顾大勇[1]2004年在《纳米金新型基因芯片检测系统的优化研究及其在临床病原微生物快速检测中的应用》文中研究指明基因芯片技术具有高速度、高效率、高通量的特点,为临床生物的检测提供了良好的应用前景。目前通用的基因芯片技术有多种,但分别都存在着或者灵敏度不高,或者检测技术复杂,或者条件和设备要求高的问题限制了该技术在临床检测中的应用。本研究采用我室新研制出的纳米放大基因芯片检测的专利技术,并在前期课题的基础上,进一步优化研究纳米金新型基因芯片检测系统,从而实现芯片技术和纳米技术的更有机结合,以充分利用纳米金与银反应可将信号放大106倍的优势取代目前通用的荧光、同位素、酶标等信号报告材料,使之具有设备简单,技术稳定易于掌握,灵敏度高,应用范围广等特点,达到使基因芯片的检测技术能够用于普通实验室甚至野战条件等复杂环境的目的。在此基础上,进一步针对基因芯片检测样品的制备技术,分别结合核糖体分型技术及限制性差异显示技术,研制通用引物一次PCR法及限制性酶切非PCR法,以分别构建针对临床常见致病性细菌及包含非细菌的支原体、衣原体、真菌、病毒等检测的两种实用型纳米金基因芯片,从而为临床致病性病原微生物的快速、简便、准确诊断探索一条新的途径。试验主要方法及结果如下:第一部分 纳米金新型基因芯片系统的优化研究1. 引物巯基修饰后必须经过预还原处理,才能获得较好的PCR扩增效果,还原后的引物既不影响PCR的扩增效率和特异性,也不改变PCR扩增的条件。2. 标记优化试验表明:通过适当增加纳米金-核酸标记反应两组分比例的方法能够减少标记时间;轻微振荡虽然对最终标记效率增加不显着(p>0.05);但可以明显加快标记反应的速度,缩短标记达到最大标记效率的时间(大约为4小时)。3. 芯片杂交反应动力学的优化试验表明:探针浓度为500nM,杂交反应盐离子浓度为0.8M,杂交温度为45℃,杂交反应时间为8小时,最后经过严格条件漂洗可以获得最佳的杂交效率;而轻微的旋转振荡则可以进一步显着增加杂交的效率,包括显着减少杂交达到平衡的时间(大约为4小时)和显着增加最终的杂交强度(p<0.01)。4. 银染显色反应优化试验表明:进一步提高显色反应的温度,可以加快显色反应
叶芬[2]2011年在《PRRSV、CSFV和PCV-2多重PCR诊断方法及基因芯片诊断方法的建立》文中研究指明近年来,猪的疫病日益呈现复杂化和严重化趋势,混合感染的比例大幅度上升,这一现状也增加了临床和实验室诊断的难度。而猪瘟(Classical swine fever,CSF)、猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)和猪圆环病毒病(Porcine circovirus type 2, PCV 2)是目前威胁我国猪的主要传染性疾病。所以建立集成的CSF、PRRS、PCV2的多重PCR及基因芯片诊断方法显得十分必要。本研究利用NCBI基因组比对方法挖掘PRRSV、PCV-2、CSFV基因组中的特异性序列,并结合引物及探针设计原则,设计和筛选相关PCR特异性引物及基因芯片的寡核苷酸探针。同时整合已报道的检测探针和引物,利用筛选和整合的引物和探针建立并优化多重PCR体系和基因芯片方法,检测上述叁种猪病毒性疾病。主要研究结果如下：1.病毒的增殖与鉴定利用MARC-145、PK-15、ST叁种细胞分别增殖出了PRRSV欧洲型毒株、PRRSV美洲型毒株、PCV-2、CSFV,其中PRRSV欧洲型、PRRSV美洲型毒株的增殖结果利用观察其引起MARC-145细胞发生细胞病变进行初步判定, PCV-2、CSFV的增殖结果利用间接免疫荧光进行初步判定,(?)表明这几种病毒均在相应的易感细胞中得到了有效的增殖。2.多重PCR检测体系根据GenBank中已发表的PRRSV欧洲型毒株、PRRSV美洲型毒株、CSFV和PCV-2 4个病毒株基因序列,对各病毒基因区进行同源性分析,设计合成4对特异性引物,然后进行单基因PCR反应特异性验证,在此基础上建立和优化了4种病原的多重PCR检测体系,其最低检测限可达10-4-10-5数量级,整个检测时间在4h以内。并分别用多重PCR和单项PCR/ RT-PCR检测60份临床病料,符合率为100%,表明该检测方法可以用于临床病料的检测,具有较大的应用价值,可广泛应用于临床检验。3.基因芯片检测方法根据GenBank中已发表的PRRSV、CSFV和PCV-2的病毒基因序列,设计合成特异性引物和特异性较强的60mer左右的寡核苷酸探针,并将探针按所设计阵列固定于表面经氨基化修饰的玻片上,制备出寡核苷酸芯片。然后进行引物标记及特异性验证,在此基础上建立了带标记引物的多重PCR检测体系,从而产生大量可与寡核苷酸探针特异性互补的带标记的DNA片段。将标有荧光染料的扩增产物与芯片上寡核营酸探针杂交,扫描、分析芯片上荧光信号。试验结果表明,芯片上各样本对应探针位点呈现阳性荧光信号,而阴性对照和空白对照则基本不能检测到荧光信号。并分别用基因芯片检测方法和PCR/RT-PCR检测60份临床病料,两者符合率高达92%,结果表明该检测技术能够用于临床病料的检测及快速诊断PRRSV、CSFV和PCV-2。
牟贤波[3]2012年在《磁富集多重PCR扩增技术及其应用》文中提出聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）由于其特异性强、灵敏度高、快速简便等优点，一直是生命科学领域一种重要的研究手段。增强其特异性，提高其灵敏度，是PCR技术研究的重点。我们制备了平均粒径为15nm的γ-Fe_2O_3磁性纳米粒子，并对其进行链霉亲和素修饰。实验证明链霉亲和素修饰的γ-Fe_2O_3磁性纳米粒子具有良好的生物活性，可以进一步用于生物检测。我们将磁性纳米粒子γ-Fe_2O_3和多重PCR技术相结合，进行了磁富集多重PCR扩增，以增强其特异性，提高检测灵敏度。首先我们对该方法的可行性进行分析，进行了磁富集靶序列单重PCR扩增。在这一实验过程中，先将生物素修饰的特异性引物和靶序列杂交，然后通过链霉亲和素修饰的磁性纳米粒子γ-Fe_2O_3将其富集到表面，通过变性获取单链靶序列，再使用目的序列的扩增引物进行PCR扩增。通过对实验条件的优化，我们得到靶序列和特异性引物杂交的最适温度为52.5℃，链霉亲和素修饰的磁性纳米粒子γ-Fe_2O_3的最佳用量为90μg，该方法对靶序列检测的灵敏度为5×10-10ng/μL。确定了该方法的可行性。然后我们设计了AGT基因M235T位点和A-6G位点，MTHFR基因A1298C位点和C677T位点的扩增引物，在磁富集单重PCR的基础之上，对这四个位点进行磁富集多重PCR扩增，并优化了扩增条件。通过优化实验我们得到，这四个位点的磁富集多重PCR的退火温度为56℃，在30μL扩增体系中，25mmol/L的Mg2+用量为2.0μL，10μmol/L的dNTP用量为1.5μL，5U/μL的Taq酶用量为0.7μL，10mmol/L的四个位点引物的用量分别为：C677T1μL、M235T0.7μL、A1298C1μL、A-6G1.5μL。同时得到这四个位点的磁富集多重PCR扩增的灵敏度为5×10-9ng/μL。最后，结合通用引物PCR技术和基因芯片技术，对磁富集多重PCR扩增方法在这四个位点的SNP分型上进行了初步应用研究。
李海燕[4]2010年在《纳米金复合探针结合基因芯片在鉴别结核分枝杆菌中的应用》文中研究指明结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,简称结核杆菌)引起的经呼吸道传播的全身性慢性传染病,其在全球广泛流行,严重危害人类健康,已成为全球重大公共卫生问题和社会问题。因此,建立快速、高效、特异的检测结核分枝杆菌新方法势在必行。近几年来,核酸检测中应用纳米金颗粒替代目前通用的荧光、同位素等信号分子已比较普遍。大量实验表明,纳米金复合探针因具有稳定性高、标记密度高和杂交效率高等特点而广泛用于核酸检测。因此,本研究将纳米技术与基因芯片技术有机结合在一起,在此基础上建立了两种目视化核酸检测新方法,即基因芯片膜转印检测法与基因芯片交联放大银染检测法,为分子生物学领域提供了快速、简便、高灵敏度的检测病原细菌新方法。本实验室采用经典柠檬酸叁钠还原氯金酸法制备纳米金颗粒。基于纳米金颗粒与巯基修饰的寡核苷酸共价结合作用及与蛋白分子的吸附作用,我们构建了不同种类的纳米金复合探针,并且通过透射电子显微镜(TEM)和紫外吸收光谱对纳米金颗粒及纳米金复合探针进行形貌观察和表征分析。本研究首先利用碱基互补配对原则使纳米金复合探针与靶DNA分子在芯片表面形成夹心复合结构,再用膜转印法或银染法将芯片上不易观察的结果信号转化成易检测信号,最后通过普通光学扫描仪读取信号结果或肉眼直接判读信号有无来判断靶DNA的有无。结果表明,透射电子显微镜观察所制备的纳米金颗粒,其粒径为(13±2)nm,形貌呈球形,大小均匀,分散良好；制备的纳米金复合探针形态完好,分散均匀,稳定性好。通过紫外分光光度计在521 nm处的吸光度计算出所制备纳米金溶液的浓度为12.5 nmol／L。当纳米金颗粒表面信号探针与检测探针摩尔比为10：1,两种信号探针(T10,T40)摩尔比为9：1时,运用基因芯片膜转印检测法肉眼可检测0.23 pmol／L的结核分枝杆菌16S rDNA PCR扩增产物或1 pmol／L的合成靶DNA分子。在优化交联纳米金复合探针使用量和银染增强时间条件下,基因芯片交联放大银染检测法可肉眼检测10 fmol／L的合成靶DNA。以上实验结果显示,运用纳米金复合探针结合基因芯片技术的两种核酸检测新方法,具有操作简单,灵敏度高,特异性好和无需特殊仪器设备等特点。通过运用纳米金复合探针不仅利于杂交反应,而且通过标记不同的标记物,将基因芯片上不易检测的结果信号转化为可目视化检测的信号。因此,基因芯片膜转印检测法与基因芯片交联放大银染检测法均是较好的结核分枝杆菌检测新方法,在生物分子检测方面具有较高的应用价值。
万志香[5]2005年在《应用DNA-纳米金探针的目视化甲型肝炎病毒检测基因芯片的研究》文中研究说明甲型肝炎病毒(HAV)分布于全世界,是一种主要的急性传染性肝炎。HAV属于细小RNA病毒,它的基因为单股正链RNA。甲型肝炎病毒的传播途径简单,主要为粪—口途径。人们常通过不洁饮食,饮水和生活接触感染,因此,有必要发展特异和高效的检测方法来检测临床和生物HAV标本。 基因芯片技术具有高特异性、高灵敏度、高通量的特点,为临床和环境检测提供了良好的应用前景。目前通用的基因芯片技术有多种,但分别都存在着或者灵敏度不高,或者检测技术复杂,或者条件和设备要求高的问题限制了该技术在临床检测中的应用。 本实验室将芯片技术和纳米技术的有机结合在一起,以充分利用纳米金与银反应可将信号放大10~6倍的优势,建立了应用纳米金探针的目视化HAV基因芯片技术。近几年来,应用纳米金标记代替目前通用的荧光、同位素、酶标等信号报告材料在核酸检测中比较普遍。许多实验表明,纳米金将会是个很好的标记替代物,并且DNA-纳米金探针由于其具有高稳定性,高标记密度与及高敏感性会特别适合于核酸检测基因芯片的应用。 目视化纳米金探针HAV检测基因芯片技术的主要原理是:3’端-SH基修饰的寡核苷酸与纳米金颗粒标记作为检测探针,5’端-NH_2修饰的寡核苷酸基因探针与硅烷化玻片共价连接作为捕获探针。捕获探针按预先设计的阵列点样在处理好的玻璃基片上,再与待检测的HAV扩增目的核酸片段以及检测探针以双探针夹心方式杂交,再进一步进行银染加强显色,用肉眼观察或用平面扫描仪分析结果。
徐李舟[6]2016年在《基于量子点的荧光生物与化学传感器及其食品安全快速检测应用》文中研究说明食品安全是全球公共性卫生安全问题,直接关系民生。近年来,食品安全恶性事件频发,食品安全问题逐渐成为社会焦点。在全球范围内,由食品安全引起的问题和疾病,不仅造成严重的经济损失,而且极大地危害了人们的生活健康水平,因此研究食品安全快速、准确的检测方法,以预防和控制危害事件的发生,具有重要的现实意义和社会价值。生物与化学传感器,是一个活跃的科学研究和工程技术领域,它共享生物学、化学、免疫学、物理学、电子学、材料学、信息学、以及微机电系统(MEMS)等学科,处在生命科学和信息科学的交叉区域。生物与化学传感器具有高选择性、高准确性、分析快捷、操作简单等优点,是一种先进的检测技术与方法。作为常用的光学检测手段之一,荧光检测灵敏、快速、便捷,检测仪器设备成熟,已被广泛应用于各类检测方法和仪器设备的科研开发中。纳米材料发展于20世纪80年代,具有独特的物理化学特性与广阔的应用前景,因而享有广泛美誉。纳米技术与材料应用于生物传感器的研发,将带来新的发展契机,创造更为广阔的应用空间。量子点(Quantum Dots, QDs)是一种新兴的纳米发光材料,常作为荧光标记物被广泛用于生物传感和细胞成像；同时它又是一种半导体的纳米晶粒,由于其具有独特的性质,比如尺寸可调、光学信号强、荧光量子产率高、光学性质稳定等,近年来在生物传感领域备受青睐。本论文将纳米技术与光学检测传感技术相结合,开发新型的生物／化学传感器,综合运用各学科不断进步的技术优势以提升其性能,并应用于食品安全快速检测领域。本文主要研究内容、结果和结论如下：(1)用于快速检测食用油掺假的功能化水溶性量子点荧光淬灭传感器针对劣质食用油掺假问题,特开展利用纳米生化传感检测的方法,对其进行快速鉴别。选用量子点作为纳米荧光探针,当加入被测物一“地沟油”勾兑的劣质食用油时,被测物中某些成分如重金属离子、有机小分子、碳碳共轭双键(C=C)、吸电子基团、自由基等(淬灭剂)可以淬灭量子点的荧光。不同掺杂比例的劣质食用油中含有不同浓度的淬灭剂,从而引起不同程度的荧光淬灭,宏观上表现出不同的荧光强度,由此建立淬灭率与劣质食用油中“地沟油”掺杂比例之间的定量关系。模拟人工勾兑方法,将毛“地沟油”以0.4、2、6、10%的比例掺入某合格食用植物油中,配制成不同掺杂比例的劣质食用油,然后用量子点荧光淬灭法鉴别劣质食用油。结果发现劣质食用油对量子点荧光的淬灭率随着其掺杂浓度的增加而增大。将不同劣质食用油对量子点荧光的淬灭率与掺杂比例作图,可以发现两者之间呈现较好的线性关系(y=5.96x+14.99；R2=0.94)。因此,该基于功能化水溶性量子点荧光淬灭传感器可在2 min内对掺假0.4%及以上的劣质食用油进行快速鉴别,具有很大的现场应用前景。(2) 用于于-快速检测禽流感病毒的基于于-DNA智能响应水凝胶的荧光适配体传感器建立了一种基于智能响应水凝胶的快速检测禽流感病毒H5N1的荧光适配体传感器。选择对禽流感病毒H5N1具有高亲和力的DNA核酸适配体作为生物识别元件,通过对其5’末端修饰丙烯酰胺基(Acrydite),对其3’末端修饰修饰荧光淬灭基团Iowa Black(?) RQ,进行功能化修饰；针对性设计可与核酸适配体序列互补的单链DNA1和单链DNA2,并在单链DNA1的5’末端修饰丙烯酰胺基,在单链DNA2的5’末端修饰荧光量子点；丙烯酰胺基修饰的DNA链在引发剂的催化下能够聚合形成含有多条DNA支链的聚丙烯酰胺链；核酸适配体与单链DNA1之间的碱基互补配对发挥了交联剂的作用,使两种聚合物链相互连接,从而形成水凝胶；当不存在目标病毒时,由于DNA链之间的杂交作用,凝胶处于收缩状态,量子点由于距离淬灭剂很近其荧光被淬灭；而当存在目标病毒时,适配体与目标病毒的结合导致DNA链之间的杂交被分解,使得凝胶溶胀,造成量子点与淬灭剂之间的距离增大,从而量子点荧光被恢复。结果表明该荧光适配体传感器的检测时间小于30min,最低检测限为0.2 HAU,线性范围为2-2.3 to 26 HAU/20μL-1。因此,所研究的简便、廉价、高特异性的适配体传感器在现场快速检测禽流感病毒H5N1中具有较大的应用前景。(3)用-于-同时检测四种食源性致病菌的结合免疫纳米磁分离的荧光生物传感器及便携式荧光生化快速检测仪的现场应用在食源性致病菌的检测中,同时检测多元细菌具有很大的需求和发展潜力。本课题结合免疫纳米磁分离技术作为样品分离和富集手段,利用纳米荧光量子点作为荧光信号报告分子,研究了一种快速、专一的可同时分离和定量检测大肠杆菌O157：H7、单增李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌等四种食源性致病菌的荧光适配体传感器。本文采用可查文献中粒径最小(25 nm)的纳米磁珠,其分别交联四种特异性抗体后可在45 min内从复杂食品基质中同时捕获四种目标细菌,并在磁场作用下实现同时分离。将四种不同的链霉亲合素修饰的量子点分别交联上生物素化的特异性核酸适配体,用于对目标细菌的荧光标记。通过便携式荧光光谱仪读取荧光信号,从不同的荧光发射波长可以定性地判断不同的目标细菌,而从荧光强度则可定量反应多种目标细菌的浓度,从而实现同时检测。扫描电子显微镜和荧光共聚焦显微镜用于表征免疫磁珠捕获到的细菌和“磁珠-细菌-量子点”的“叁明治”结构。通过有限元分析,模拟了磁场的特性,并建立了免疫磁珠捕获细菌进行磁分离的数学模型。结果表明,对大肠杆菌0157：H7、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌和鼠伤寒沙门氏菌的磁分离效率分别达到90.4%、87.5%、92.0%和92.0%,在纯培养物中的方法检测限分别达到80、100、47和160 CFU/mL,在牛肉样品中的方法检测限为320、350、110和750 CFU/mL。本文研究的适配体荧光传感器能够在2.5 h内对10’至104 CFU/mL的四种食源性致病菌进行同时分离富集和定量检测,展示了该技术在致病微生物多元检测现场应用中的极大潜力。另外,针对沙门氏菌、大肠杆菌、李斯特菌等常见食源性致病菌,选取具有高度特异性和灵敏度的抗体制备生物传感材料,结合免疫纳米磁分离技术,利用所研究的可同时快速分离和检测多元食源性致病菌的荧光生物传感方法,对食品中常见的致病菌进行检测,验证了合作单位研制的病原菌检测用便携式荧光生物传感检测仪器的可行性。纳米磁珠分别交联叁种特异性抗体后可同时捕获目标细菌,在磁场作用下实现同时分离。将分离物分别标记上叁种偶联有抗体的荧光量子点,即可进行荧光信号的读取,从而实现了对多种目标细菌的同时快速检测。采用该仪器检测,总检测时间(定义为取样前期处理一直到测定结果读出的时间总和)少于60 min。应用此技术,可实现肉品、蔬菜、水产品等食品在物流与销售过程中的现场、在线监测和快速预警,将有效避免致病菌感染等危险食品安全事件的发生,有效提高食品安全水平。
参考文献：
[1]. 纳米金新型基因芯片检测系统的优化研究及其在临床病原微生物快速检测中的应用[D]. 顾大勇. 第叁军医大学. 2004
[2]. PRRSV、CSFV和PCV-2多重PCR诊断方法及基因芯片诊断方法的建立[D]. 叶芬. 西南大学. 2011
[3]. 磁富集多重PCR扩增技术及其应用[D]. 牟贤波. 湖南工业大学. 2012
[4]. 纳米金复合探针结合基因芯片在鉴别结核分枝杆菌中的应用[D]. 李海燕. 华东师范大学. 2010
[5]. 应用DNA-纳米金探针的目视化甲型肝炎病毒检测基因芯片的研究[D]. 万志香. 武汉大学. 2005
[6]. 基于量子点的荧光生物与化学传感器及其食品安全快速检测应用[D]. 徐李舟. 浙江大学. 2016
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