1.武汉大学基础医学院 武汉 430071；2.咸宁职业教育集团学校 咸宁 437100
摘要：目的：探讨带有增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因的pEGFP.N3是否能够有效转染ADSCs。方法：提取pEGFP-Genesil-1质粒，采用Lipofectamine2000脂质体将绿色荧光表达质粒Genesil-1载体转染至ADSCs。镜检各个时间点含有荧光的鼻咽癌细胞数，并选取转染率最高时间点的鼻咽癌细胞，用流式检测精确的转染率。结果脂质体复合物转化ADSCs 24h后，荧光倒置显微镜下可见绿色荧光，4ug/ml质粒浓度组转染48小时绿色荧光蛋白阳性细胞率达最高值。结论 带有增强型绿色荧光蛋白基因的pEGFP.N3可以较为高效地转染ADSCs。
关键词：EGFP；ADSCs 鼻咽癌细胞；绿色荧光表达质粒
脂肪来源干细胞（ADSCs）因其来源充足、易于扩增、可多向分化等特点而成为组织工程、细胞治疗、基因治疗等方面的研究热点。在体内实验中，为证明移植细胞的转归和生成组织的来源，细胞的标记与示踪是关键问题之一。本实验用带有增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）基因的pEGFP．N3转染ADSCs，检测其转染效率及体内移植效果，为ADSC的研究和应用奠定基础。
1.材料与方法
采用Lipofectamine 2000脂质体将绿色荧光表达质粒Genesil-1载体转染ADSCs，分别收集各细胞样品进行流式细胞检测转染率和在光学显微镜下观察细胞形态。各个时间点转染的鼻咽癌细胞，在荧光显微镜下随机取不重复视野，每个视野数100个细胞，计数荧光细胞数，每时间点计数三次，取平均值，各时间点的转染率，，送转染率最高的时间点的鼻咽癌细胞再做流式检测精确的转染率。实验数据用x±s表示，利用SPSS12统计软件处理，两受体表达在两细胞中比较采用t检验，p﹤0.05为差异有统计学意义。所得实验数据以X±s 表示，使用 SPSS20.运用配对t检验统计学分析， P<0.05被认为有统计学意义。
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2.结 果
pEGFP-Genesil-1质粒．脂质体复合物转化脂肪来源干细胞24h后，大量细胞表达绿色荧光蛋白，荧光倒置显微镜下可见绿色荧光，绿色荧光蛋白阳性细胞率达（13.0+3.5）％。在转染后48小时以前，随培养时间的延长，绿色荧光蛋白阳性细胞率逐渐增加，无论哪个浓度组，转染48小时绿色荧光蛋白阳性细胞率达最高，随后渐渐下降。在荧光显微镜下计算转染率和流式细胞检测转染率。结果显示：每一个质粒浓度组转染ADSC后，转染率渐渐增加，转染后48小时转染率达最高，随后又渐渐回落，软件分析结果显示：4 ug/ml质粒浓度组门内SSC轴坐标值代表了荧光细胞的百分比即为转染率57.45%，而2仅为0.9%。
3.讨 论
在脂肪来源干细胞研究中，对于移植细胞的有效标记和示踪是研究所涉及的重点之一。常用的细胞标记方法很多，包括BrdU标记、DiI标记、DAPI标记、PK26标记、Hoechst33342／3 325 8标记、报告基因转染标记法、同位素标记法等。化双重染色，但当细胞发生凋亡或死亡时，BrdU则可掺入到其它细每种标记法都有其各自特点[17-19]：BrdU标记法可采用Brdu+免疫组胞，难以区分移植细胞和宿主细胞；荧光染料标记法方法简便，不足之处是随着细胞的分裂标记物也几乎等份地分配给两个子细胞，子细胞的荧光强度也随之下降；Y染色体标记法技术简单，标记效率及稳定性都很高，存在的问题是，易出现假阴性结果及不能用于自体细胞移植的研究；同位素标记法因存在放射性污染等不足已逐渐少用；报告基因转染法标记可长期体内标记，但存在转染率低等问题。
绿色荧光蛋白（GFP）是一类存在于包括 水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。GFP作为标记物时不需加任何底物，可直接用长波长紫外光照射观察。其分子量较小，与目的基因融合后，对目的基因的结构功能影响小，大量表达对细胞也无毒性作用，细胞仍可连续传代培养。绿色荧光蛋白荧光表达稳定，可耐受高温处理，甲醛固定和石蜡包埋不影响其荧光性质，并且无光漂白现象。
目前常用的基因转染载体有病毒载体和质粒载体。脂质体介导的质粒转染法是近年来开始广泛使用的一种方法，通过本实验可看出，在质粒转染初期，转染率相对较低，以含G4 1 8的培养液连续传代后，G4l 8抗性细胞即GFP阳性表达细胞逐渐增多。在G4 l 8杀伤细胞浓度测定实验中可以杀死全部细胞的浓度在筛选中并未达到未转染细胞全部死亡的效果，分析其原因可能是质粒转染的细胞在细胞分裂过程中发生质粒丢失，随之又出现G4 l 8抗性非表达细胞，但随着筛选时间的延长，抗性细胞逐渐增多，即GFP阳性细胞逐渐增多，在第5代时可达60．70％。
参考文献：
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[2]DingWM，Bai JZ，Zhang JM，etal．In vivo tracking of implanted stem cells using radio-labeled transferring scintigraphy，Nucl Med Biol，2004，31：719-725．
[3]Vogel G．Harnessing the power of stem cells[J]．Science，1999，283（5407）：1432．1434．
论文作者:陈树,王芳,周春,朱俊,熊志,孔志华,袁玉林
论文发表刊物:《健康世界》2015年22期
论文发表时间:2016/3/15
标签：转染论文; 细胞论文; 荧光论文; 质粒论文; 标记论文; 蛋白论文; 鼻咽论文; 《健康世界》2015年22期论文;