·论 著·
血液中20种芬太尼类物质UPLC-MS/MS法的建立及应用
施妍，强火生，刘伟，向平，沈保华，沈敏
（司法鉴定科学研究院 上海市法医学重点实验室 上海市司法鉴定专业技术服务平台，上海 200063）
摘 要： 目的 建立同时分析血液中20种芬太尼类物质的超高效液相色谱-串联质谱（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）快速测定方法。方法 以芬太尼-D5为内标，血液经液液萃取后用ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱分离，采用多反应监测模式同时测定20种芬太尼类物质。结果 各化合物的检出限为0.02～0.03ng/mL，定量限为0.05～0.2ng/mL。在0.05～40ng/mL质量浓度范围内，20种芬太尼物质均具有良好的线性关系，相关系数大于0.99。方法准确度为87.69%～114.68%，提取回收率为85.35%～101.80%，无明显基质效应。运用所建方法检测注射舒芬太尼后大鼠血液中的舒芬太尼，注射后10h在大鼠血液中仍能检出舒芬太尼。结论 该方法前处理简单、灵敏度高、选择性好，可用于法医毒物分析中芬太尼类物质的测定。
关键词： 法医毒理学；芬太尼类；超高效液相色谱-串联质谱；血液
芬太尼（fentanyl）是一种短效、合成阿片类药物，于1960年由比利时科学家Paul Janssen首次合成，其镇痛效果约为吗啡的100倍[1-4]。随后，Paul Janssen在对芬太尼结构-活性关系进行研究后，开发了一系列芬太尼类似物。由于芬太尼及其类似物镇痛效果好，且容易获得，开发不久后就发生了滥用情况，甚至作为毒品使用。芬太尼类物质通常被掺杂在海洛因等毒品中混合使用，但由于芬太尼类物质存在呼吸抑制等不良反应，大大增加了致死风险[5-8]。近几年，芬太尼类物质的更新速度很快，各种新型芬太尼类物质不断出现。在20世纪80年代，α-甲基芬太尼和3-甲基芬太尼出现在毒品市场上，此时还出现了一些其他芬太尼类似物，如对-氟芬太尼、β-羟基芬太尼以及麻醉效果极强的卡芬太尼。芬太尼的衍生物3-甲基芬太尼的作用和毒性较海洛因强1000倍，几毫克即可致命[9]。而卡芬太尼的效能约为吗啡的10000倍，是目前世界上最强效的阿片类药物，规定只能用于大型动物麻醉和制动[6]。2010年后，芬太尼类物质滥用出现新的高峰，乙酰芬太尼、丁酰基芬太尼、β-羟基硫代芬太尼和呋喃芬太尼等多种芬太尼类似物均出现滥用情况[9]。2017年，甲氧乙酰芬太尼和环丙基芬太尼也在案例中被检出[10-12]。
假人盛行，虚伪就有了市场。什么诚实，什么道德，都成了纸做的。假人们表面做一套，背后却是另外一套。用《红楼梦》里的话说，台上握手，台下踢腿；明是一盆火，暗是一把刀；脸上一脸笑，脚下使绊子。他们口是心非，却总是扮演好人的角色，但是实际上根本不是好人。他们很会顺杆子爬，很会巧言令色，很会讨人喜欢，每每作出种种看似很真的假象，其实都是为了不可告人的目的。譬如，某一天，他突然对你恭敬起来，那是因为他发现了你的“价值”。用得着你，你就是亲人，乃至厚颜无耻地喊你亲爸亲妈；一旦你没有了价值，立马翻脸，你在他眼里，一条狗都不如。某日，他会突然冷淡你，与其他利益寄居体重新交好。原因是，你失势，没有价值了。
芬太尼类物质滥用情况严重且致死率高，这对各国公共卫生安全造成了严重威胁。据统计，2012—2014年美国约7100例与海洛因相关的死亡案例中，有41%涉及芬太尼[13]。2015年，美国疾病控制中心（Centers for Disease Control，CDC）报道了近10000例与芬太尼类似物相关的死亡案例，比2014年增加了72%[14]。在我国，芬太尼类物质的生产和走私也呈上升趋势，2016年发现的芬太尼类物质有66份，但在2012—2015年总计仅发现6份[15]。随着全球范围特别是北美地区芬太尼及其衍生物滥用导致死亡人数的急剧增加，对于芬太尼类新精神活性物质滥用的鉴定和打击预防是当前司法鉴定领域的重要任务。目前，我国列管的芬太尼类物质已有25种，超过联合国列管的21种。在2018年12月1日中美元首会晤后，两国就禁毒合作达成共识。中方决定对芬太尼类物质进行整类列管，将芬太尼类物质指定为一种受控物质。
近年来，已有文献报道在全血[11，16]、尿样[17]、毛发[18-22]、唾液[23-25]以及干血点[26-27]等生物基质中对芬太尼类物质进行分析，分析方法主要为液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）法[28-29]和气相色谱-串联质谱（gas chromatography-tandem mass spectrometry，GC-MS/MS）法[30]。但这些方法中多数仅能分析几种芬太尼类物质，用血量大且耗时长。超高效液相色谱-串联质谱（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）法能在短时间内实现多种目标物的分离分析。因此，本研究拟采用UPLC-MS/MS法对全血中20种芬太尼类物质进行检测，旨在建立简单、快速、灵敏的芬太尼类物质筛选方法，并将其应用于实际案例。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
QTRAP®6500三重四极杆线性离子阱复合质谱系统（美国AB SCIEX公司），ACQUITY UPLC I-Class系统（美国Waters公司），SB-2200-T超声波清洗仪（美国Branson公司），BSA124S电子天平［赛多利斯科学仪器（北京）有限公司］，MD200-2氮吹仪（杭州奥盛仪器有限公司），Milli-Q超纯水系统（美国Millipore公司），XW-80A涡旋混合器（上海医科大学仪器厂），TDZ4-WS离心机（湖南赛特湘仪离心机仪器有限公司），MiniSpin高速离心机（德国Eppendorf公司）。
“根据历史资料，我们按1：150的比例，还原了清朝北洋水师和日本联合舰队的军舰，并在清华大学附属小学同学们的帮助下，进行了累计20次的模拟海战。最后的结果是：北洋水师败北17次，仅胜出3次。”詹寻叹了口气。
芬太尼（fentanyl）、阿芬太尼（alfentanil）、去丙酰基芬太尼［N-phenyl-1-（2-phenylethyl）-4-piperidinamine，4-ANPP］、丙烯酰芬太尼（acrylfentanyl）、丁酰芬太尼（butyrylfentanyl）、异丁酰芬太尼（isobutyryl fentanyl）、3-甲基芬太尼（3-methylfentanyl）、对-氟芬太尼（parafluorofentanyl）、β-羟基硫代芬太尼（β-hydroxythiofentanyl）、戊酰芬太尼（valerylfentanyl）、对-氟丁酰芬太尼［para-fluorobutyryl fentanyl（PFBF）］、4-氟异丁酰芬太尼（4-fluoroisobutyrlfentanyl）、奥芬太尼（ocfentanil）、呋喃芬太尼（furanylfentanyl）、瑞芬太尼（remifentanil）、舒芬太尼（sufentanil）、卡芬太尼（carfentanil）、乙酰芬太尼（acetylfentanyl）、甲氧乙酰芬太尼（methyoxyacetyl fentanyl）、环丙基芬太尼（cyclopropylfentanyl）、芬太尼-D5（fentanyl-D5，作为内标）均购自美国Cerilliant公司。其中芬太尼及阿芬太尼对照品质量浓度为1 mg/mL，其他对照品质量浓度均为100 μg/mL。甲醇、乙腈购自美国Sigma-Aldrich公司，乙酸铵（色谱纯）、98%甲酸（优级纯）购自瑞士Fluka公司，其他试剂均为分析纯，去离子水由Milli-Q超纯水系统制得。
台式烤香肠的加工工艺在预实验的基础上，选取大豆组织蛋白、玉米变性淀粉、孜然粉进行三因素三水平的正交试验，将模糊数学评价归一化后结果的各个量分别乘以其对应的分值，并进行加和得出每个样品的总得分，得分结果见表4。
阿东说：“先起来好不好？我带你到东湖去玩。”阿里还是叫道：“我要姆妈。”阿东说：“你光要姆妈，你未必不要爸爸？”
1.2 溶液配制
1.4.2 色谱条件
采用行业公认的方法有效性验证体系[31]，包括选择性、检出限（limit of detection，LOD）、定量限（limit of quantitation，LOQ）、线性范围、准确度和精密度。提取回收率和基质效应参考MATUSZEWSKI等[32]提出的方法。
4 根据《著作权法》，并结合本刊具体情况，凡来稿在3个月内未接到稿件处理通知者，系仍在审理中。作者如欲投他刊，请先与本刊联系，切勿一稿两投。
1.3 样品处理
取抗凝全血样品100 μL置于2 mL离心管中，精确加入100ng/mL的芬太尼-D510μL，混合10s，加入硼砂缓冲溶液（pH=9.2）100μL、乙酸乙酯0.7mL，涡旋30 s，以9 700×g离心5 min。取上层有机相置于5 mL离心管中，40℃下吹干。加入流动相A 200 μL复溶，以1249×g离心5min，取上清液100μL装入进样小瓶内衬管中供UPLC-MS/MS分析。
1.4 仪器条件
1.4.1 质谱条件
电喷雾离子源采用正离子模式（ESI+），离子喷射电压5 500 V，碰撞气7 psi，气帘气30 psi，雾化气40psi，辅助气40psi，离子源温度为500℃。采用多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）模式，各化合物参数见表1，选用两对母离子/子离子进行定性分析，其中响应较高的第一对离子为定量离子对。
表1 20种芬太尼类物质及内标的质谱参数和保留时间
取各化合物对照品适量，用甲醇配制成质量浓度为2 μg/mL的混合对照品溶液。用甲醇逐级稀释成质量浓度为1000、200、100、10、1ng/mL的工作液。
由于用地形状、空间尺度、建筑造型等外在形式的需要决定的建筑语言最终呈现的结果，体现了形式逻辑对建筑语言的影响。庭园大门前的通道位于两个轴网系统的交接处，通道的形状不规则，通道的两端宽窄不一致。为了改善大小不一致的视觉感受，本来不规则的通道空间被划分成3个部分，中间的步道保持等宽，通道两边设置了不规则的花池，花池里再植上崖州竹与棕葵（图15）。这在很大程度上掩饰了不规则的通道形状，使身处其中的游览者并不容易察觉通道空间的真实形状。
1.5.4 提取回收率和基质效应
1.5 方法学验证
取芬太尼-D5适量，加甲醇配制成质量浓度为10μg/mL的对照品溶液，再用甲醇稀释成质量浓度为100ng/mL的工作液。
表2 梯度洗脱程序 （%）
1.5.1 选择性
分别对10个不同来源的空白全血样品按已建立的方法进行分析，考察全血中内源性物质对20种目标物是否有干扰。
1.5.2 LOD、LOQ和线性
取空白血1.0mL，加入20种目标物的混合对照品工作液，配制成质量浓度为0.05、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00、20.00、30.00、40.00ng/mL的全血样品。取全血样品100μL，按1.3节方法处理、分析。以每个目标物全血质量浓度为横坐标（x），目标物与芬太尼-D5的峰面积比值为纵坐标（y），采用加权（权重系数为1/x）最小二乘法进行回归，求得线性方程。以信噪比（S/N）大于3的质量浓度为LOD，以信噪比（S/N）大于10、精密度相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）小于20%且准确度在80%～120%的质量浓度为LOQ。
1.5.3 准确度和精密度
取空白血1.0mL，加入20种目标物的混合对照品工作液，配制成质量浓度为0.2、0.5、5.0、30.0ng/mL的全血样品。取全血样品100μL，每个质量浓度点6份样品，按所建立的方法进行处理、进样，计算日内精密度和准确度。连续进样4d，计算日间精密度和准确度。
色谱柱为ACQUITY UPLC HSS T3柱（100 mm×2.1mm，1.8μm，美国Waters公司），柱温为室温；流动相A为20mmol/L乙酸铵缓冲溶液（含0.1%甲酸和5%乙腈），流动相B为乙腈；流速为0.3mL/min。采用梯度洗脱，洗脱程序见表2。进样量为5μL。
选取低（芬太尼为0.5ng/mL，其他为0.2ng/mL）、中（5.0 ng/mL）、高（30.0 ng/mL）3个质量浓度的全血样品，按1.3节方法处理后进样的峰面积设为A，空白样品按1.3节方法处理后，加入相应质量浓度的对照品溶液进样后的峰面积设为B，对照品溶液吹干复溶后进样的峰面积设为C，提取回收率=A/B×100%，基质效应=B/C×100%。
1.6 动物实验
SD大鼠4只，雌雄各2只，体质量190～230 g，自尾静脉注射舒芬太尼，给药剂量为10μg/kg。于给药后2、5、10、15、30、45、60min以及1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、6.0、10.0、12.0、16.0、24.0 h眼眶取血约0.3 mL。取血液0.1mL按照1.3节进行前处理，取100μL进样分析。
本研究比较了不同样品前处理方法（蛋白沉淀和液液萃取）的回收率。在0.1 mL空白全血中添加20种目标物的混合对照品工作液，配置成质量浓度为5 ng/mL的全血样品，分别用蛋白沉淀和液液萃取法进行前处理。蛋白沉淀法为0.1 mL全血加入0.9 mL乙腈，取上清液吹干后用0.1 mL流动相A复溶后进样；液液萃取法分别考察了乙醚和乙酸乙酯两种提取溶剂，取0.1mL全血，加入0.1mL硼砂缓冲溶液（pH=9.2），再加入0.7 mL乙醚或乙酸乙酯进行提取，提取液吹干后用0.1mL流动相A复溶后进样。
2 结果与讨论
2.1 方法优化
观察组58例中，临床痊愈14例，显效21例，有效19例，无效4例，总有效率为93.10%；对照组58例中，临床痊愈10例，显效17例，有效18例，无效13例，总有效率为77.59%，观察组明显优于对照组，两组效果比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。
全血经乙腈沉淀蛋白后提取回收率为47.76%～63.64%，经乙醚液液萃取后提取回收率为54.33%～57.21%，而经乙酸乙酯液液萃取后提取回收率均大于80%。结果表明，用乙酸乙酯液液萃取的提取效率较高。因此本实验最终选择乙酸乙酯作为液液萃取的提取溶剂。
硼砂缓冲溶液：取硼砂适量，置于250mL容量瓶中，加去离子水至刻度，配制pH=9.2的缓冲溶液。
2.2 方法学验证
2.2.1 选择性
中国教师：“书自香我何须花”，阅读已经成为您生活中必不可缺的部分，我们知道您平时公务繁忙，那么您是怎么平衡工作和阅读的？请与我们的一线教师分享一些您的阅读心得。
10份空白全血样品经处理后，内源性物质不干扰目标物测定。
2.2.2 LOD、LOQ和线性
各目标物LOD、LOQ和线性结果如表3。各目标物在质量浓度为LOQ时的色谱图见图1。结果表明，全血样品中20种目标物在相应的浓度范围内线性良好，相关系数（r）＞0.99。20种目标物的LOD为0.01～0.03ng/mL，LOQ为0.05～0.20ng/mL，可以满足工作实践中的检测需要。
表3 20种目标物LOD、LOQ和线性范围
续表3
图1 各目标物在质量浓度为LOQ时的色谱图（内标质量浓度为10ng/mL）
2.2.3 准确度和精密度
各目标物的精密度和准确度结果见表4。本方法日内精密度和日间精密度分别为3.02%～11.92%、4.50%～14.24%，均在±15%之内；准确度为87.69%～114.68%，均在85%～115%。上述结果表明该方法精密度和准确度良好。
Seyfort Ruegg 1981: David Seyfort Ruegg, The Literature of the Madhyamaka School of Philosophy in India, Wiesbaden: Otto Harrassowitz.
2.2.4 提取回收率和基质效应
本方法的提取回收率和基质效应结果见表4。结果表明，各目标物经本方法提取后，提取回收率为85.35%～101.80%，表明经乙酸乙酯提取后可达到比较满意的提取效率。基质效应为79.96%～111.40%，说明本方法无明显基质影响。
2.3 动物实验
运用所建方法检测注射舒芬太尼后SD大鼠血液中的舒芬太尼。结果显示，在注射舒芬太尼后2min，大鼠血液中即可检测出舒芬太尼，平均血药质量浓度为1.26ng/mL，说明所建方法适用于实际样品中舒芬太尼的检测分析。大鼠血液中舒芬太尼质量浓度峰值出现在注射后5～10 min，平均血药质量浓度为1.72ng/mL。注射后10h在大鼠血液中仍能检测出舒芬太尼，12h之后大鼠血液中舒芬太尼质量浓度低于LOD。舒芬太尼注射后起效快，持续时间较芬太尼长，与文献[9]报道相符。大鼠静脉注射舒芬太尼（10μg/kg）后全血中舒芬太尼的浓度-时间曲线见图2。
表4 各目标物的精密度、准确度、回收率和基质效应 （%）
续表4
图2 大鼠静脉注射舒芬太尼（10μg/kg）后全血中舒芬太尼的浓度-时间曲线
3 结 论
本研究建立了UPLC-MS/MS法同时测定全血中20种芬太尼类似物，在8min内完成了对各化合物的分析测定。该方法前处理简单、灵敏度高、选择性好，适用于实际样品的检测分析。运用所建方法检测注射舒芬太尼后SD大鼠血液中的舒芬太尼，注射后10h在大鼠血液中仍能检测出舒芬太尼。
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Establishment and Its Application of UPLC-MS/MS Method for 20 Fentanyl-related Substances in Blood
SHI Yan,QIANG Huo-sheng,LIU Wei,XIANG Ping,SHEN Bao-hua,SHEN Min
（Shanghai Key Laboratory of Forensic Medicine,Shanghai Forensic Service Platform,Academy of Forensic Science,Shanghai 200063,China）
Abstract： Objective To establish an ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（UPLC-MS/MS）rapid determination method for simultaneous analysis of 20 fentanyl-related substances in blood.Methods With fentanyl-D5as an internal standard,the blood was extracted by liquid-liquid extraction（LLE）,then separated with an ACQUITY UPLC HSS T3chromatographic column,and finally 20 fentanyl-related substances were simultaneously analyzed with multiple reaction monitoring（MRM）mode.Results The limits of detection（LOD）of all compounds were 0.02-0.03 ng/mL,and the limits of quantitation（LOQ） were 0.05-0.2 ng/mL.Within the mass concentration range of 0.05-40 ng/mL,20 fentanyl-related substances had a good linear relationship,and correlation coefficients were larger than 0.99.The accuracy of the method was 87.69%-114.68%and the extraction recovery rate was 85.35%-101.80%,and no significant matrix effect was observed.The established method was successfully applied to the detection of sufentanil in rat blood after sufentanil was injected.Sufentanil could still be detected in blood of rats 10 h after sufentanil injection.Conclusion The established method has the advantages of simple pretreatment,high sensitivity and good selectivity,and can be used for the determination of fentanyl-related substances in forensic toxicology analysis.
Keywords： forensic toxicology；fentanyl analogues；ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry；blood
中图分类号： DF795.1
文献标志码： A
doi： 10.12116/j.issn.1004-5619.2019.04.006
文章编号： 1004-5619（2019）04-0411-08
基金项目： “十三五”国家重点研发计划资助项目（2016YFC0800704）；中央科研院所青年推进项目（2019G-4）；国家自然科学基金资助项目（81501633，81971789）；上海市法医学重点实验室资助项目（17DZ2273200）；上海市司法鉴定专业技术服务平台资助项目（19DZ2292700）；上海市法医学重点实验室开放课题资助项目（KF1806）
作者简介： 施妍（1984—），女，博士，副研究员，主要从事体内滥用物质的鉴定研究；E-mail：shiy@ssfjd.cn
通信作者： 沈敏，女，研究员，主要从事体内滥用物质的鉴定及体内代谢研究；E-mail：shenm@ssfjd.cn
通信作者： 沈保华，男，硕士，主任法医师，主要从事体内滥用物质的鉴定研究；E-mail：shenbh@ssfjd.cn
（收稿日期 ：2019-01-31）
（本文编辑：严慧）
标签：法医毒理学论文; 芬太尼类论文; 超高效液相色谱-串联质谱论文; 血液论文; 司法鉴定科学研究院上海市法医学重点实验室上海市司法鉴定专业技术服务平台论文;