复旦大学附属中山医院青浦分院肾内科 上海青浦 201700
【摘要】目的 探讨女贞子对糖尿病大鼠肾组织与外周血单个核细胞（PBMC）中核因子-кB（NF-кB）活性的影响。方法 30只雄性SD大鼠分成对照组、糖尿病组和女贞子治疗组；酶联免疫吸附法（ELISA）测定各组大鼠PBMC中NF-кB活性；免疫组化检测各组大鼠肾组织NF-кB和单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）表达。结果 糖尿病大鼠PBMC和肾小球中NF-кB活性显著高于对照组（P<0.01）。与糖尿病大鼠相比，女贞子明显抑制NF-кB活化及MCP-1和纤粘连蛋白（FN）表达（P<0.05），减少24小时尿蛋白排泄，降低血糖、血脂，减轻肾小球肥大、系膜细胞增生和细胞外基质堆积。结论 女贞子对实验性糖尿病大鼠肾组织损害具有明显的保护作用，抑制NF-кB的活化可能是女贞子发挥肾脏保护作用的机制。
【关键词】糖尿病肾病；大鼠；NF-кB；女贞子
[中图分类号] R587.2[文献标识码] A[文章编号]1672-5018（2016）04-187-02
糖尿病肾病（Diabetic Nephropathy，DN）是糖尿病严重微血管并发症之一。近年来，DN已被看成是一种由代谢紊乱诱发的炎性疾病[1]。核因子-кB（NF-кB）信号转导通路是公认的体内介导炎症反应的主要通路，并在糖尿病DN的发生发展中起重要作用。目前女贞子干预糖尿病肾病进展的文献报道极少。本研究旨在观察NF-кB、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）在糖尿病大鼠外周血和肾组织中表达及女贞子对其表达的影响，探讨女贞子对糖尿病大鼠肾脏保护作用及其可能机制。
一、材料与方法
1．动物及分组：雄性SD大鼠30只，体重210-240g，血糖正常。大鼠随机分成3组，分别为C组（正常对照组）；DM组（糖尿病组）；DL组（糖尿病+女贞子治疗组）。
2.糖尿病大鼠模型建立：DM组及DL组采用链脲佐菌素（STZ，Sigma公司）60mg/Kg一次性腹腔注射。72小时后，随机血糖值≥16.5mmol/L确定为模型制备成功。模型建立后，DL组予女贞子（酒制、打粉后水煎30分钟）8g.Kg-1.d-1灌胃，DM组及C组喂予等量饮用水。
3.生化指标测定，雅培2000型自动生化分析仪测定空腹血浆肌酐（Cr）、血糖（FBG）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG），考马斯亮蓝测定24小时尿蛋白。
4.免疫组化和组织病理学观察：大鼠右肾石蜡切片SABC法测定肾小球NF-кB、MCP-1、纤粘连蛋白（FN）表达（武汉博士德公司），分别观察肾小球中NF-кB、MCP-1表达，BioMaix彩色图像分析系统分析肾小球中FN染色阳性的平均光密度；常规HE、PAS染色，光镜观察肾组织形态变化。
5.外周血单个核细胞（PBMC）NF-кB活性测定：Ficoll密度梯度离心法，分离各组大鼠PBMC；按TransAM核蛋白提取试剂盒（美国Activemotif公司）说明操作，提取核蛋白；按TransAM NF-кBp65试剂盒（美国Activemotif公司）方法测定PBMC中NF-кB活性。
6.统计学分析 实验结果以±s表示，组间比较采用t检验。
二 结果
1.各组生化指标及24小时尿蛋白变化 DM组TC、TG、Cr均高于C组（P<0.01），DL组上述指标和DM组相比较有显著性差异（P<0.05）；DM组、DL组血糖值和C组有明显差异（P<0.01），DM组血糖值和DL组有差异（P<0.05）；C组24小时尿蛋白和DM组之间有明显差异（P<0.01），DL组24小时尿蛋白比DM组明显降低（P<0.05）。见表1。
3.肾组织病理学改变 HE染色DM组大鼠肾小球系膜区基质中度增多，系膜细胞轻度增生，小管间质散在单个核细胞浸润，DL组上述病理改变均有不同程度减轻；PAS染色C组未见明显病理改变，DM组细胞外基质明显增多，系膜区扩大，DL组可见细胞外基质增加，但较DM组减少，系膜区扩张较DM组明显减轻。
三、讨论
DN早期基本病理改变包括系膜细胞肥大、细胞外基质堆积及肾小球基底膜增厚，是引起早期DN尿蛋白排泄增加的主要原因。本实验结果显示，糖尿病（DM）大鼠成模后8周，大鼠尿蛋白排泄明显增加，血糖、血胆固醇、甘油三酯及血肌酐水平升高，肾小球肥大，细胞外基质增多，表明已具有早期的DN特征。
核因子-кB（NF-кB）为一种与炎症介质的产生、细胞增生、细胞外基质交联和细胞凋亡有关的转录因子[2]。高血糖、糖基化终末产物（AGEs）等可激活足细胞及系膜细胞中NF-кB，上调单核细胞趋化因子-1（MCP-1）的表达和细胞外基质（ECM）合成[3-4]。抑制NF-кB表达可减轻大鼠糖尿病肾脏损害[5]。本实验结果显示，正常大鼠肾组织中NF-κB、MCP-1有较弱的活化，提示适量的NF-κB活化可能是调节正常肾脏细胞生理功能所必须。与正常大鼠相比较，有肾脏损害的糖尿病大鼠肾小球中NF-κB和MCP-1阳性细胞明显升高，尿蛋白排泄明显增多，纤粘蛋白（FN）表达明显增加，肾小球系膜区基质增多，肾小球和肾小管基底膜增厚，系膜区扩张，小管间质散在灶性单个核细胞浸润区，这与我们既往研究结果一致[6]。由此表明，糖尿病时活化的NF-κB通过上调肾组织MCP-1表达，促进单核巨噬细胞肾组织浸润，导致细胞外基质增加可能是DN发生发展的重要机制之一。
中药女贞子（Fructus ligustri lucidi）为木犀科植物女贞的干燥成熟果实。临床多用于治疗滋补肝肾，明目乌发。女贞子主要活性成分为女贞子甙、齐墩果甙、齐墩果酸等，具有抗氧化、降血糖、降血脂、抑制细胞凋亡、抗炎及免疫调节等作用[7]。高大威[8]等研究表明，齐墩果酸能明显降低四氧嘧啶诱导的糖尿病大鼠血糖及血脂，并可拮抗氧自由基对肝肾细胞的损害。但目前女贞子防治糖尿病肾病未见文献报道。我们的研究结果显示，女贞子治疗糖尿病大鼠8周后，明显减少尿蛋白排泄，降低血脂、血糖及血肌酐水平，减少FN在肾小球的表达。病理资料显示，女贞子治疗可明显减轻肾小球肥大，抑制细胞外基质堆积和系膜细胞增生。这表明女贞子对DN具有明显的治疗作用。同时本研究中也观察到，女贞子治疗可明显抑制DM大鼠PBMC及肾组织中NF-кB活化，减少MCP-1表达
参考文献：
[1].Tuttle KR.Linking metabolism and immunology：diabetic nephropathy is an inflammatory disease.J Am Soc Nephrol，2005，16（6）：1537-1538.
[2].Morrissey J，Kiahr S.Transcription factor NF-kappa B regulation of renal fibrosis during ureteral obstruction [J].Nephrol.1998，18（6）：603-611.
[3].Kumar PA，Welsh GI，Raghu G，et al.Carboxymethyl lysine induces EMT in podocytes through transcription factor ZEB2：Implications for podocyte depletion and proteinuria in diabetes mellitus.Arch Biochem Biophys. 2016，15：590-599.
4].Wei M，Li Z，Xiao L，Yang Z.Effects of ROS-relative NF-κB signaling on high glucose-induced TLR4 and MCP-1 expression in podocyte injury.Mol Immunol.2015，68（2）：261-71.
[5].Ahad A，Ganai AA，Mujeeb M，et al.Ellagic acid，an NF-κB inhibitor，ameliorates renal function in experimental diabetic nephropathy.Chem Biol Interact.2014，5（219）：64-75.14
[6].杨明正，张小如，李龙.阿托发他汀对糖尿病大鼠外周血和肾组织核因子κB 的影响.中国糖尿病杂志，2007，15（2）：91-93.
[7].张金玲，王小虎，邓振涛等.中药女贞子化学成分及药理作用研究进展.现代中西医结合杂志.2013，22（36）：4100-4101.
[8].高大威，李青旺，刘志伟等.女贞子中齐墩果酸抗糖尿病效果研究.中成药，2009，3（10）：1619-1621。
论文作者:杨明正,吴莲叶,李肖瑛,姬婷婷
论文发表刊物:《中西医结合护理》2016年第2卷第4期
论文发表时间:2016/8/5
标签：女贞子论文; 细胞论文; 大鼠论文; 肾小球论文; 糖尿病论文; 基质论文; 组织论文; 《中西医结合护理》2016年第2卷第4期论文;