（甘肃省临夏州疾病预防控制中心 甘肃临夏 731100）
【摘要】目的：研究甲3型、乙型流感病毒在MHL混合细胞中的增殖情况。方法：利用LLC、MDCK以及HEP-2混合细胞培养瓶与MDCK单一细胞培养瓶对甲3型以及乙型流感病毒标准毒株进行接种，同时设置对照组。分析甲3型与乙型流感病毒毒株在MDCK细胞瓶以及混合细胞瓶中的单克隆抗体荧光染色情况、细胞病变效应以及血凝滴度。结果：病毒的血凝滴度为1:16，通过1:5稀释的甲3型与乙型流感病毒接种MDCK细胞瓶以及MHL混合细胞瓶在37℃的环境下进行48h的培养之后，感染乙型流感病毒的细胞发生了脱落以及细胞固缩的现象，而感染甲3型病毒的细胞则出现了细胞团聚以及拉网现象。结论：经MDCK、LLC以及HEP-2混合细胞瓶进行分离和培养，能够有效监测甲型流感的暴发趋势，并有助于对其它呼吸道病毒进行有效的分离和鉴定，可为临床诊断以及防治工作提供重要参考。
【关键词】混合细胞培养；MHL；甲3型病毒；乙型流感病毒
【中图分类号】R511 【文献标识码】A 【文章编号】1007-8231（2018）17-0068-02
MrLu、MDCK以及pRhMK细胞都是适合甲、乙型流感病毒增殖的几种常见敏感细胞株，但有报道称，上呼吸道感染的致病病毒在上述细胞中都不能增殖，比如：HEP-2细胞适合呼吸道合胞病毒的生长[1]。故，在对上呼吸道病毒进行培养分离和检测时，要选择最佳的敏感细胞株。若利用混合细胞瓶进行分离和培养，则能对多种上呼吸道病毒进行检测。本文旨在探讨甲3型、乙型流感病毒在MHL混合细胞中的增殖情况，报道如下。
1.材料与方法
1.1 实验材料
选择34代MDCK细胞、410代HEP-2细胞、309代LLC细胞，A/上海/49/78（H3N2），B/北京/6/54是本院保存的毒株。病毒培养液选择2ug/ml的D-MEM母液+TPCK-胰酶，细胞生长液选择10%的D-MEM母液+胎牛血清。抗甲3型流感病毒单克隆抗体（MAB8254），抗乙型流感病毒单克隆抗体（MAB8661），抗IgG荧光标记抗体（AP124F）。
1.2 方法
将MDCK细胞置于T75细胞瓶内，待长成单层细胞之后，再通过EDTA-胰酶进行消化，然后再分装在培养瓶中，每瓶3ml，细胞数在2～5*105/ml的范围之内，置于5%CO2以及37℃的温箱中进行培养，使之长成约80%的细胞单层。
将LLC、MDCK以及HEP-23株细胞分别置于T75细胞瓶中，待长成单层细胞后，通过EDTA-胰酶进行消化，并分别计数LLC、MDCK和HEP-2细胞悬液，然后混合，使之成为细胞悬液，其细胞数为1.5*105/ml，当中，每株细胞的细胞数都为5*104/ml。
期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆对混合细胞悬液进行分装，每瓶3ml，并置于5%CO2和37℃的温箱中进行培养，使之成长为80%的细胞单层。
血凝滴度为1:16，通过1:5病毒培养液进行充分稀释后的甲3型、乙型流感病毒标准毒株各0.3ml，并将之分离接种在混合细胞瓶以及MDCK细胞瓶中，各瓶3ml。取混合细胞与MDCK细胞各5瓶，并将之接种在0.3ml的病毒培养液中，作为阴性对照组。于37℃的条件下，以3500r/min的速度进行离心，60min后，丢弃上清液，并加入2.5ml的病毒培养液，于5%CO2和37℃的温箱中进行培养。
从第2d开始，对混合细胞瓶、病毒感染MDCK细胞瓶以及对照组中的细胞形体进行仔细地观察，待混合细胞瓶、病毒感染MDCK细胞瓶CPE呈++～+++后，将病毒组以及对照组的细胞上清液取出，并做血凝试验。刮下病毒组与对照组细胞，并将之滴在23孔玻片上，每瓶细胞均有2个孔。待自然干燥后，利用冷丙酮-甲醇进行固定，然后再利用PBS盐溶液进行3次清洗。在每个孔中加入相应的单克隆抗体，50ul，于37℃的温盒中进行0.5h的孵育，然后再利用PB盐溶液进行3次清洗。于每孔中加入荧光单克隆抗IgG抗体，50ul，于37℃的温盒中进行孵育，待30min之后再利用盐溶液进行3次清洗。晾干后，加入荧光镜油，并利用荧光显微镜进行仔细地观察。
2.结果
2.1 分析细胞病变效应
对于感染甲3与乙型流感病毒的混合细胞瓶以及MDCK细胞瓶，在第2d时观察发现CPE为（+），在第3d时观察可见甲3型流感病毒感染细胞出现团聚以及拉网现象，且CPE为（++），乙型流感病毒感染细胞出现脱落以及固缩现象，且CPE为（+++），而正常的对照组细胞中则没有CPE。
2.2 分析血凝试验
在第3d时，对病毒感染细胞以及对照组细胞的血凝滴度进行检测，发现：感染甲3型流感病毒的混合细胞瓶以及MDCK细胞瓶的血凝滴度为1:8，而感染乙型流感病毒的混合细胞瓶以及MDCK细胞瓶的血凝滴度则是1:4，对照组细胞瓶为阴性。
2.3 分析单克隆抗体荧光染色
低倍镜下可见感染甲3、乙型流感病毒的混合细胞以及MDCK细胞中有明显的细胞碎片和细胞荧光着色现象，对照组中存在暗淡荧光的完整细胞；经高倍镜观察可见，感染流感病毒的混合细胞以及MDCK细胞周围存在绿色荧光光环，对照组有暗淡的荧光细胞。
3.讨论
在LLC、MDCK以及HEP-2混合细胞瓶中适合分离以及培养多种上呼吸道病毒，比如：腺病毒、甲1流感病毒、副流感病毒1-3型、甲3流感病毒、呼吸道合胞病毒A与B型以及乙型流感病毒等[2,3]。对上呼吸道感染标本进行病毒培养和检测，需根据经验怀疑是某一种病毒感染，并选择一种最适合的细胞株完成分离培养操作，然后再利用单克隆抗体标记技术进行鉴定。但有报道称，上呼吸道病毒感染通常具有相似的临床表现，若利用传统的细胞株进行分离培养和检测，有时候无法得出阳性结果，且其培养所需的时间也比较长[4]。通过利用混合细胞瓶对上呼吸道病毒进行分离培养，同时经荧光标记单克隆抗体技术进行鉴定，能够快速检测病毒，并有助于操作者对阳性荧光细胞进行全面的观察，采用抗不同亚型亦或者是不同病毒的荧光标记单克隆抗体能够对混合细胞瓶内的不同病毒亚型和病毒进行有效的鉴定[5,6]。
总之，利用CCL、MDCK与HEP-2混合细胞瓶对甲3、乙型流感病毒进行分离培养，能够全面监测易感甲型流感病毒群体的感染情况，并有助于对其它上呼吸道病毒进行有效的分离和鉴定。
【参考文献】
[1]姜庆五,居丽雯,甘愉，等.甲3型、乙型流感病毒在MHL混合细胞中增殖的研究[J].中国卫生检验杂志,2003,13(2):150-151.
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[3]李伟,洪镭,徐庆，等.2010—2012 年江苏省乙型流感病毒神经氨酸酶分子进化特征分析[J].中华微生物学和免疫学杂志,2015,35(10):759-764.
[4]张艳燕,赖宇,朱琳，等.上饶市乙型流感病毒耐药基因分析[J].中国感染与化疗杂志,2017,17(5):538-540.
[5]金青青,茅海燕,孙逸，等.乙型流感病毒Victoria系和Yamagata系HA1基因的分子进化研究[J].中华流行病学杂志,2013,34(4):366-370.
论文作者:张婷
论文发表刊物:《心理医生》2018年17期
论文发表时间:2018/7/17
标签：细胞论文; 病毒论文; 流感论文; 荧光论文; 上呼吸道论文; 细胞株论文; 对照组论文; 《心理医生》2018年17期论文;