范守城[1]2004年在《一种新phyA基因的克隆、表达及其生物活性测定》文中认为植酸酶(phytase,phyA)是催化植酸及其盐类物质水解成肌醇和磷酸的一类酶的总称。它具有分解植酸盐的特殊作用,能促进单胃动物对磷的吸收;能使饲料中磷的利用率提高50%左右;同时它还能将与多种金属离子和蛋白质螯合的植酸磷降解;此外它还具有促进动物生长、保护生态环境等作用。因而在饲料、食品和医药工业以及环保等方面都具有重要的现实意义和潜在的应用价值。研究目的:利用基因工程技术生产植酸酶,不仅可以大幅度提高其产量,还能按照人们的需要改变蛋白的特性,获得具有优良特性的高活性植酸酶蛋白。目前只有欧美发达国家才有商品化的重组植酸酶产品。但是商品化的植酸酶几乎都是利用酵母工程菌表达的,其生产成本较高、周期较长、工艺复杂等特点,限制了植酸酶的推广和应用。在我国,phyA基因工程应用基础研究较少,先后有学者采用定点突变、随机突变、构建新型表达系统等方法对phyA基因进行研究,但表达出的植酸酶在耐温性、耐酸性等方面效果不显着,还没有真正的商品化的重组植酸酶产品面市。植酸酶是一种生物学效应广泛的营养因子,在实际生产和应用中,人们更希望它具有满足工业化生产的酶学特性。随着植酸酶基因工程技术的发展,采用不同的表达载体进行重组蛋白的表达也成为植酸酶研究的新热点。本研究通过选用功能强大的原核表达载体pET30a+和pMG36e,构建Ecoli.BL21(pET30a+-phyA)和lacto bacillus MG1363(pMG36e-phyA),以期得到大量高活性、耐酸性和热稳定性好的重组植酸酶,为开发含植酸酶的新型、多功能微生态制剂提供基础数据和科学依据。目前,国内还没有用pET30a+和pMG36e表达植酸酶的报道。研究方法、内容和结论如下:选育具有高活性植酸酶的原始菌种。我们采用经典的紫外线诱变处理自行分离、鉴定的黑曲霉菌株,并获得酶活高达135.483U的黑曲霉F246。利用primer5.0设计了两对引物,直接对黑曲霉基因组DNA进行PCR扩增phyA基因的成熟肽序列,经过DNA测定证实:该phyA基因全长1347bp,序列为新 phyA基因;其氨基酸序列比较分析表明:该序列包含448个氨基酸,存在5个潜在的N-糖基化位点。将 phyA基因定向亚克隆到表达载体pET30a+和pMG36e上,构建两种新型表达质粒pET30a+-phyA和pMG36e-phyA,并转化E.coli、lactobacillus两种表达系统,成功构建工程菌BL21-pET30a+-phyA和MG1363-pMG36e-phyA。采用E.coli/ phyA进行表达研究,并对表达条件进行优化,得到最佳表达条件:
陈惠[2]2004年在《基因突变技术提高phyA植酸酶在毕赤酵母中表达量及热稳定性的研究》文中研究指明植酸酶作为单胃动物的饲料添加剂,其使用效果已在世界范围内得到了确证。但是,目前植酸酶在饲料中的推广和应用还相当有限,主要原因在于:(1)植酸酶基因工程菌的产酶量有待进一步提高;(2)植酸酶的热稳定性欠佳不能完全满足饲料加工、贮藏的要求。目前,蛋白质工程技术已成为修饰和改造天然酶的有效手段,为植酸酶产量的提高和热稳定性的改善开辟了新的途径。本研究在对本课题组已注册的植酸酶phyA基因核苷酸序列及氨基酸序列分析的基础上,通过对phyA基因进行同义突变、定点突变以及结构延伸突变,获得在毕赤酵母中高效表达并且热稳定性良好的植酸酶,其结果主要如下: 1、对来源于本课题组自主分离的黑曲霉N25(Aspergillus niger China Strain)的植酸酶基因phyA(GenBank:基因注册号为AF218813,蛋白质序列号为AAF25481)进行PCR介导的定点突变。在不改变其所编码氨基酸条件下,选用毕赤酵母偏爱的密码子对该基因保守序列中第81位和第85位的Arg密码子进行同义突变,构建了含正确突变的酵母表达载体pPIC9k-phyA~m。电击转化毕赤酵母GS115,经筛选培养基MM、MD平板筛选和产物的酶活性测定,筛选出突变的高酶活酵母转化子2株。这2株转化子的Southern blotting结果显示突变基因phyA~m以单交换方式单拷贝整合到酵母染色体DNA中;表达产物的SDS-PAGE分析表明,重组酵母中的植酸酶能有效分泌和表达,其酶蛋白分子大小为70.15kD;转化子酶活测定结果可知,经密码子优化的突变重组酵母的酶活力明显高于未进行优化的重组酵母转化子。密码子优化后的突变重组酵母株PP-NP~m-8于麦芽汁培养基中诱导36h后,酶活力可达47600 U·ml~(-1),比未优化重组酵母株PP-NP-2(23667 U·ml~(-1))提高了1.01倍,经十代传代实验汪实重组转化子遗传稳定性良好。 2、采用反向长距离PCR技术对上述重组酵母PP-NP~m-8的植酸酶突变基因phyA~m进行PCR介导的定点突变,即将植酸酶43位的苯丙氨酸替换为酪氨酸(F43Y),将其354,358位的异亮氨酸、亮氨酸分别替换为甲硫氨酸和苯丙氨酸(1354M,L358F),得到了两个突变体PP-NP~(m-1)(F43Y)及PP-NP~(m-2)(I354M,L358F)。含突变基因的重组表达载体pPIC9k-phyA~(m-1),pPIC9k-phyA~(m-2)在毕赤酵母GS115中表达,对表达产物
彭远义[3]2004年在《植酸酶产生菌的选育及高表达工程菌的构建研究》文中指出植酸酶是一类能催化植酸及植酸盐水解成肌醇和无机磷酸盐的酶，它具有解除植物性饲料(或食品)中植酸的抗营养作用、提高机体对蛋白质及多种微量元素的利用率、促进生长发育、提高动物生产性能、减少粪便中磷的排放量、降低磷对环境的污染等多种功能，因而受到国内外的广泛关注。植酸酶主要存在于植物和微生物中，其中以微生物产生的植酸酶具有良好的开发前景，但微生物天然菌株产酶水平较低，加上天然植酸酶的某些性质不能完全适合饲料加工和养殖业的要求，从而限制了植酸酶在生产中的推广应用。通过植酸酶产生菌的筛选和基因克隆，并利用分子生物学技术构建基因工程菌，或在分子水平上改造植酸酶基因，以提高植酸酶产量或改变植酸酶酶学性质，从而降低生产成本，提高其使用有效性，己成为世界性的研究热点之一。 本研究的目的旨在通过从土壤中筛选酸性植酸酶高产菌株，并进一步通过诱变选育提高其产量，对高产突变菌株植酸酶基因进行克隆和分析，在此基础上，构建植酸酶高产基因工程菌，从而为植酸酶产品的工业化生产奠定基础。主要结果如下： 1 植酸酶高产菌株的筛选 利用植酸钙选择性子板培养基从土样中筛选出102株酸性植酸酶产生菌，从中挑选出透明圈较大的菌株32株，经分离纯化后分别进行摇瓶复筛，28℃、220r/min发酵5天后，在37℃、pH2.5或pH5.5条件下用钒钼酸铵法检测其酶活，结果发现有3株菌产酶活性较高且产酶性能较为稳定。其中编号为03214号的菌株在37℃、pH2.5时酶活性最高，达345U/mL发酵液；编号为041和0324号的菌株在37℃、pH5.5时酶活性最高，分别达285U/mL和250U/mL发酵液。根据产酶活性情况，选取03214号菌株作进一步鉴定和诱变选育的出发菌株。经初步鉴定，03214号菌为黑曲霉，编号为Aspergillus niger03214。 2 植酸酶高产菌株黑曲霉N14的诱变选育 以Aspergillus niger03214为出发菌株，通过紫外线诱变处理不同时间，经平板初筛和摇瓶复筛，获得一株产酶活性较高的突变株03214-3，酶活为373U/mL发酵液，比出发菌株提高了8％左右。以突变株03214-3为出发菌，经0.8mg/mL的亚硝基胍诱变处理不同时间，最终获得了产酶活性较原始菌株Aspergillus niger03214提高了22.3％，达422.3U/mL发酵液的突变菌株，编号为Aspergillus nigerN14。 将黑曲霉N14在PDA斜面上连续传7代，分别测定各代菌株酶活，结果其酶活稳定在410～430U/mL发酵液之间，说明突变株黑曲霉N14具有良好的遗传稳定性，可作为下一步基因工程研究的出发菌株。 3 黑曲霉N14基因组DNA的提取及植酸酶phyA基因的克隆，，画.‘，，妇..圈.翻‘通~ 以A，e啥1111”nigerN14为出发菌，采用改良氯化节法和斑迹抽提法提取基因组DNA，经紫外分光光度计测得DNA的ODZ曰心D翔均在1.80左右，表明这两种方法均适合提取黑曲霉基因组DNA。但在所用菌丝体重量相同的条件下，以氯化节法提取的pNA浓度较高。 根据曲霉菌属植酸酶基因具有高度同源性的特点，结合已报道植酸酶神州基因序列，自行设计一对特异性引物(上游引物:5，月队GGG叼℃八TGGGCG子巳n刃口，;下游引物:5，CAGC以六GCA阳心咙火CTCCGC3，)，采用乃仰七。t DNA聚合酶(高保真DNA聚合酶)，通过PCR方法从黑曲霉N14基因组DNA中扩增出了预期的约1.skb的特异性产物，将其与pMD18.T载体连接后，转化大肠杆菌Dll5Q，.经质粒抽提、五之口月111、tl双酶切鉴定和PcR鉴定，确认该目的基因已得到成功克隆。4黑曲霉N14植酸酶夕句以基因序列分析 DNA序列测定表明，本试验所克隆的目的基因片段含有植酸酶户州基因的完整序列(GeneBank AcceSSIOn:AY4269”)，夕句讨基因全长15仅无p，其中包含一段长102bp的内含子序列，编码467个氨基酸，5’端有拼编码19个氨基酸的信号肤序列。植酸酶活性位点序列CRvTEAQvLsRHGA即n红DsKCK位于氨基酸序列的+71~+93。黑曲霉N14植酸酶夕勺讨基因中G+仁含量达54.7%，密码子第叁位碱基的G+C含量高达67%。黑曲霉N14植酸酶助州基因与报道的产植酸酶活性最高的天然黑曲霉标准株N刊心乃135(来源于孟，己心iuus niger介uum夕va:a~ori)的尸句“基因(GeneBankA以尤SSion:M94550)及A.nigerN25PhyA基因(GeneBankA。戈SSion:AF21如13)、A.nigervar~夕句“基因(枷eBank Aa笼ssfon:ID2421)、A.niger5K-57夕hJ讨基因(G闭eBaDk八口戈SSion:川叨227(X))同源性分别为%.7%、%.8%、%.4%和91.7%，而编码的氨基酸序列同源性分别为98%、97.8%、%.7%和95.7%。进一步采用公pa叮IProtParam等软件对黑曲霉N14植酸酶夕句“基因编码氨基酸序列及编码的蛋白质二级结构预测进行分析，结果表明，黑曲霉Nl助h)“基因所编码氨基酸序列存在10个潜在的N-糖基化位点，与黑曲霉NRRU 135和黑曲霉N25的p勺讨基因所编码氨基酸序列上的N-糖基化位点个数及位置完全相同，而糖基化对微生物表达的植酸酶的生物合成和热稳定性至关重要;理论PI为4.95，分子量为5 n42.0，分子式为q6eH蝴3Ns990，消。;负电荷氨基酸残基 (As尹Glu)有51个，正电荷氨基酸残基(A犯+切s)有34个。实验结?
沈亚欧[4]2005年在《植酸酶基因（phyA）转化玉米的研究》文中研究说明植酸酶是催化植酸磷(肌醇六磷酸及其盐类)分解成肌醇和无机磷酸盐的一类磷酸酶,它可以分为两类:肌醇六磷酸-3-磷酸水解酶(EC.3.1.3.8)和肌醇六磷酸-6-磷酸水解酶(EC.3.1.3.26),其主要来源于酵母菌、霉菌及细菌等微生物;另外,在反刍动物的瘤胃和高等植物体内也含有植酸酶。磷是生物机体内不可缺少的元素,植物体内磷的主要存在形式是植酸磷,在种子中植酸磷的含量约占其总磷的70%左右。而植物体内天然植酸酶的量相对于植酸磷的水平是很低的,并不足以使植物从大量的植酸磷中释放出足量的无机磷。由于单胃动物的胃肠道也不能分泌植酸酶,从而难以充分利用植物性饲料中的植酸磷源,为满足动物对磷的需求,通常须要在饲料中添加无机磷,这样一方面提高了饲料的成本,另一方面使自然界中的无机磷资源受到严重的威胁;同时,动物不能利用的植酸磷直接从粪便中排出,又会造成环境的磷污染;此外,植酸是一种抗营养因子,它能抑制动物对植物性饲料中的Ca~(2+)、Mg~(2+)、Zn~(2+)、Fe~(2+)、K~+等金属离子、蛋白质、维生素以及脂肪酸等营养成分的消化吸收,从而降低饲料的营养价值。因此,在动物饲料中添加外源植酸酶逐渐成为提高饲料营养价值和降低环境磷污染的一种有效措施。 作为一种饲料作物,玉米虽然不能为动物的生长发育提供主要磷源,但它是动物饲料中最主要的成分。通过植物基因工程手段使植酸酶在玉米子粒中高效表达,既能降低其内部植酸的水平;同时子粒在饲喂动物后,其中大量的植酸酶在动物胃肠道释放后,又能作用于胃肠道内其它饲料成分中的植酸,提高其营养价值。这样既免去了外源植酸酶的添加,降低了饲料成本,又减少了畜牧生产对环境造成的磷污染。 本研究通过基因枪和农杆菌介导两种方法将含有来源于黑曲霉N25的植酸酶phyA基因的植物胚乳特异表达载体pCBA-Hyg导入玉米优良自交系18-599(红)中,对T_0代转基因植株进行PCR检测,共获得9株PCR为阳性的植株,在这9株中有7株收获了T_0代转基因种子。对这些转基因干种子进行的植酸酶比活力测定,其中有5个株系的干种子其内部植酸酶比活力与对照相比有显着提高,最高的两个株系分别提高了60.85%和44.98%,证明phyA基因已经整合到玉米基因组染色体上并进行了有效的表达。进一步对部分转基因干种子中的无机磷含量进行测定,结果表明有两个株系的干种子中无机磷的含量与对照相比有显着提高,而它们恰好是干种子中植酸酶活力最高的两个株系,证明转基因植酸酶对种子中的植酸磷进行了有效的分解,从而提高
陈艳[5]2004年在《淀粉液化芽孢杆菌中性植酸酶基因在大肠杆菌和毕赤酵母中的高效表达》文中研究表明淀粉液化芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)是一种嗜热菌，其产生的中性植酸酶具有广阔的应用前景。本研究克隆了淀粉液化芽孢杆菌植酸酶基因，采用表达载体pET-30a(+)Vector、pPIC9K Vector及其相应的宿主菌E. coli 21和Pichia pastoris GS115对其进行表达，并对表达产物的活性和耐热性能进行了系统性评价。主要研究结果如下： 通过对植酸酶基因序列的同源性比较，根据其保守区域设计上游引物5BAP01和下游引物3BAP01。以提取的淀粉液化芽孢杆菌BA基因组为模板，利用TD-PCR技术克隆了淀粉液化芽孢杆菌植酸酶基因BAP，并构建了重组质粒pGEM-T Easy BAP Vector。测序表明，其长度为1167 bp，ORF为11bp～1159 bp，编码383个氨基酸，5’端有一个编码26个氨基酸的信号肽序列，其全长理论分子量为41.9 kDa。 淀粉液化芽孢杆菌植酸酶基因和已报道的杆菌植酸酶序列具较高同源性，如与AF029053(B. subtillus)、AF453255(B. amylotiquefaciens)、U85968(Bacillus sp.DS11)、AY220075(B. subtillus)、AY055220(B. amyloliquefaciens)、AY518208(Bacillus sp.)的DNA序列的同源性分别为100％、96％、92％、92％、92％、92％，所编码蛋白同源性分别达到100％、97％、94％、94％、94％、93％。 通过带限制性内切酶位点的引物(5BAP01带BamHI位点，3BAP01带XhoI位点)，将淀粉液化芽孢杆菌编码的中性植酸酶基因定向插入到原核表达载体pET-30a(+)上，得到重组表达质粒BAP-pET-30a(+)Vector。在大肠杆菌BL21(DE3)中得以表达，SDS-PAGE凝胶电泳显示在50.2 kDa处有一特异条带，比推导出的分子量41.9 kDa大。单位发酵液的酶活力为480.6 U／ml，表达量占到了大肠杆菌可溶性蛋白的33.5％，为出发菌株酶活的1.27倍。采用金属Ni~(2+)亲和层析对基因表达产物进行纯化，产物具有正常的生物学功能。 根据酵母表达载体pPIC9K的多克隆位点和已克隆的中性植酸酶基因限制性内切酶图谱，设计具有SnaBI位点的上游引物5BAPK01和具有NotI位点的下游引物3BAPK01。采用亚克隆技术，将淀粉液化芽孢杆菌植酸酶基因以N-端融合的方式正确插入到酵母表达载体pPIC9K上的α-因子信号肽编码序列的3’硕士学位论文淀粉液化芽抱杆菌中性植酸酶基因在大肠杆菌和毕赤酵母的高效表达端，构成重组表达载体BAP一pPICgK。用电击法将经BgiH单酶切线性化的BAP一PPICgK转化入毕赤酵母Gslls菌株，从而整合到酵母染色体DNA中得到重组转化子。筛选到的基因工程菌经培养后，上清液的发酵活力为4120 U/ml，为出发菌株的10.9倍。sDs一PAGE凝胶电泳检测，表达的植酸酶的分子量约为45 kDa，这表明植酸酶基因在毕赤酵母得到了高效表达g 对两种表达系统的植酸酶生物学特性研究显示，云动11 BAPE菌株与Piohia pastori:BAPK菌株表达的淀粉液化芽饱杆菌的植酸酶具有相似性，最适反应温度均为65一70’C，属嗜热性酶。其最适反应pH为7.0一7.5，在6.。一7.5这一范围内，酶活性均在70%以上。pH值稳定性结果表明，植酸酶BAPE和BAPK在pHS.0一9，O之间极为稳定，残余酶活在85%以上，而pH低于5.0时，酶活性迅速下降，到pH为4.0以下，已无酶活性。热稳定性研究揭示，重组酵母植酸酶BAPK的耐热性优于大肠杆菌植酸酶BAPE，BAPK在70℃和80℃处理2 min，残余酶活为80.54%和68.42%，处理10 min的残余酶活分别为70.03%和50，69%;而植酸酶BAPE在70℃和80℃处理2 min，残余酶活为71.02%和40.34%，处理10 min后，残余酶活为4823%和20.12%。由此可以看出，同种基因经两种不同系统表达得到的植酸酶均适合在动物的肠道内发挥作用，重组酵母植酸酶BAPK耐热性更佳。
穆熙军[6]2009年在《利用定点突变技术对植酸酶中二硫键功能的研究》文中研究说明在饲料中添加植酸酶可提高植物性饲料中磷的利用率和单胃动物对矿质元素的吸收率,并减轻动物排泄物中磷对环境的污染。在生产酶制剂的过程中提高植酸酶基因的表达水平以及改善植酸酶的稳定性是亟待解决的问题。随着基因工程的发展,在分子水平上对酶基因进行改造为改良酶蛋白开辟了一条新的途径。二硫键是蛋白质分子侧链间唯一的共价键,对蛋白质的结构稳定性及功能具有重要的作用。植酸酶PHYA中共含有五对二硫键( Cys12-Cys21 , Cys52-Cys395 , Cys196-Cys446 ,Cys245-Cys263,Cys417-Cys425),通过研究植酸酶分子中二硫键对酶的催化活性及稳定性的影响,找出影响稳定性的关键部位,可以为通过引入二硫键来提高酶的稳定性打下基础。本实验室前期研究已证明二硫键对植酸酶的空间结构和催化活性有重要作用,并利用定点突变技术对其中的3对二硫键进行了单突变缺失研究,初步结果表明其中两对对植酸酶的热稳定性有重要作用。为全面确定5对二硫键的作用,在已有的3个单突变体的基础上,又构建了另外6个突变体(包括4个单突变体和2个双突变体),结合前期得到的3个单突变体,研究5对二硫键的缺失对植酸酶的结构和功能的影响,得到的主要结果如下:1.对植酸酶酶促反应动力学性质的研究表明:二硫键Cys12-Cys21和Cys196-Cys446的缺失明显降低了植酸酶对底物的亲和力、催化效率和底物专一性,同时酶的最适pH也有所改变。二硫键Cys12-Cys21、Cys52-Cys395、Cys196-Cys446的缺失使植酸酶反应最适温度(反应时间10分钟)由50℃分别变为45℃、55℃、40℃。2.利用内源荧光光谱技术对野生型和突变体植酸酶的空间构象进行了研究,结果表明5对二硫键的缺失使植酸酶的空间结构发生了或多或少的改变,其中二硫键Cys52-Cys395的缺失使植酸酶空间结构变得尤为松散。3.对野生型和突变体植酸酶热稳定性分析表明,二硫键Cys52-Cys395、Cys245-Cys263、Cys417-Cys425的缺失极大地降低了植酸酶的热稳定性,二硫键Cys196-Cys446缺失以后得到的突变体植酸酶热稳定性比野生型略高。
李瑞娟[7]2011年在《水稻新型植酸酶基因OsPHY1和OsPHY2的克隆、表达和遗传转化》文中进行了进一步梳理植酸酶是催化植酸及其盐类降解为肌醇与磷酸的一类酶的总称。禾谷类作物水稻籽粒贮存磷素主要为植酸及其盐类,种子萌发和幼苗生长所需要的磷素通过植酸酶对植酸及其盐类的降解提供。本项研究系统开展了2个水稻植酸酶基因OsPHY1和OsPHY2的克隆、表达、生化特征和功能研究。主要研究结果如下:1、以水稻种子萌发后6天的胚芽cDNA为模版,扩增了OsPHY1和OsPHY2编码阅读框(ORF)。OsPHY1的开放阅读框为1620 bp,编码一个由539个氨基酸残基组成的多肽链,蛋白分子量59.71 kDa,等电点5.85。OsPHY1含有紫色酸性磷酸酶的保守结构域MPP_PAPs以及MPP_ACP5、MPP_CSTP1和MPP 3个其它保守结构域。OsPHY2的开放阅读框为1560 bp,编码519个氨基酸,蛋白分子量57.99 kDa,等电点7.59。OsPHY2含有组氨酸酸性磷酸酶(HAP)类植酸酶通常具有的组氨酸磷酸酶结构域。2、分别建立了OsPHY1和OsPHY2与植物种属同源基因在核苷酸水平上的系统进化树。结果表明,OsPHY1与源于拟南芥、水稻、小麦具有植酸酶活性的紫色酸性磷酸酶高度同源;OsPHY2与源于小麦的植酸酶基因(T. aestivum PhyⅡa1、T. aestivum PhyⅡa2、T. aestivum PhyⅡb和T. aestivum PhyⅡac)和源于大麦的植酸酶基因(H. vulgare PhyⅡa1、H. vulgare PhyⅡa2和H. vulgare PhyⅡc)具有较高的同源性。3、进而采用半定量RT-PCR技术,鉴定了OsPHY1和OsPHY2的组织表达特征。OsPHY1在种子萌发后10 d内的分化幼胚中均有高水平表达,但大体表现为单峰曲线型特征,以种子萌发后4 d时表达量最高。OsPHY2在萌发种子中的表达水平与OsPHY1相似,也表现为在种子萌发后的分化胚芽中具有高的表达水平,在根系和叶片中的表达水平明显降低。表明上述水稻植酸酶基因通过增强表达,在种子萌发过程中降解种子的植酸及其盐类中可能发挥着重要作用。4、以融合OsPHY1和OsPHY2编码阅读框的pUCm-T重组质粒为基础,采用DNA重组技术,构建了原核表达OsPHY1和OsPHY2的重组质粒pET28a(+)-OsPHY1和pET28a(+)-OsPHY2。将构建的重组质粒转化E. Coli菌株BL21,IPTG诱导后诱导了目的基因在原核细胞中的表达。5、对诱导蛋白的生化特性研究表明,OsPHY1催化反应的适宜温度为57℃,适宜pH为3.5。高温条件下及高温预处理后,蛋白质仍维持一定水平的催化能力,表明OsPHY1具有较强的耐热性。与OsPHY1相似,OsPHY2也具有较强的催化底物降解的能力,催化反应的最适pH也为3.5,但催化反应的适宜温度为47℃,且该酶抵御高温和高温预处理的能力较差。6、采用DNA重组技术,构建了将OsPHY1和OsPHY2编码阅读框融合至双元表达载体pCAMBIA3301中的重组表达载体pCAMBIA3301-OsPHY1和pCAMBIA3301-OsPHY2,采用农杆菌介导的方法建立了超表达OsPHY1和OsPHY2的转基因烟草植株。分子检测结果表明,目的基因在各烟草转基因系中均得到特异性扩增,且靶基因在转基因系中均有较高表达水平。7、与遗传转化空载体的对照(CK)相比,超表达OsPHY1和OsPHY2的转基因系植酸酶活性增强。在以植酸钠为唯一磷源的生长条件下,超表达OsPHY1和OsPHY2的转基因系植株长势明显优于CK。此外,转基因系较对照具有明显增加的植株磷累积量和植株干重。表明在以植酸钠为唯一磷源的生长条件下,超表达OsPHY1和OsPHY2的转基因系具有明显改善的植酸钠利用能力。OsPHY1和OsPHY2在改善作物利用有机态磷源的能力方面具有重要的应用前景。
李春梅[8]2011年在《定点突变技术提高黑曲霉N25植酸酶热稳定性的研究》文中提出植酸酶是一种重要的工业用酶,被广泛的用作单胃动物的饲料添加剂,它的饲喂效果已在世界范围内得到了确证。但目前热稳定性差及酶活力低是植酸酶在生产应用中的一个瓶颈,因此通过蛋白质工程技术对植酸酶基因进行改造具有重要的科研和实用价值。本研究采用反向长距离PCR技术对来源于黑曲霉N25的植酸酶phyAm基因进行定点突变,即将植酸酶44位的异亮氨酸(ATC)替换为谷氨酸(GAA) (I44E),将252位的苏氨酸(ACC)替换为精氨酸(AGA) (T252R), I44E、T252R密码子替换均选用毕赤酵母偏爱密码子,并构建了叁个重组质粒pPIC9k-phyA44、pPIC9k-phyA252及pPIC9k-phyA44-252。将重组质粒线性化后电击转化巴斯德毕赤酵母,经筛选获得了突变植酸酶毕赤酵母基因工程菌株PP-NPm-44、PP-NPm-252及PP-NPm-44-252。将未突变和突变植酸酶毕赤酵母基因工程菌株经BMGY/BMMY诱导培养,并对表达产物进行了分离纯化及酶学性质研究。结果表明：(1)表达产物的SDS-PAGE分析表明,突变和未突变植酸酶的大小一致,均为70.15kD。(2)突变前后植酸酶的最适反应温度和最适反应pH未发生变化,分别为55℃和pH5.0。(3)突变体PP-NPm-44、PP-NPm-252及PP-NPm-44-252经BMGY/BMMY诱导培养4d,其酶活力分别达到70293 U/mL、72647 U/mL和81227 U/mL,分别是出发菌株PP-NPm-8(63667 U/mL)的1.1、1.14和1.28倍,比活力分别是出发菌株的1.09、1.04和1.27倍。(4)热稳定性研究结果表明：叁个突变体的热稳定性均有所提高,且突变体PP-NPm-44-252具有最好的热稳定性,分别在80℃和90℃处理10min后,突变植酸酶的剩余酶活力比未突变植酸酶提高了约36%和47%,酶蛋白解链温度提高了1.2℃。(5)金属离子对酶活力的影响研究表明：Cu2+、Zn2+、Ag+、SDS有一定的抑制作用,尤其是Cu2+可使酶活力降至46.24%;Mg2+、Mn2+、Co2+对植酸酶有明显的激活作用,而大多数金属离子对植酸酶活力影响不大。本研究通过定点突变技术,获得了在毕赤酵母中高效表达且热稳定性良好的植酸酶基因工程菌株,并通过对突变前后植酸酶结构预测分析探讨了植酸酶结构与功能关系,为进一步改造植酸酶基因和植酸酶基因工程菌投入生产奠定坚实基础。
王祎[9]2012年在《油菜超量表达柠檬酸合成酶和植酸酶基因提高抗土壤磷铝胁迫的研究》文中研究说明铝毒害和有效磷缺乏是酸性土壤中限制作物生长的两个主要因子。虽然土壤中有效磷很低,但总磷量很高,其中有机磷占总磷的20%-80%,是植物可吸收利用的潜在磷源。甘蓝型油菜占我国油菜种植面积的80%以上,但其主产区土壤偏酸,或酸性,活性铝偏高,有效磷缺乏。因此,减轻或消除酸性土壤的铝毒害、提高土壤磷的有效性对我国油菜产业可持续发展具有重要意义。本研究通过农杆菌介导的基因遗传转化技术,在获得甘蓝型油菜超量表达Pseudomonas aeruginosa柠檬酸合成酶(CS)基因、及整合有胡萝卜外展蛋白的植酸酶基因phyA和appA的转基因株系的基础上,利用水培、砂培、土培等方法研究了转基因植株对铝毒害和低磷胁迫的抗性、及其生理和分子机理。获得的主要结果如下：1.通过筛选鉴定获得5个T3代甘蓝型油菜转基因株系。利用Southern blotting分析T3转基因植株外源基因的拷贝数,结果显示：超量表达CS的转基因株系CS3含有两个P. aeruginosa CS基因拷贝,而CS6株系含有一个拷贝；超量表达phyA的转基因株系P3含有一个Aspergillus niger phyA基因拷贝,P11株系含有3个phyA基因拷贝,而超量表达植酸酶基因appA的转基因株系a18含有两个Escherichia coli appA拷贝。利用Northern blotting分析外源基因表达量,结果显示：在mRNA水平上,CS3和CS6株系有较高的P. aeruginosa CS基因表达量；P3和P11株系有较高的A. niger phyA基因表达量；a18株系有较高的E. coli appA基因表达量。卡那抗性筛选结果显示,5个转基因株系均无Km抗性分离。2.超量表达CS基因的转基因株系CS3和CS6的铝毒抗性显着增强。铝胁迫下,转基因株系CS3和CS6不仅柠檬酸的分泌量显着增加,而且苹果酸的分泌量也显着高于野生型植株(WT)。转基因株系较高的叁羧酸循环途径(TAC)相关的柠檬酸合成酶(CS)、苹果酸脱氢酶(MDH)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)的活性以及较高的柠檬酸和苹果酸转运子的表达量,导致了其有机酸分泌量的增加。25μM AICl3处理48h后,CS3和CS6的相对主根伸长量极显着大于WT,并且长期50μM AICl3胁迫下CS3和CS6的生物量显着高于WT,说明在甘蓝型油菜中超量表达CS基因增强了植株的铝毒抗性。3.超量表达CS基因的转基因株系CS3和CS6的抗低磷胁迫能力增强。低磷胁迫下,CS3和CS6根系分泌的柠檬酸和苹果酸含量显着高于WT,并且CS、MDH和PEPC的活性得到显着提高。盆栽土培试验表明,以FePO4作为土壤中的磷源时,油菜超量表达CS基因显着提高植株从土壤中获取磷的能力,转基因植株苗期地上部和籽粒中的磷累积量显着高于WT植株。4.超量表达植酸酶基因的转基因株系P3、P11和a18的抗低磷能力增强。在油菜中超量表达整合有胡萝卜外展蛋白信号肽序列的植酸酶基因ex::phyA和ex::appA,获得转基因植株在水培试验中的结果表明,根组织和分泌的植酸酶活性显着高于WT。砂培试验结果显示,当以植酸钠作为唯一磷源时,P3、P11和a18株系地上部磷累积量分别比WT植株增加了70.8%、36.8%和19.6%。并且,叁个转基因株系的地上部生物量均显着高于WT植株。盆栽土培试验结果显示,当以植酸钠作为唯一磷源时,P11和a18株系的籽粒产量分别比WT植株提高了20.9%和59.9%,种子中磷的累积量分别比WT植株增加了20.6%和46.9%。叁个转基因株系种子的植酸酶活力约为1000U/kg种子,而WT的种子中没有检测到植酸酶活性。并且P11和a18株系种子的植酸含量显着低于WT。综上所述,在甘蓝型油菜中超量表达CS基因不仅提高了转基因株系柠檬酸的分泌量,而且影响了苹果酸的合成代谢,这两种有机酸分泌量的增加提高了转基因株系CS3和CS6的铝毒抗性和低磷忍耐力。甘蓝型油菜超量表达融合有胡萝卜外展蛋白信号肽序列的植酸酶基因可以显着增强转基因植株根系分泌的植酸酶活性,提高转基因株系对植酸磷的吸收利用能力。并且,转基因植株种子具有很高的植酸酶活性。
高晓蓉[10]2007年在《无载体无标记转植酸酶基因大豆的获得》文中提出植物转基因技术的迅猛发展对传统的作物育种已产生了深刻的影响，然而，自从1998年有人提出转基因生物的安全性问题以后，转基因农作物的种植面积增长速度明显减慢。原因是由于以往的转基因操作中，转化的载体上不可避免的带有载体骨架序列、抗性标记基因、以及外源的启动子，这些因素可能造成转基因植物具有潜在的生物安全隐患。因此，转基因植物安全性问题迅速成为公众关心的焦点和制约转基因农作物产业化的瓶颈。随之产生的去除标记基因和载体骨架序列的新的植物分子育种方法成为植物转基因技术研究的热点。本研究以半固体发酵方式培养泡盛曲霉(Aspergillus awamori)生产植酸酶，通过超滤、阴离子交换层析，凝胶层析步骤，分离纯化了植酸酶蛋白。SDS-PAGE结果显示该酶的分子量约为118kDa，糖基化程度为40.6％。酶学性质研究结果表明：泡盛曲霉植酸酶的最适反应温度为55℃，最适pH为2.5和5.5，37℃条件下以植酸钠为底物的K_m值为1.03nM，V_(max)为2.13μM／min。金属离子对酶活性影响的研究结果表明，EDTA基本不影响植酸酶活性，Ca~(2+)，Mg~(2+)，Mn~(2+)有轻微的抑制作用，Fe~(2+)，Zn~(2+)抑制作用显着。对该酶的耐热性研究表明，在较高温度条件处理后，仍有较高残余酶活性，与当今商品化的植酸酶相比，有较强的耐热性。利用PCR技术克隆了泡盛曲霉(A.awamori 3.324)植酸酶基因及其编码区全序列，命名为phyA(GenBank accession no.DQ192035)。phyA结构基因全长1515bp，其中含有真菌内含子特征保守序列。核苷酸和氨基酸序列均与丝状真菌的同源性较高，其中与无花果曲霉(A.ficuum)NRRL3135 phyA的核苷酸同源性为92.1％(不计内含子，二者的内含子序列相差很大)，氨基酸同源性为95.9％；与A.niger963 phyA_2的核苷酸同源性为95％，氨基酸同源性为94％。该基因编码的植酸酶蛋白理论分子量为51042.8Da，共编码467个氨基酸，序列中存在组氨酸酸性磷酸酯酶的活性位点保守序列(RHGXRXP)和催化中心位点(HD)。根据信号肽序列的结构规则推断，N端的21个氨基酸为信号肽序列，由基因推导出的氨基酸序列上有10个潜在的糖基化位点。构建了植物表达载体pBI121-phyA，通过农杆菌介导法将植酸酶基因导入模式植物烟草，获得卡那霉素抗性植株，通过PCR，Southern-blotting证明外源植酸酶基因已成功整合在烟草基因组上。对转基因烟草叶片的重组植酸酶活性分析表明植酸酶基因在烟草中获得高效表达。对烟草中的植酸酶酶学性质研究表明，重组植酸酶的最适反应温度与泡盛曲霉植酸酶的性质相同，耐热性略有下降，其中一个pH发生偏移。初步说明泡盛曲霉植酸酶基因能够在模式植物中得到正确表达。利用PCR技术从植物表达载体pBI121-phyA上扩增获得无载体骨架序列、无抗性标记基因的含有植酸酶基因的最小线性表达元件，通过花粉管通道技术转化大豆。共对279朵花进行了转化，共获得99株T_1代植株。PCR检测结果表明，13株的扩增结果呈阳性，转化率为13％。473株T_2代个体的PCR结果显示，102株结果为阳性。对T_3代两个株系L14-11-2和L14-19-1部分植株的Southern-blotting结果分析表明，外源基因以低拷贝的方式整合在大豆基因组上。RT-PCR分析表明，外源植酸酶基因已在大豆体内转录。测定了L14-11-2和L14-19-1两个转基因株系后代生长过程中植酸酶的积累情况。重组植酸酶的含量在大豆生长的第二周至第四周不断增加，随后的两周表达水平趋于平稳，在第七周开始有所下降。其中L14-19-1株系后代个体的植酸酶活性在第四生长周时达到最高，为150 U／mg蛋白，几乎是对照的3倍(56 U／mg蛋白)。在转基因大豆种子中植酸酶含量比对照平均提高100％。热稳定性分析表明，转基因大豆种子中植酸酶的残余酶活性在60℃，65℃和70℃时，分别保留70％，40％和10％，而对照样品在65℃以后几乎没有残余酶活性保留，明显高于未转基因大豆。Western-blotting分析结果表明，大豆体内表达的重组植酸酶的蛋白分子量大小为73 kD。通过上述分析，证明外源植酸酶基因在大豆体内实现了遗传和表达，初步建立了一种新的植物分子育种转化体系——具有生物安全性的植物基因工程操作方法，已获得国家知识产权局的专利授权(专利号：ZL 02 1 328382)。目前，这转基因大豆的两个株系L14-11-2(命名为1411)和L14-19-1(命名为1412)已被国家农业部认定其生物安全等级为Ⅱ级，并批准进行中间试验。
参考文献：
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[2]. 基因突变技术提高phyA植酸酶在毕赤酵母中表达量及热稳定性的研究[D]. 陈惠. 四川农业大学. 2004
[3]. 植酸酶产生菌的选育及高表达工程菌的构建研究[D]. 彭远义. 西南农业大学. 2004
[4]. 植酸酶基因（phyA）转化玉米的研究[D]. 沈亚欧. 四川农业大学. 2005
[5]. 淀粉液化芽孢杆菌中性植酸酶基因在大肠杆菌和毕赤酵母中的高效表达[D]. 陈艳. 浙江大学. 2004
[6]. 利用定点突变技术对植酸酶中二硫键功能的研究[D]. 穆熙军. 山东农业大学. 2009
[7]. 水稻新型植酸酶基因OsPHY1和OsPHY2的克隆、表达和遗传转化[D]. 李瑞娟. 河北农业大学. 2011
[8]. 定点突变技术提高黑曲霉N25植酸酶热稳定性的研究[D]. 李春梅. 四川农业大学. 2011
[9]. 油菜超量表达柠檬酸合成酶和植酸酶基因提高抗土壤磷铝胁迫的研究[D]. 王祎. 华中农业大学. 2012
[10]. 无载体无标记转植酸酶基因大豆的获得[D]. 高晓蓉. 大连理工大学. 2007
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