5.3 本研究的不足之处和后续研究建议 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的文章 |
| 致谢 |
（5）O-GlcNAc修饰介导能量代谢变化对子宫内膜细胞功能及妊娠结局的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 着床期GLUT1 通过HBP诱导的O-GlcNAc修饰影响子宫内膜变化和妊娠结局 |
| (一)前言 |
| (二)材料和方法 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| (三)结果 |
| 1.O-GlcNAc 修饰在着床窗口期子宫内膜表达升高,调控O-GlcNAc 修饰影响细胞功能 |
| 2.调控O-GlcNAc修饰影响细胞黏附及着床率 |
| 3.着床窗口期子宫内膜GLUT1 表达升高,激活HBP |
| 4.GLUT1 通过HBP增加O-GlcNAc修饰水平 |
| (四)讨论 |
| (五)结论 |
| 第二部分 O-GlcNAc修饰通过AQP3 介导的糖酵解补偿调控代谢重编程 |
| (一)前言 |
| (二)材料和方法 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| (三)结果 |
| 1.O-GlcNAcylation调控代谢重编程 |
| 2.转录组分析显示O-GlcNAcylation调控GLUT1和AQP3 |
| 3.AQP3 转运甘油调控子宫内膜细胞糖酵解水平 |
| 4.AQP3 影响GLUT1 表达以及植入效率 |
| (四)讨论 |
| (五)结论 |
| 第三部分 转录因子Sp1的S491 位点O-GlcNAc修饰激活AQP3 表达 |
| (一)前言 |
| (二)材料和方法 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| (三)结果 |
| 1.O-GlcNAc修饰促进Sp1 核内移位 |
| 2.Sp1的O-GlcNAc修饰促进AQP3 表达 |
| 3.Sp1的O-GlcNAc修饰影响自身稳定性 |
| 4.Sp1的S491 位点O-GlcNAc修饰影响对AQP3 转录 |
| (四)讨论 |
| (五)结论 |
| 第四部分 孕激素通过GLUT1 调控葡萄糖代谢促进子宫内膜容受性建立 |
| (一)前言 |
| (二)材料和方法 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| (三)结果 |
| 1.孕激素(P4)诱导GLUT1 表达 |
| 2.孕激素(P4)影响葡萄糖代谢和细胞功能 |
| 3.GLUT1 下调抑制糖酵解 |
| 4.GLUT1 缺失抑制胚胎植入 |
| (四)讨论 |
| (五)结论 |
| 参考文献 |
| 综述 O-GlcNAcylation作为营养传感器和信号整合子协调多种细胞代谢途径 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文及参会情况 |
| 致谢 |
（6）circRNA211/miR-431/CSF1网络对奶山羊子宫内膜容受性建立的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 山羊子宫内膜容受性建立的研究进展 |
| 1.1 子宫内膜的研究概况 |
| 1.1.1 子宫内膜上皮细胞的研究现状 |
| 1.1.2 胚胎植入前子宫内膜上皮细胞的生理变化 |
| 1.1.3 子宫容受性形成的研究进展 |
| 1.2 调控子宫内膜容受性的细胞因子 |
| 1.3 circRNAs的研究进展 |
| 1.4 micro RNAs的研究进展 |
| 1.4.1 micro RNAs的研究进展 |
| 1.4.2 micro RNAs在子宫内膜中的研究现状 |
| 1.4.3 miR-431 的研究进展 |
| 1.5 CSF1/CSF1R的研究进展 |
| 1.5.1 CSF1 的研究进展 |
| 1.5.2 CSF1R的研究进展 |
| 1.5.3 CSF1/CSF1R介导的信号通路的研究现状 |
| 1.6 CSF1/CSF1R与子宫内膜发展的研究进展 |
| 1.7 本研究的目的与意义 |
| 第二章 miR-431 通过靶向CSF1 对奶山羊子宫内膜上皮细胞调控作用的研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 试验仪器设备 |
| 2.2.2 试验试剂 |
| 2.2.3 试验动物 |
| 2.2.4 试验方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 miR-431 的转染效率 |
| 2.3.2 miR-431 对奶山羊子宫内膜上皮细胞凋亡的影响 |
| 2.3.3 miR-431 抑制小鼠体内子宫内膜容受性的建立 |
| 2.3.4 miR-431 靶向下调CSF1 的表达 |
| 2.3.5 CSF1 在奶山羊子宫内膜上皮细胞中的转染效率 |
| 2.3.6 CSF1 对奶山羊子宫内膜上皮细胞增殖的影响 |
| 2.3.7 CSF1 对奶山羊子宫内膜上皮细胞凋亡的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 circRNA211 通过吸附miR-431 对奶山羊子宫内膜上皮细胞调控作用的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 试验仪器设备 |
| 3.2.2 试验试剂 |
| 3.2.3 试验动物 |
| 3.2.4 试验方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 circRNA211和FBXO18在GEECs中的转染效率 |
| 3.3.2 circRNA211与FBXO18 表达的相关性分析 |
| 3.3.3 circRNA211 靶向抑制miR-431 |
| 3.3.4 miR-431 靶向抑制FBXO18 |
| 3.3.5 circRNA211和FBXO18对CSF1 表达的影响 |
| 3.3.6 circRNA211 对奶山羊子宫内膜上皮细胞增殖的影响 |
| 3.3.7 FBXO18 对奶山羊子宫内膜上皮细胞增殖的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 进一步研究的问题 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）小鼠胚胎着床相关microRNA的筛选及miR-192-5p调控子宫内膜容受性的机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表(Abbreviations) |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 胚胎着床概述 |
| 1.1.1 不同物种的着床方式 |
| 1.1.2 影响着床的主要因素 |
| 1.1.3 雌激素和孕激素在胚胎着床中的调控作用 |
| 1.2 MicroRNA概述 |
| 1.2.1 microRNA的合成与分泌 |
| 1.2.2 miRNA的作用方式 |
| 1.3 miRNA在胚胎着床中的调控作用 |
| 1.3.1 miRNA参与调控胚胎活性 |
| 1.3.2 miRNA参与调控着床期间子宫内膜生理状态的变化 |
| 1.3.3 miRNA参与着床期间母-胎对话 |
| 1.3.4 循环miRNA和妊娠 |
| 1.4 本研究的目的与内容 |
| 1.4.1 研究的目的与意义 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 1.4.3 技术路线 |
| 第二章 不同胚胎着床时期小鼠子宫内膜差异表达miRNA的筛选及鉴定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 测序结果分析 |
| 2.3.2 荧光定量PCR检验miRNA的表达水平 |
| 2.3.3 miR-192-5p抑制小鼠胚胎着床 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 miR-192-5p在小鼠妊娠早期子宫中的表达及其影响因素 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 小鼠模型有效性鉴定 |
| 3.3.2 miR-192-5p在不同小鼠模型中的表达规律 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 雌激素和孕激素对子宫中miR-192-5p表达的调控 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 小鼠激素模型鉴定 |
| 4.3.2 miR-192-5p在不同激素处理下小鼠子宫中的表达规律 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 miR-192-5p调控容受期间子宫上皮细胞转化的机制 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 瞬时上调miR-192-5p的表达量致使小鼠子宫内膜容受性受损 |
| 5.3.2 miR-192-5p在子宫内膜上皮细胞生理调控中的作用 |
| 5.3.3 miR-192-5p靶基因的筛选及鉴定 |
| 5.3.4 靶基因ARHGAP19调控细胞极性促使子宫内膜上皮细胞向容受态过渡 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 结论、创新点及展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间的研究成果 |
（8）多组学联合鉴定猪胚胎定向附植相关基因和调控功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表(Abbreviations) |
| 1 前言 |
| 1.1 研究问题的由来 |
| 1.2 文献综述 |
| 1.2.1 猪胚胎附植的过程 |
| 1.2.2 胚胎定向附植研究进展 |
| 1.2.3 猪胚胎附植期子宫基因研究进展 |
| 1.2.4 妊娠相关miRNA的研究进展 |
| 1.2.5 妊娠相关lncRNA的研究进展 |
| 1.2.6 多组学整合分析的研究进展 |
| 1.3 本研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 本研究的技术路线 |
| 2.2 试验材料 |
| 2.2.1 试验样品 |
| 2.2.2 大白猪DNA样品 |
| 2.2.3 菌株、质粒 |
| 2.2.4 细胞样品 |
| 2.2.5 用于miRNA功能研究的miRNA模拟物 |
| 2.2.6 主要试剂 |
| 2.2.7 主要试剂的配制 |
| 2.2.8 主要仪器 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 RNA提取 |
| 2.3.2 转录组测序 |
| 2.3.3 转录组分析 |
| 2.3.4 miRNA测序 |
| 2.3.5 miRNA分析 |
| 2.3.6 lncRNA数据分析 |
| 2.3.7 cDNA的反转录 |
| 2.3.8 荧光定量PCR分析 |
| 2.3.9 序列的克隆和载体的构建 |
| 2.3.10 细胞培养、重组质粒的转染和检测 |
| 2.3.11 石蜡组织切片制作 |
| 2.3.12 石蜡切片的苏木素-伊红染色法(HE染色) |
| 2.3.13 石蜡切片的免疫组织化学 |
| 2.3.14 CD3~+细胞计数 |
| 2.3.15 竞争性等位基因特异性PCR |
| 2.3.16 基因型与繁殖性状的关联分析模型 |
| 2.4 主要分子生物学软件和网站 |
| 3 结果 |
| 3.1 猪胚胎附植期子宫胚胎定向附植表型鉴定 |
| 3.2 猪胚胎附植期子宫内膜中调控胚胎定向附植相关基因的筛选及功能分析 |
| 3.2.1 转录组数据的质控和筛选 |
| 3.2.2 猪子宫系膜侧和系膜对侧子宫内膜中时期间差异表达基因的筛选 |
| 3.2.3 猪胚胎附植期子宫系膜侧与系膜对侧子宫内膜中差异表达基因的筛选 |
| 3.2.4 猪胚胎附植期子宫差异基因表达模式的验证 |
| 3.3 猪胚胎附植期子宫内膜中调控胚胎定向附植相关miRNA的筛选及功能分析 |
| 3.3.1 miRNA测序数据的质控和筛选 |
| 3.3.2 猪子宫系膜侧和系膜对侧子宫内膜中时期间差异表达miRNA的筛选及靶基因预测 |
| 3.3.3 猪胚胎附植期子宫系膜侧与系膜对侧子宫内膜中差异表达miRNA的筛选及靶基因预测 |
| 3.3.4 猪胚胎附植期子宫内膜差异miRNA表达模式的验证 |
| 3.3.5 猪胚胎附植期子宫内膜差异表达miRNA结合位点验证 |
| 3.4 猪胚胎附植期子宫中调控胚胎定向附植相关基因的lncRNA筛选及功能分析 |
| 3.4.1 猪妊娠12和15天子宫系膜侧和系膜对侧子宫内膜中lncRNA的筛选 |
| 3.4.2 猪妊娠12和15天子宫系膜侧和系膜对侧子宫内膜中差异表达lncRNA的筛选 |
| 3.4.3 猪妊娠12天与15天子宫系膜侧子宫内膜差异表达mRNA-miRNA-lncRNA互作网络整合分析 |
| 3.4.4 猪妊娠12天与15天子宫系膜对侧子宫内膜差异表达mRNA-miRNA-lncRNA互作网络整合分析 |
| 3.4.5 猪子宫系膜侧与系膜对侧子宫内膜中内源性竞争结合miRNA的lncRNA的预测及验证 |
| 3.4.6 猪妊娠12和15天子宫系膜侧和系膜对侧子宫内膜中差异表达lncRNA的验证 |
| 3.5 猪胚胎附植期调控猪胚胎定向附植相关候选通路的筛选 |
| 3.5.1 猪子宫系膜侧与系膜对侧子宫内膜中CD3+免疫细胞的分布 |
| 3.5.2 猪子宫中调控胚胎定向附植的候选分子互作网络 |
| 3.6 与猪胚胎定向附植相关基因的SNP位点与母猪繁殖性状的关联分析 |
| 3.6.1 猪CXCL11基因SNP位点与母猪繁殖性状的关联分析结果 |
| 3.6.2 猪CXCR4基因SNP位点与母猪繁殖性状的关联分析结果 |
| 3.6.3 猪ALCAM基因SNP位点与母猪繁殖性状的关联分析结果 |
| 3.6.4 猪ITGB8基因SNP位点与母猪繁殖性状的关联分析结果 |
| 3.6.5 猪STMN1基因SNP位点与母猪繁殖性状的关联分析结果 |
| 3.6.6 猪MMP8基因SNP位点与母猪繁殖性状的关联分析结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 全切片扫描技术鉴定猪胚胎附植期子宫胚胎定向附植的表型 |
| 4.2 猪胚胎附植期子宫时空特异表达基因对胚胎定向附植的影响 |
| 4.2.1 猪妊娠12天与15天子宫内膜间差异表达基因对胚胎定向附植的影响 |
| 4.2.2 猪子宫系膜侧与系膜对侧子宫内膜间差异表达基因对胚胎定向附植的影响 |
| 4.3 猪胚胎附植期子宫时空特异表达miRNA对胚胎定向附植相关基因的调控 |
| 4.3.1 猪妊娠12天与15天子宫内膜间差异表达miRNA对胚胎定向附植相关基因的调控 |
| 4.3.2 猪子宫系膜侧与系膜对侧子宫内膜间差异表达miRNA对胚胎定向附植相关基因的调控 |
| 4.4 猪胚胎附植期子宫时空特异表达lncRNA对胚胎定向附植相关基因和miRNA的调控 |
| 4.4.1 猪妊娠12天与15天子宫内膜间差异表达lncRNA对胚胎定向附植相关基因的调控 |
| 4.4.2 猪子宫系膜侧与系膜对侧子宫内膜间差异表达lncRNA对胚胎定向附植相关miRNA的调控 |
| 4.5 猪胚胎定向附植相关基因中SNP位点对母猪繁殖性状的影响 |
| 5 小结 |
| 5.1 本研究的主要结论 |
| 5.2 本研究的特色和创新点 |
| 5.3 下一步的工作建议 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（9）MiR-183-5p对小鼠胚胎着床的影响和机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 胚胎着床的过程 |
| 1.2 MIRNA的概述 |
| 1.3 MIRNA与胚胎着床 |
| 1.4 MIR-183家族简介 |
| 1.4.1 MiR-183家族成员及位置 |
| 1.4.2 MiR-183-5p的上游调控因子 |
| 1.5 MIR-183-5P的功能研究进展 |
| 1.5.1 MiR-183-5p与上皮间质转化 |
| 1.5.2 MiR-183-5p与细胞转移侵袭 |
| 1.5.3 MiR-183-5p与微血管生成 |
| 1.6 本研究的背景与意义 |
| 第二章 小鼠妊娠早期子宫组织差异表达MIRNA的筛选与分析 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 试验动物与细胞系 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.2.3 主要试剂 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 试验设计与流程 |
| 2.3.2 妊娠早期小鼠子宫组织样品的制备 |
| 2.3.3 组织及细胞中miRNA的富集与提取 |
| 2.3.4 MiRNA反转录合成cDNA第一链 |
| 2.3.5 Small RNA测序分析 |
| 2.3.6 MiRNA的相对荧光定量PCR检测 |
| 2.3.7 处于不同发情周期阶段小鼠的鉴别 |
| 2.3.8 MiRNA的生物信息学分析 |
| 2.3.9 细胞PI3K/Akt和Wnt/β-catenin通路抑制试验 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 小鼠妊娠早期不同阶段子宫组织sRNA文库的构建与分析 |
| 2.4.2 小鼠妊娠早期不同阶段miRNA的差异表达分析 |
| 2.4.3 小鼠妊娠早期子宫组织差异表达miRNA的筛选 |
| 2.4.4 小鼠妊娠早期子宫组织差异表达miRNA的KEGG通路分析 |
| 2.4.5 MiR-183家族成员在小鼠妊娠早期子宫组织的表达变化规律 |
| 2.4.6 小鼠妊娠早期子宫组织miR-183家族成员的相对表达验证 |
| 2.4.7 抑制PI3K/Akt和Wnt/β-catenin通路对miR-183家族表达量的影响 |
| 2.4.8 MiR-183-5p在小鼠妊娠D1-D7及不同发情周期阶段的变化规律 |
| 2.4.9 MiR-183-5p的相关生物学功能通路 |
| 2.5 讨论 |
| 2.5.1 妊娠早期差异表达miRNA的分析 |
| 2.5.2 MiR-183家族成员在妊娠早期的表达差异分析 |
| 2.5.3 MiR-183-5p在胚胎着床发育与癌症进程中的作用 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 影响小鼠妊娠早期子宫组织MIR-183-5P表达的因素及其功能研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料 |
| 3.2.1 试验动物与细胞系 |
| 3.2.2 主要仪器 |
| 3.2.3 主要试剂 |
| 3.3 试验方法 |
| 3.3.1 试验设计与流程 |
| 3.3.2 假孕模型小鼠的制备 |
| 3.3.3 激素模型小鼠的制备 |
| 3.3.4 胚胎延时着床与着床激活模型小鼠的制备 |
| 3.3.5 小鼠子宫组织miR-183-5p的原位杂交 |
| 3.3.6 MiRNA序列类似物的人工合成 |
| 3.3.7 小鼠子宫角miR-183-5p agomir体内注射与检测 |
| 3.3.8 子宫内膜细胞系的培养 |
| 3.3.9 细胞转染处理 |
| 3.3.10 CCK-8细胞活力检测 |
| 3.3.11 细胞迁移与侵袭能力检测 |
| 3.3.12 细胞凋亡检测 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 胚胎对小鼠子宫组织miR-183-5p表达变化的影响 |
| 3.4.2 E2和P4对小鼠子宫组织miR-183-5p表达量的影响 |
| 3.4.3 小鼠胚胎活性与子宫组织miR-183-5p表达变化的关系 |
| 3.4.4 MiR-183-5p在妊娠早期(D1-D4)子宫组织中的表达位置变化规律 |
| 3.4.5 MiR-183-5p在胚胎着床后(D5)子宫组织中的表达位置 |
| 3.4.6 小鼠子宫角注射miR-183-5p agomir对胚胎着床的影响 |
| 3.4.7 不同细胞系中miR-183-5p表达量的差异 |
| 3.4.8 MiR-183-5p对细胞活力的影响 |
| 3.4.9 MiR-183-5p对细胞迁移和侵袭能力的影响 |
| 3.4.10 MiR-183-5p对划痕愈合速度的影响 |
| 3.4.11 MiR-183-5p对细胞凋亡的影响 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 小鼠妊娠早期miR-183-5p的变化规律与母体子宫妊娠状态的关系 |
| 3.5.2 MiR-183-5p在不同细胞系中的功能差异分析 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 MIR-183-5P靶基因生物学预测及验证 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料 |
| 4.2.1 试验动物与细胞系 |
| 4.2.2 主要仪器 |
| 4.2.3 主要试剂 |
| 4.3 试验方法 |
| 4.3.1 试验设计与流程 |
| 4.3.2 MiR-183-5p靶基因预测 |
| 4.3.3 HEK 293T细胞系的培养 |
| 4.3.4 小鼠子宫组织全基因组DNA的制备 |
| 4.3.5 组织总RNA的制备与处理 |
| 4.3.6 双荧光素酶报告系统验证miR-183-5p靶基因 |
| 4.3.7 蛋白印迹检测 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 MiR-183-5p的预测靶基因筛选 |
| 4.4.2 目标靶基因mRNA在小鼠妊娠早期的表达量变化规律 |
| 4.4.3 靶基因与miR-183-5p结合位点序列的克隆 |
| 4.4.4 pmirGLO双荧光素酶重组质粒的构建 |
| 4.4.5 MiR-183-5p靶基因双荧光素酶报告系统鉴定 |
| 4.4.6 MiR-183-5p对不同细胞系及子宫组织Hbegf蛋白表达量的影响 |
| 4.4.7 胚胎着床前子宫组织中Hbegf蛋白的表达位置 |
| 4.4.8 MiR-183-5p对Zeb家族蛋白表达量的影响 |
| 4.5 讨论 |
| 4.5.1 MiR-183-5p功能的多样性分析 |
| 4.5.2 MiR-183通过影响EMT调控胚胎着床过程 |
| 4.5.3 MiR-183-5p通过调控Hbegf和Lamc1抑制胚胎着床 |
| 4.6 小结 |
| 第五章 结论、创新点及研究展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 研究展望 |
| 参考文献 |
| 在读期间的科研成果 |
| 致谢 |
（10）妊娠早期子宫内膜来源外泌体miRNAs对胚胎着床的影响（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 外泌体概述 |
| 1.1.1 外泌体的生成与释放机制 |
| 1.1.2 外泌体的分离鉴定 |
| 1.1.3 外泌体介导的细胞间通讯 |
| 1.1.4 外泌体作为诊疗标记物 |
| 1.2 胚胎着床机制 |
| 1.2.1 胚胎着床简介 |
| 1.2.2 miRNA与胚胎着床 |
| 1.3 外泌体对胚胎着床的调控研究进展 |
| 1.4 本研究目的及意义 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 小白鼠实验 |
| 2.1.1 小白鼠饲养与繁殖 |
| 2.1.2 小鼠子宫及子宫内膜样品收集 |
| 2.1.3 妊娠早期小鼠子宫液的收集 |
| 2.1.4 小鼠子宫角注射实验 |
| 2.2 常规生化试剂及其配置方法 |
| 2.3 外泌体分离鉴定相关实验方法 |
| 2.3.1 外泌体的提取 |
| 2.3.2 透射电镜与扫描电镜 |
| 2.3.3 NTA分析(Nanoparticle Tracking Analysis) |
| 2.3.4 外泌体Tracking分析 |
| 2.4 RNA相关实验方法 |
| 2.4.1 总RNA与miRNA的提取 |
| 2.4.2 外泌体miRNA的提取 |
| 2.4.3 逆转录实验 |
| 2.4.4 实时荧光定量PCR |
| 2.4.5 外体miRNA测序及生物信息学分析 |
| 2.4.6 miRNA mimics转染实验 |
| 2.5 蛋白相关实验方法 |
| 2.5.1 蛋白样品的制备 |
| 2.5.2 蛋白印记法(Western Blot) |
| 2.5.3 蛋白免疫荧光 |
| 2.5.4 蛋白免疫组化 |
| 2.5.5 抗体及其稀释比例 |
| 2.6 细胞动力学相关实验方法 |
| 2.6.1 Trans-well实验 |
| 2.6.2 细胞迁移与侵袭 |
| 2.6.3 细胞增殖 |
| 2.7 体外血管生成实验 |
| 2.8 生物信息学相关分析方法 |
| 第3章 子宫内膜细胞来源外泌体对胚胎着床的调控 |
| 3.1 子宫内膜细胞来源外泌体的提取鉴定 |
| 3.1.1 容受性与非容受性子宫内膜细胞系鉴定 |
| 3.1.2 子宫内膜细胞来源外泌体的提取与鉴定 |
| 3.2 子宫内膜细胞来源外泌体对胚胎着床的影响 |
| 3.2.1 外泌体影响胚胎着床数 |
| 3.2.2 外泌体对滋养层细胞迁移能力的影响 |
| 3.2.3 外泌体对滋养层细胞侵袭和增殖的影响 |
| 3.3 外泌体miRNAs介导胚胎的着床 |
| 3.3.1 子宫内膜细胞来源外泌体差异表达miRNAs鉴定 |
| 3.3.2 MiR-100-5p对胚胎着床数的影响 |
| 3.3.3 MiR-100-5p影响滋养层细胞的功能 |
| 3.4 外泌体miRNAs对胚胎着床过程血管生成的作用 |
| 3.4.1 外泌体miR-100-5p促进血管内皮细胞的迁移和增殖 |
| 3.4.2 外泌体miR-100-5p促进HUVECs体外成管 |
| 3.5 讨论与小结 |
| 3.5.1 讨论 |
| 3.5.2 小结 |
| 第4章 基于外泌体miRNA的子宫容受状态标记分子 |
| 4.1 妊娠早期子宫来源外泌体鉴定及miRNA表达谱分析 |
| 4.1.1 妊娠早期阶段小鼠子宫内膜分泌外泌体 |
| 4.1.2 妊娠早期小鼠子宫来源外泌体的分离鉴定 |
| 4.1.3 妊娠早期小鼠子宫来源外泌体miRNA表达谱分析 |
| 4.2 胚胎成功着床分子标记筛选 |
| 4.2.1 反复性附植失败相关基因鉴定 |
| 4.2.2 外泌体miR-34c-5p是胚胎成功附植的分子标记 |
| 4.3 讨论与小结 |
| 4.3.1 讨论 |
| 4.3.2 小结 |
| 第5章 创新点及研究展望 |
| 参考文献 |
| 附表 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
四、Transcription and Translation of Dickkopf-1 in Endometrium of Pregnant Mice during the Peri-implantation Period（论文参考文献）
- [1]分娩启动前后孕激素调控子宫肌层静息与收缩分子机制研究进展[J]. 张亮,潘红梅,郭宗义. 南京农业大学学报, 2021(04)
- [2]梅山猪胚胎附植早期子宫内膜miRNA组分析及2个关键miRNAs功能研究[D]. 李文超. 华中农业大学, 2021
- [3]IFN-τ和生物力激活YAP维持奶牛生殖能力的作用及机制研究[D]. 张涛. 华中农业大学, 2021(02)
- [4]猪胚胎附植阶段子宫腔液中细胞外囊泡小RNA测序分析及miR-92b-3p功能研究[D]. 华仁武. 华中农业大学, 2021
- [5]O-GlcNAc修饰介导能量代谢变化对子宫内膜细胞功能及妊娠结局的影响[D]. 张宏硕. 大连医科大学, 2021(01)
- [6]circRNA211/miR-431/CSF1网络对奶山羊子宫内膜容受性建立的影响[D]. 杨丽春. 西北农林科技大学, 2021
- [7]小鼠胚胎着床相关microRNA的筛选及miR-192-5p调控子宫内膜容受性的机制[D]. 梁晶婕. 浙江大学, 2021
- [8]多组学联合鉴定猪胚胎定向附植相关基因和调控功能分析[D]. 黄济. 华中农业大学, 2020
- [9]MiR-183-5p对小鼠胚胎着床的影响和机制研究[D]. 曹丁壬. 浙江大学, 2020(01)
- [10]妊娠早期子宫内膜来源外泌体miRNAs对胚胎着床的影响[D]. 谭强. 浙江大学, 2020(01)