大鼠脑反复缺血致不可逆性学习记忆障碍的研究1)，本文主要内容关键词为：大鼠论文,障碍论文,记忆论文,可逆性论文，此文献不代表本站观点，内容供学术参考，文章仅供参考阅读下载。
大鼠全脑反复缺血后产生不可逆性学习记忆障碍的研究，采用4血管阻断的方法，脑反复缺血再灌流，然后长期饲养。作水迷宫试验和跳台试验，结果显示缺血后出现了显著的、不可逆的学习记忆障碍。同时用放射免疫方法测定了额叶、颞叶、纹状体、丘脑、海马、Meynert氏核中胆碱递质和AVP，发现ACh、ChAT、AVP含量显著下降。下降的时间、幅度一致，变化呈正相关。ACh、ChAT、AVP是与学习、记忆密切相关的神经递质和神经肽。因而推断脑缺血后出现不可逆性学习记忆障碍与多脑区内ACh、ChAT、AVP含量显著下降有关。这对探讨临床上血管性痴呆发病机理进而开发有效的防治药物有重要意义。
关键词 脑缺血，学习，记忆、乙酰胆碱，乙酰胆碱转移酶，精氨酸加压素。
目前脑血管病流行，成为人类三大死亡原因之一，其中缺血性脑血管病(ICVD)更为猖獗，在我国发病率有逐年增高的趋势。全脑缺血再灌流的研究为探讨ICVD发病机理独辟蹊径，因而成为当代神经科学的重大课题之一。1979年Pulsinelli和Brierley[1]用大鼠血管阻断(4VO)，为全脑缺血提供了一个确实可靠、简单易行的动物模型。
脑缺血再灌流促进了对血管性痴呆的深入研究。血管性痴呆的一个主要发病原因是脑反复缺血，导致海马、基底神经节、皮层等结构不可逆性损伤，随之出现痴呆症状[2]，但其机理尚不明了，迄今尚未有人进一步深入研究。
我们用大鼠，采用Pulsinelli等报道的血管阻断的方法并加以改良，模拟临床上血管性痴呆的发病特点，制造动物全脑反复多次、短时间的缺血，然后用水迷宫试验和跳台试验，定量研究其学习、记忆能力，同时用放射免疫方法测定多脑区神经化学改变，旨在探讨缺血引发的智能改变及其机制，这对研究血管性痴呆发病机理、开发新的治疗药物有重要意义。
1 材料和方法
1.1 实验材料
1.1.1 动物 成年、雄性、健康的大鼠，体重250-300g，由长春白求恩医科大学实验动物部提供。
1.1.2 试剂 ACh（乙酰胆碱）、ChAT（胆碱酯酶）放射性核素测定试剂盒由军事医科院提供。AVP（加压素）试剂盒由Sigma公司提供，批号A-4169。孔径0.3μm、直径25mm的混合纤维素微孔滤膜由上海第十制药厂提供。
1.1.3 器材 水迷宫及跳台由中国医科院药物所提供。Kubota-K-R-20000T型低温高速离心机，日本制造。Tri-Carb 460 Packard液闪仪，美国制造。5412型γ－计数器，美国Packard公司制造。
1.2 脑反复缺血再灌流动物模型制备
1.2.1 实验动物分组及处理 把56只大鼠随机分为7组，假手术对照组8只，缺血后即刻处死、生存15天、30天、60天、90天和180天6个实验组，每组8只。
1.2.2 脑反复缺血再灌流模型制作方法 大鼠用0.5% Ketamini Hydrochloridi(0.3ml/100g Wt.I.P.)麻醉。先头顶部切口，暴露第一颈椎横突翼小孔，用直径为0.5mm的电烧针插入每一侧的翼小孔中，烧灼双侧椎动脉，造成永久性闭塞。24小时后，暴露双侧颈总动脉，用微动脉夹可逆性关闭双侧颈总动脉5分钟，缺血3次，每次间隔1小时，然后按设计要求在不同时间处死动物。
1.3 水迷宫试验和跳台试验方法
每日上午9:00-11:00作水迷宫和跳台试验[3]。试验室温度、光线、物品位置恒定。
1.3.1 水迷宫试验 开始作水迷宫试验，首先在水迷宫中充以适量的水，水深22cm，水温22±1℃。置大鼠于起步区，游向终点区，计算3分钟内的错误次数，游全程时间。
1.3.2 跳台试验 实验装置为一10×10×60cm被动条件反射箱。用黑色塑料板分隔成5间，间隔为0.5cm，可以通电。电压强度由一接触式调压器调节剌激电压，在每一间的后角置一高和直径为4.5cm的平台，作为动物回避电击的安全区。训练时，将5只动物同时投入反应箱内，适应3分钟，然后立即通以36V交流电，动物受到电击，其正常反应是跳回平台以躲避伤害性刺激，多数动物可能再次或多次跳到铜栅上，受到电击后又迅速跳回平台，如此训练5分钟，并记录电击次数或叫错误次数，以此做为学习成绩。24小时，48小时后重复试验，此作为记忆保持试验，记录3分钟内的错误次数。同时在跳台试验中观察记录第一次跳下平台的潜伏期。
1.4 ACh放免测定方法[4]
1.4.1 动物脑组织提取液制备 大鼠断头，快速冰冻，取脑，分取左侧额叶、颞叶、海马、丘脑、纹状体、Meynert氏核、脑干，左侧脑区每区分二份，一份用于ChAT测定，一份用ACh测定。右侧脑区用于AVP测定。样品称湿重，迅速投入9.3倍量预冷的0.11MHClO[,4]，用玻璃匀浆器磨成匀浆，在冰浴上放置30分钟，再离心1000rPm2-3分钟，取上清液10μl测定。
1.4.2 反应混合液制备 抗ACh血清用磷酸缓冲液50mmol/L，pH7.4稀释成1:1000。每反应管中含1:1000抗ACh血清500μl，脑组织提取液10μl。
ACh放射比度为1.99Ci/mmol，溶于1.5ml0.001NHCl中，该溶液调节至10μl约4000CPm。每个样品管均设2管，取平均值，每管总体积0.52ml。标准管在稀释的ACh抗血清500μl中分别加入ACh 160,40,10,2,5Pmol/L。总设计管(T)ACh直接滴在微孔滤膜上。非特异管(NSB)加PBS(pH7.4，0.05m)510μl，ACh 10μl。
1.4.3 抗血清Ach(B)和游离ACh的分离和测定 加样后充分混匀，置4℃冰箱中过夜，即可使反应达到平衡，用微空滤膜进行分离，滤膜于使用前日浸泡于pH6.6，0.05m PBS中过夜，在对上述反应液进行抽滤后，随即用缓冲液1.5ml冲洗，抽干。取出膜片，置80℃烘箱烘干后，投入0.5%甲苯PPO闪烁液内，用液闪仪测定其放射性。
1.4.4 脑组织中ACh含量的计算 计算公式如下：
B和B[,0]为各标准管或样品管和零标准管的CPm数，N为无抗ACh血清管读数，X为加入的标准ACh或被测ACh的量(Pmol)。这样所得的X和Y成直线关系，经直线回归处理，可得到一直线公式X=a+bY。对样品测定管的读数也进行上述计算，即可得到各管的Y值，再代入上式，即可求得每管的ACh测定值。
1.5 ChAT活性测定
1.5.1 脑组织提取液的制备 大鼠断头快速冰冻，取脑，称重，投入20倍量的1%Triton X-100冰浴磨成匀浆，并放置30分钟使囊泡膜低渗张裂，加等量0.2N pH7.4PBS匀浆使ChAT溶解，后离心1000rPm，2分钟。上清液（即1/40脑组织提取液）10μl用于ChAT测定。
1.5.2 ChAT活性测定 酶反应在微型塑料管中进行，反应混合液总量为30μl，由0.1M，pH7.4PBS配制，内含acetylcoenzyme A(Ac-CoA)0.27m mol/L、Choline(Ch)0.4mmol/L、physostigmine0.13mmol/L、EDTA0.67mmol，少量BSA，以及脑组织提取液10μl。于37℃温育10分钟后取出，立即置于冰浴，迅速加入0.2mol/L30μl使酶灭活，离心1000rPm，3分钟，取6μl上清液用于ACh测定。为了扣除组织底物对测定的影响，同时做非特异性对照管，即待加入30μl HClO[,4]才加待测样品，离心，取上清液测定，把其测定值从测定管中扣除。ChAT活力以生成ACh Pmol·min[-1]·（mg脑组织）[-1]表示。
1.6 AVP放免测定[5]
1.6.1 动物脑组织提取液的制备 大鼠断头，剖脑，取右侧脑在生理盐水中煮沸3分钟，分取部位，精称重量。加1N冰醋酸于匀浆器中，制成匀浆，再加1N NaOH 0.5ml中和离心3000rPm，30分钟，4℃。取上清液贮存于-20——40℃待测。
1.6.2 AVP测定 加样后混匀，4℃孵育24小时，然后每管加
100μl（约8000CPm），混匀。再4℃孵育24小时后，每管加活性炭300μl，边搅拌边加样，混匀后立即离心3000rPm/min，15分钟，4℃；弃上清，沉淀部分用γ计数器计数。
计算百分率，绘制标准曲线，根据待测样品的B/B[,0]，查出AVP值。药盒的质控指标是：批内CV＜2.5%，批间CV＜5%，回收率为98.6%。
1.7 统计学处理
各组实验数据均取均值(
±SD)，用成对样品t-检验以及方差分析判断差异程度。
2 结果
2.1 水迷宫试验结果
实验组与对照组比较，实验组大鼠在水迷宫中游全程时间明显长于对照组(p＜0.01)，实验组在水迷宫中的错误次数显著多于对照组(p＜0.01)。见表1。
2.2 跳台试验结果
实验组与对照组比较，实验组大鼠在跳台试验中错误次数显著增多(p＜0.01)。实验组潜伏期和对照组相比，显著缩短(p＜0.01)。见表2。
2.3 放免测定结果
ACh、ChAT和AVP测定结果见表3、表4、表5。
3 讨论
脑缺血再灌流是当代神经科学研究的重要课题之一。Pulsinelli和Brierley 4血管阻断(4VO)方法得到国际公认[6]。我们对其改良，反复（3次）小量（5分钟）的脑缺血，这种方法有如下特点[7]：1.高度模拟血管性痴呆的发病特点；2.缺血后生理指标稳定，不影响缺血后结果；3.病理改变充分、明确；4.缺血后神经病学症状轻，中分指数在10分以下，一周内可完全恢复，无肢体运动障碍；5.存活率高。迄今为止，国内外对全脑缺血再灌流的研究大都停留在急性期，很少有人进行长期研究。这种改良的方法，有利于我们进行长期慢性研究。
迷宫是一种经典的实验装置，种类很多，但我们使用的水迷宫与其它迷宫相比有一些优点，它既可以消除电迷宫中动物气味造成的影响，也不象食物迷宫试验那样严格的禁食，因此水迷宫简易、灵敏、准确。本实验中使用的跳台，方法简单易行，指标明确，一次同时观察5只动物，既可以观察对记忆过程的影响。也可以观察对学习的影响，有较高的敏感性。
从水迷宫实验结果中可以看出：脑反复缺血再灌流后生存15天的大鼠在水迷宫中游全程时间和对照组相比较显著延长(p＜0.01)；进入盲端的错误次显著增加(p＜0.01)。在跳台试验中，实验组和对照组比较，实验组错误次数显著增加(p＜0.01)。实验组潜伏期比对照组明显缩短(p＜0.01)。由这些结果可以看出，大鼠反复全脑缺血后生存半个月即出现了显著的学习记忆障碍。缺血后生存30天、60天、90天和180天的大鼠，在水迷宫和跳台中的成绩，实验组和对照组相比仍有显著差异(p＜0.01)。这充分说明，大鼠全脑反复缺血后的这种学习记忆障碍不是一种可逆的、暂时的改变，而是一种不可逆性学习记忆障碍。而且随着生存时间延长，在水迷宫中游全程时间延长，错误次数增加；在跳台试验中错误次数增加，潜伏期缩短。大鼠脑缺血后生存15天即出现学习记忆障碍。生存30天组比15天组下降(p＜0.01)。生存60天组比30天组下降(p＜0.01)。缺血后生存180天和90天组学习记忆成绩比较，基本一致(p＞0.05)。从此可以看出，缺血后动物的学习记忆能力随时间推移显著下降，到60天以后方趋稳定。
额叶皮质、颞叶皮质、纹状体、丘脑、海马、Meynert氏核都是与学习记忆密切有关的脑区[8]。这些脑区能通过神经递质ACh、ChAT和AVP参与学习与记忆[9]。我们采用放免方法研究了这些脑区缺血后不同时期的ACh、ChAT和AVP含量变化。结果显示，缺血即刻各组脑区ACh、ChAT、AVP稍下降，与对照组相比无统计学意义(p＞0.05)。缺血后生存15天、30天、60天、90天、180天5个实验组中6个脑区的ACh、ChAT、AVP含量均明显下降，它们和对照组相比有显著差异(p＜0.01)。缺血后30天6个脑区中ACh、ChAT、AVP含量比缺血后15天组显著下降(p＜0.01)。缺血后60天比缺血30天组显著下降(p＜0.01)。总之，脑反复缺血后生存15天、30天、60天，随生存时间延长，6脑区中ACh、ChAT、AVP含量显著下降。缺血60天后趋向稳定，其与缺血后90天、180天组相比无统计学意义(p＞0.05)。
把水迷宫、跳台试验结果和ACh、ChAT、AVP放免测定结果综合分析，明显发现脑缺血后15天、30天、60天，动物在水迷宫中错误次数逐渐增多，游全程时间逐渐延长，亦即动物在脑缺血后15天出现显著的学习记忆障碍，这种学习记忆障碍与日俱增，至缺血后生存60天这种学习记忆的下降变化方告停止。与此同时6个不同脑区的ACh、ChAT、AVP含量逐渐下降。经统计学处理动物在水迷宫和跳台中的学习成绩变化和6脑区中ACh、ChAT、AVP含量变化成正相关。因此可以推断大鼠脑反复缺血再灌流出现显著的行为学改变与脑内ACh、ChAT、AVP含量降低有密切关系。也即ACh、ChAT、AVP含量下降是动物学习、记忆障碍的重要原因之一。
脑反复缺血，间隔时间长，脑细胞对缺血损伤出现‘耐力’，对再次缺血有‘保护作用’[10]。而间隔1小时的反复脑缺血对脑细胞损伤有累加作用[11]。大鼠遭受3次间隔1小时每次5分钟的反复缺血，会出现严重的病理改变。鼠对缺血有选择易损伤性[12]。大脑皮层、丘脑、海马、纹状体等都是对缺血损伤敏感的区域，其中海马对缺血损伤最为敏感。由于这些脑区遭受缺血损伤，细胞变性、坏死、脱落，胆碱能神经元和投射纤维以及AVP投射纤维破坏，故缺血后随着病理改变日趋明显，ACh、ChAT、AVP含量逐渐下降。2-6个月胆碱递质和AVP的浓度基本处在低水平上。由于胆碱能神经元和AVP肽能神经元受损，脑内学习、记忆的神经生化基础受损，Pepaz环路基础破坏，因而出现学习、记忆障碍。另外脑干区胆碱能神经元和AVP下降不显著，这是因为4血管关闭脑缺血时，脑干由脊前动脉供血，可以使脑干的血流量不受大的影响，病理变化不明显，故脑干中ACh、ChAT、AVP无显著改变。
1)本文于1994年1月27日收到。
ISCHEMIC-INDUCED IRREVERSIBLE DEFICIT OF MEMORY FUNCTION IN WISTAR RATS
Jia Jianmin
(Neurology Department,The First Handan City Hospital,Handan)
Jia Jianping*
(Changchun Bethun Medical University)
Abstract
This paper reported that ischemia-induced irreversible deficit of memory function in Wistar Rats surviving for a long time after global ischemia by 4-vessel occlusion method in the Water Maze Test and Step Down Test .Contents of ACh,ChAT and AVP were declined in the six brain regions i.e.,frontal cortex,temporal cortex,striatum,hippocampus,thalamus and Myenert nucleus,Changes in the memory function and in the contents of transmitters showed no defference in time and extent.It was proved that ACh,ChAT and AVP were neurotransmitters and neuropeptide which are closely associated with learning and memory.It was also suggested that they play and important part in the process of learning and memory.So these results indicated that changes in the contents of ACh,ChAT and AVP in regions produced irreversible deficit of the memory function.This study is important for reseach mechanisms of vascular dementia and in search of efficient drugs.Key words cerebral ischemia,learning,memory,acetylcholine,choline acetyltransferase,arginine vasopressin.