袁媛[1]2004年在《蜜环菌睡眠调节活性菌株筛选及液体深层发酵技术研究》文中研究指明蜜环茵[Armillaria mellea(vahl ex Fr．)Quel]是与传统中药天麻(Gastrodia elata Blume)共生的着名食药兼用真菌。天麻是我国重要的中草药之一，对多种疾病有较好的治疗效果。近年来的研究还发现天麻具有增智、健脑、延缓衰老的作用，对老年性痴呆症还有一定疗效。经大量的研究试验证明，蜜环茵的菌丝体和发酵液均具有与天麻相似的药理作用和临床疗效。由于野生天麻在我国的资源有限，栽培天麻虽已获得成功，但受自然条件的影响，其生长周期很长，难以完全满足临床用药的需要，所以以蜜环茵代替天麻则为一条行之有效的资源开发之路。蜜环菌中含有丰富的化学成分，通过对蜜环菌菌丝体化学成分的系统研究，分离得到了蜜环菌多糖、倍半萜类化合物和嘌呤类化合物等多种活性物质并对这些化合物的理化特性和生物学活性进行较细致的研究。经功能性实验证明，蜜环菌具有较强的神经调节功能，有明显的催眠镇静作用，抗惊厥作用，并可显着提高机体免疫功能。虽然蜜环菌中含有多种成分，但是对每一种成分的具体功能还不是很清楚，对蜜环菌具体起药效的部位也不是很明确，这就为我们充分开发利用蜜环菌资源提供了广阔的空间。 食用菌的液体深层发酵是现今食用茵研究的一个新途径，它与固体发酵相比，具有生产规模大，产量高，发酵周期短，生产效率高，可以进行工业化生产等诸多优点，利用蜜环菌菌株进行液体深层发酵可以获得大量的茵丝体及发酵液，提取其中的有效成分用于功能性食品开发及制药工业。因此无论从生产规模、生产速度和经济效益看，食用菌的深层发酵都具有很大发展空间。 本研究作为吉林省科技厅“蜜环菌深层发酵技术及其功能性食品研究”立项课题的部分内容主要完成了以下工作，并得出了相应结论： 1．通过动物试验，确定了睡眠调节活性最理想的蜜环菌菌株。 从17株已分离得到的蜜环菌菌株中筛选出8株供试菌株，根据蜜环茵茵丝体及发酵液对小鼠睡眠潜伏期及睡眠时间的试验，并通过与脑心舒生产菌株的阳性对照试验，确定蜜环茵A12为本试验研究的供试菌株。 2．确定了蜜环茵液体摇瓶培养的最适培养基配方及培养条件 通过蜜环菌液体培养碳、氮源筛选，经正交试验及分析，确定了蜜环菌液体培养的最适培养基配方为：马铃薯20％、葡萄糖1％、蔗糖1％、酵母浸粉2％、蚕蛹粉1％、磷酸二氢钾0.15％、硫酸镁0.075％、VB_10.001％；并通过对蜜环菌摇瓶培养条件的筛选，确定了蜜环茵在液体摇瓶培养的最适培养条件为：培养基初始pH值6.0；培养温度27℃；吉林农业大学硕士学位论文蜜环菌睡眠调节活性菌株筛选及液体深层发酵技术研究装液量20。呱/5 oolnL叁角瓶;摇床转速160 r/min;二级菌种培养时间sd;乙醇添加量0 .5%，通过验证试验，此筛选培养基配方及培养条件完全适应蜜环菌生长，菌丝体生物量达到1 .52509/100InIJ，菌体生长状态良好。 3.确定了蜜环菌液体深层发酵的最适培养条件 通过对蜜环菌液体深层发酵条件的正交试验，确定了深层发酵的条件为:发酵罐搅拌速度180r/min;培养温度27℃;培养时间6d，在此条件下得到菌丝体生物量为1 .70509/100呱。 4.初步进行了蜜环菌摇瓶培养及液体深层发酵过程中的发酵动力学研究 通过蜜环菌摇瓶培养及液体深层发酵试验，观察了菌球状态、发酵液颜色，测定了发酵过程中发酵液中各种参数的变化，初步获得了蜜环菌摇瓶培养及液体深层发酵培养的发酵动力学曲线。
刘景圣[2]2005年在《蜜环菌催眠功能优良菌株筛选和发酵工艺优化研究》文中研究说明蜜环菌(Armillaria spp.)属于担子菌门、伞菌目、白蘑科、蜜环菌属。在世界各大洲均有分布，在我国主要分布在黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古等省区。蜜环菌是与传统中草药天麻(Gastrodia elata Blume)共生的着名食药兼用的真菌。多年来，经大量的试验研究表明，蜜环菌的菌丝体和发酵液均具有较强的催眠、抗惊厥、抗缺氧等神经调节功能和脑保护功能，还具有增加心、脑血管血流量，增强机体免疫调节功能等生理活性。尤其是在催眠、抗惊厥、抗缺氧和调节心、脑血管功能等方面具有与天麻相同的药理活性。因此，20世纪70年代开始，在对蜜环茵生理活性和化学成分研究，以及蜜环菌的深层发酵工艺和系列制剂的开发等方面引起了中国和世界许多国家的重视，取得了大量研究成果，开发生产出多种蜜环菌制剂。蜜环菌中含有丰富的化学成分，通过对蜜环菌菌丝体和发酵液的化学成分的系统研究，分离得到了蜜环菌多糖、蜜环菌素等倍半萜类化合物和嘌呤类化合物等多种生理活性物质，并对这些化合物的理化特性和生物学活性进行了较细致的研究。由于野生天麻在我国的资源有限，栽培天麻虽已获得成功，但因受到各种条件影响，其生长周期长，并且必须有蜜环菌作为萌发菌和营养供体，技术要求严格，生产成本高，价格贵，难以满足人们保健和临床用药的需求。以蜜环菌及其发酵产物替代天麻，来解决天麻供应不足，保护野生天麻资源等问题，是一条行之有效的资源开发新途径。多年来，经过科研工作者和医药生产企业的不懈努力，脑心舒口服液、蜜环菌片、蜜环菌糖浆等蜜环菌制剂，在调节睡眠和心、脑血管功能等方面收到了较好疗效。据不完全统计，目前在我国，仅脑心舒口服液的年产值就超过了6亿元以上。但是，脑心舒口服液等蜜环菌制剂的生产，主要以蜜环菌的菌丝体和发酵液为主要原料，没有明确有效部位和活性成分，只能属于叁类药物。而且，用于发酵生产的蜜环菌菌种(菌株)还不统一，发酵工艺技术与控制不规范，发酵产物的产量不高，对蜜环菌发酵产物及其制剂的质量监测指标不明确。这些不利因素，影响了蜜环菌及其制剂的生产开发和质量、药效以及产品层次的进一步提高。本研究是作者主持的吉林省2001年科技发展计划项目“蜜环菌深层发酵工艺及其功能性食品研究”课题的重要组成部分。其主要内容和攻关目标是从长白山野生蜜环菌菌中分离生长性状良好的菌株，通过液体深层发酵特性和动物试验筛选具有催眠功能的优良蜜环菌菌株。在最适的培养基和摇床液体培养条件下扩大培养，将发酵产物利用分离提取等技术手段和动物试验进行有效部位活性跟踪试验，进一步明确蜜环菌发酵产物中催眠功能的有效部位，并以此有效部位的得率为主要指标，进一步优化蜜环菌液体深层发酵的生产工艺，以实现催眠功能提取部位有效得率的最大化。本研究的试验结果和研究结论包括以下几方面：1．从长白山不同地区采集到的天麻和蜜环菌的子实体中分离得到了16个蜜环菌菌株，分别为Ar-02，Ar-03，Ar-04，Ar-07，Ar-08，Ar-09，Ar-11，Ar-13，Ar-16，Ar-17，Ar-20，Ar-21，Ar-25，Ar-26，Ar-29，Ar-31。以目前“脑心舒”口服液生产所用的蜜环菌菌株(Ar-00)为对照，通过固体培养和液体培养，开展了各菌株的菌丝和菌索萌发时间及其形态特征、荧光特性、液体培养时菌丝球的形态、大小，发酵液色泽，荧光强度，产物的生物量等方面的试验研究。以各菌株的生长特性和生物量为主要指标，进一步筛选出生长性状良好的8个菌株Ar-02，Ar-03，Ar-07，Ar-08，Ar-09，Ar-11，Ar-13，Ar-31。2．经液体深层发酵试验研究，确定了8个生长性状良好的蜜环菌菌株各自的最适培养条件，在此基础上，对8个菌株进行了液体扩大培养，以“脑心舒”口服液生产菌株Ar-00为阳性对照菌株，将发酵产物(菌丝体和发酵液)进行催眠功能的动物试验，最终筛选出液体发酵生物量最高，催眠功能明显的优良菌株Ar-07。本研究还对Ar-07菌株进行了分子生物学鉴定，最终将Ar-07菌株确定为奥氏蜜环菌(Armillaria ostoyae Romagn)。通过单因素和正交试验，筛选确定了Ar-07菌株液体深层发酵的最适培养基和摇床扩大培养时的最适初始pH值、装液量、接种方法(菌丝球的破碎均质处理)和接种量、培养温度、摇床转速、乙醇添加量和最佳发酵时间。3．对Ar-07菌株的液体深层发酵产物(发酵液)进行有效部位的多层次分离、提取，并通过催眠功能的动物试验跟踪，确定了Ar-07菌株发酵液中具有明显催眠功能的有效部位。4．以发酵液中的催眠功能有效部位得率为主要指标，通过正交试验和发酵动力学研究，进一步优化了蜜环菌液体深层发酵的生产工艺，并与蜜环菌的普通发酵工艺相比较，开展了较大规模的中试研究。发酵产物中的菌丝体产量比普通发酵法提高了18.30％，发酵液中催眠功能有效部位得率比普通发酵法提高了21.64％。通过对中试结果分析检测和动物试验证明，本研究所确定的优化工艺是合理可靠的。作者首次从野生蜜环菌的采集、菌种分离、催眠活性菌株的优选、有效部位的确定到液体深层发酵工艺的优化，展开了全面、系统的研究工作。本论文具有以下创新点：1．通过大量的试验研究最终筛选出的蜜环菌Ar-07菌株为生长性状好、生物量高、活性明显、功效稳定的优良菌株，并利用分子生物学鉴定方法将该菌株确定为奥氏蜜环菌(Armillaria ostoyae Romagn)。可为蜜环菌制剂的开发生产提供稳定、可靠的优良菌种。2．通过对蜜环菌Ar-07菌株液体深层发酵产物的多层次分步提取和催眠功能动物试验跟踪，筛选确定了功能活性明显的有效部位，为蜜环菌深层发酵工艺的进一步优化，发酵产物的质量监控提供了可靠依据，为蜜环菌制剂的二次开发奠定了良好基础。3．以催眠活性有效部位的得率为主要指标，进一步优化了蜜环菌液体深层发酵的工艺条件和控制参数，并与普通发酵工艺相比较开展了中试生产研究。结果表明，采用优化工艺进行发酵与普通发酵工艺相比，菌丝体的生物量提高了18.30％，发酵液中有效部位的得率提高了21.64％。此项研究成果为今后蜜环菌液体深层发酵生产及其系列制剂的生产开发提供了可靠的工艺技术。4．本试验确定的破碎匀质接种法经蜜环菌中试生产验证可以提高发酵产物生物量，大量节省菌种的投放量(节省40％)。该法具有明显的创新性，经进一步完善后可以在食药用真菌的液体深层发酵生产中推广应用。本研究所取得的创新性成果为蜜环菌的发酵特性、发酵产物的化学成分分析和活性单体的提取分离研究以及蜜环菌系列产品的深层次开发利用研究奠定了一定基础，可以为蜜环菌液体深层发酵和系列产品的生产开发提供优良菌株和科学合理的工艺技术，对蜜环菌的标准化发酵生产和工艺质量监控具有良好的指导作用。在提高蜜环菌制剂质量和功效的稳定性，加快“脑心舒”口服液的二次开发和蜜环菌创新性药物的研究以及蜜环菌第叁代功能性食品的研究与开发，促进食药用菌的产业化发展等方面具有良好的应用价值和现实意义。
余晨晨[3]2011年在《蜜环菌发酵产物有效成分的分离鉴定与活性研究》文中研究表明蜜环菌是一种兼性寄生于多种木本、草本植物的野生药食两用真菌,研究发现,其具有中枢镇静、改善睡眠、增强免疫和神经调节等重要的营养价值和药理作用,相关产品制剂是治疗头痛、眩晕、神经衰弱等疾病的有效药物,蜜环菌发酵产物中富含核苷类化合物、必需氨基酸、多肽、多糖和倍半萜类化合物等多种天然活性物质,分离鉴定活性物质的组成和开展质量标准的研究,具有重要的理论意义和应用价值。本研究分析检测了蜜环菌发酵产物中的活性成分多糖、核苷物质和多肽,并利用液相色谱、气相色谱和红外光谱等方法进一步对提取到的多糖和核苷物质的基本结构进行鉴定与研究,同时考察了蜜环菌多糖的抗氧化活性和不同溶剂提取物的抗菌活性。主要的研究内容及结果如下:1.改变蜜环菌发酵的不同种类碳氮源,测定多糖含量和菌体干重,筛选出产蜜环菌多糖和菌丝体生长的最适碳氮源,得出红薯粉和豆粕的组合最适合产多糖,玉米浆和玉米粉的组合菌丝体得率最高。利用紫外、红外光谱和气相衍生化法分析了提取到水溶性多糖的基本结构信息,其结构由吡喃葡萄糖单一组成。2.通过与抗坏血酸、TBHQ的对比,对蜜环菌水溶性多糖清除羟基自由基、超氧阴离子和DPPH自由基的能力进行了系统研究。结果表明在清除率达到50 %时,多糖对·OH、·O2-和DPPH自由基的清除浓度大约为1.5 mg·mL~(-1)、3.5 mg·mL~(-1)和0.5 mg·mL~(-1)。叁种不同的体外自由基清除体系证明了蜜环菌水溶性多糖具有较强的抗氧化活性。3.经硅胶柱层析分离到一种核苷类物质,紫外和红外光谱显示其基本结构信息,HPLC结果表明其为单一组分,而且与蜜环菌菌粉核苷色谱图中的一种物质相对应。HPLC也分析了4批不同蜜环菌菌粉中所含有的核苷化合物,初步证实发酵产物中含有7～9种核苷类物质。4.蜜环菌菌粉分别用70 %乙醇、水和石油醚进行索氏提取,对提取物开展抑菌活性实验,实验结果显示,醇提物抑制效果最好,对2种酵母菌和8种细菌均有抑菌作用,其中对白假丝酵母和葡萄假丝酵母抑菌活性最强。水提物效果微弱,石油醚则无任何作用。5.通过福林酚法测定了蜜环菌发酵产物中的多肽含量,证明用此方法检测蜜环菌产品中多肽的含量简便可行。
柳运波[4]2015年在《蜜环菌液体培养条件优化及降血脂作用的研究》文中指出蜜环菌(学名:Armillaria mellea)是隶属于真菌界，担子菌门，并且它是名贵药用兰科植物天麻、猪茶生长过程中必不可少的共生菌，蜜环菌在全世界侵染600多种树木，导致树林死亡，造成很大的经济损失。近些年来，蜜环菌的药用价值和荧光特性受到广泛关注。蜜环菌和蜜环菌发酵液与天麻有相似的药理作用，可作用于神经中枢，调节睡眠，增加免疫力等作用[17]。发光性是蜜环菌的重要特征之一，在充足的氧气、适宜的湿度、温度和酸碱度下，生长旺盛的蜜环菌幼嫩部分就会发出白绿色的荧光，这种光是一种冷光，无热感。蜜环菌发光特性已经被用于基因标记和作为生物传感器，国外报道蜜环菌发光特性可以用于环境检测，然而关于蜜环菌生物体发光最优培养活条件的研究确很少。因此找出最优化的培养条件利于蜜环菌的生长和发光对促进蜜环菌产业发展有重要作用。本研究旨在通过探索蜜环菌发酵条件中碳源、温度、PH值、光照对蜜环菌的生长和发光特性的影响，为实现蜜环菌培育做一些基础工作。1、分别以葡萄糖、淀粉、半乳糖、乳糖、蔗糖等不同碳源替代基础培养基中的果糖配制六组发酵培养基，发现蜜环菌在淀粉养基上菌索萌发时间最短，生长速度最快，且菌索发达，对发光强度没有影响，试验证明为淀粉做为碳源是最优的选择。2、将配制好的培养基5ml，加入到直径35mm培养皿中，接种，分别于5℃、15℃、25℃、30℃发酵，对菌丝的发光和生长率进行测量，温度对蜜环菌的生长和发光都有影响，适合菌体生长和发光最佳的温度为25℃。3、将5ml按最佳碳源配制好的培养基，加入到培养皿（35mm）中，接种，在不同的光照周期下进行培养，分别为24小时光照、12小时光照/12小时黑暗、24小时黑暗，光照影响菌丝体发光，但是不影响蜜环菌生长，蜜环菌在不光照的条件下培养发光亮度最高，其次是光照12h的培养条件，最暗的是完全光照的条件下培养。4、将5ml按最佳碳源配制好的培养基，灭菌后，用盐酸或氢氧化钠，培养基内培养液pH分别调整为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0，然后放入到培养皿中（35mm）接种，于25℃避光培养PH值是3.5的时候，最适合蜜环菌发光，PH值是5.5的时候菌丝体发光最弱，PH值是4.5的时候，菌丝体的生长速度最快。5、将提取密环菌多糖150mg/kg、100mg/kg连续喂养高血脂症模型大鼠，不断的检测高血脂症模型大鼠血清中TG、TC及LDL-C的过程中我们可以看出其水平在不断降低。实验结果表证实蜜环菌多糖具有一定的降血脂的作用。
参考文献：
[1]. 蜜环菌睡眠调节活性菌株筛选及液体深层发酵技术研究[D]. 袁媛. 吉林农业大学. 2004
[2]. 蜜环菌催眠功能优良菌株筛选和发酵工艺优化研究[D]. 刘景圣. 吉林农业大学. 2005
[3]. 蜜环菌发酵产物有效成分的分离鉴定与活性研究[D]. 余晨晨. 河南大学. 2011
[4]. 蜜环菌液体培养条件优化及降血脂作用的研究[D]. 柳运波. 吉林大学. 2015
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