苏丽萍[1]2001年在《人脐血造血干/祖细胞体外扩增和移植SCID小鼠的实验研究》文中认为脐血作为一种新的造血干/祖细胞来源，可以成功地替代骨髓和动员外周血用于临床上骨髓衰竭病人的造血重建。这已经被越来越多的实验研究所证明。这是因为脐血中含有丰富的造血干/祖细胞：CD34~+CD38~-细胞、集落形成细胞（CFC）、长期培养启动细胞（LTC-IC）的含量均高于骨髓和动员外周血。另外脐血移植后移植物抗宿主疾病（GVHD）的发生率和严重程度也比骨髓和动员外周血细胞移植低。但是由于单份脐带血中所含有的造血细胞数量较少，限制了脐血移植的应用，目前脐血移植主要用于儿童和低体重成人患者。为了扩大脐血移植的应用范围，首先必须对脐血造血干/祖细胞进行体外扩增，这也是目前移植领域中倍受关注并急需解决的课题之一。 近年来陆续发现了几种新的造血生长因子如FL、TPO、SCF等，并已证明它们在早期造血调控中发挥着重要作用。因此我们参考国内外新的方法并加以改进，在原有实验结果的基础上，采用细胞因子组合FL+TPO+SCF+IL-6来扩增脐血造血细胞，通过无基质细胞接触的液体悬浮培养、细胞表型动态测定、体外集落形成试验等方法探讨了这一因子组合对脐血CD34~+细胞的体外扩增效应，发现与经典的细胞因子组合（SCF+IL-3+IL-6+GM-CSF+EPO）相比，该扩增方案能更有效扩增CD34~+细胞，在产生了相当数量的较成熟细胞的同时，能在较长时间（至少4周）内仍保持一定比例的造血干细胞成分。 为了进一步了解扩增后细胞的移植能力和造血潜能，我们以严重联合免疫缺陷（SCID）小鼠作为脐血移植的动物模型，将扩增后的脐血造血细胞通过尾静脉注入受亚致死量辐照的SCID小鼠体内，无菌饲养4周后取其骨髓细胞，通过人CD45~+细胞的流式细胞仪检测和Alu 人脐血造血干／祖细胞体外扩增和移植 SC小鼠的实验研究 中文摘要 基因的PCR检测，在小鼠体内均发现了人源细胞，表明了扩增后的 脐血造血细胞可以长期植人SCID小鼠体内，从而改善或重建其造血 功能。
王晨曦[2]2006年在《人脐血源肝干/祖细胞生物活性及移植的实验研究》文中提出目的 研究人脐血单个核细胞在体外定向诱导分化为肝干／祖细胞以及脐血源肝干／祖细胞移植于体内的生物活性。方法一、从脐血中分离出脐血单个核细胞，在肝细胞生长因子(HGF)、干细胞生长因子(SCF)、成纤维细胞生长因子-1(FGF-1)、成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)、制瘤素(OSM)、白血病抑制因子(LIF)的共同作用下，诱导分化为肝干／祖细胞，观察细胞形态学的变化，RT-PCR定量测定hALBmRNA，细胞免疫化学检测ALB、CK18、CK19的表达。二、对肝损伤和肝损害SCID鼠模型，进行人脐血源肝干／祖细胞体内移植，分别在不同时期检测SCID鼠外周血中的hCD45水平，肝脏组织中hALBmRNA和hALB蛋白的表达，以及ALB的免疫表达情况。结果一、体外诱导培养的细胞呈肝细胞样分化，RT-PCR检测到hALBmRNA，细胞免疫化学显示部分细胞CK18、CK19、ALB呈阳性。二、可见大体肝脏：体积略有增大，肝脏表面可见有粟粒状突起，约芝麻大小；流式细胞仪在外周血中检测到有hCD45表达，6周水平最高，10周后基本测不到；RT-PCR检测到肝脏组织hALBmRNA的表达及Western-blot检测到hALB蛋白的表达随移植时间的延长而增强；免疫组织化学肝脏中ALB表达阳性，免疫荧光显示绿荧光。结论一、脐血单个核细胞在定向诱导下有分化为肝干／祖细胞的能力，可以考虑作为肝干／祖细胞和肝细胞新的细胞来源。二、脐血源肝干／祖细胞可以通过肝实质移植在体内进一步分化，对肝损伤修复和再生有一定的促进作用，为肝细胞移植和肝再生与修复提供了一定的理论基础。
徐晨[3]2009年在《TAT-HOXB4蛋白扩增人脐血CD34阳性细胞及其体内生理活性评价》文中研究说明目的:探讨TAT-HOXB4蛋白与细胞因子组合扩增的人脐带血来源CD34阳性细胞,其在NOD/SCID多重免疫缺陷小鼠体内生理活性。方法:以GFP融合蛋白及西方墨点法检测公司所提供的TAT-HOXB4蛋白进入细胞的能力;将新鲜的婴儿脐带血进行MNC分离,再用MiniMACS分离人脐带血CD34阳性细胞,以TAT-HOXB4蛋白作为人脐血CD34阳性细胞的扩增因子,以体外培养方式扩增人CD34阳性细胞、MNC细胞。收集扩增后的细胞,经流式细胞仪检测及显微镜下计数,对比扩增前后之单个核细胞、CD34阳性细胞数量;钴60照射NOD/SCID小鼠2.5Gy后,将扩增后人脐带血来源CD34阳性细胞以尾静脉注射方式殖入小鼠体内,评价扩增后细胞的活体内分化能力。结果:TAT-HOXB4蛋白能有效进入真核细胞细胞核内,并产生生物效应。以GFP融合HOXB4与293细胞共同培养后,用荧光显微镜观察,能观察到TAT-HOXB4-GFP有效进入细胞核中,以免疫印迹法检测经TAT-HOXB4培养后的细胞,同样可以在细胞核抽取部分检测到HOXB4蛋白条带存在,而未与HOXB4共同培养的细胞则无此条带,由上述两实验可证实TAT-HOXB4进入细胞能力良好。实验室先前试验已经得到HOXB4扩增细胞的最佳浓度与最佳处理条件。在此条件下CD34阳性细胞可被有效扩增,对比于对照组,实验组MNC数目增加3倍,CD34阳性细胞增加6倍。扩增后的细胞,经尾静脉注射人照射后的多重免疫缺陷小鼠NOD/SCID后,能分化成为淋系祖细胞及成熟细胞,证实其保有分化能力。结论:TAT-HOXB4蛋白具有进入真核细胞的生物活性,并且在进入细胞核后,有扩增造血细胞的活性,扩增后的细胞保有干细胞表面标志,且体内分化能力试验中证实,经TAT-HOXB4蛋白扩增的CD34阳性细胞,保有良好的分化能力。
刘英, 裴雪涛, 吕善根, 冉崇蓉, 李梁[4]1999年在《扩增人脐血造血干/祖细胞重建SCID小鼠造血的实验研究》文中认为目的 探讨Ｆｌｔ３ 配基（ＦＬ） 、Ｔｐｏ、ＳＣＦ等细胞因子组合对人脐血干／ 祖细胞的扩增及自我更新能力的维持作用。方法 用ＦＬ＋ Ｔｐｏ＋ ＳＣＦ＋ＩＬ６ ＋ＩＬ３＋ ＧＣＳＦ组合，体外扩增脐血ＣＤ３４ ＋ 细胞１４天，将其移植给亚致死剂量照射的ＳＣＩＤ小鼠。结果 扩增的脐血造血细胞可顺利植入ＳＣＩＤ小鼠并重建造血，１８ 只小鼠移植后存活６ 周的有８ 只，其骨髓中仍可检测到人的造血细胞，死亡率５６ ％ ，与对照组（ 死亡率１００％） 比较，χ２ ＝１０．０８，Ｐ＜０．０１。结论 ＦＬ＋ Ｔｐｏ＋ ＳＣＦ＋ＩＬ６ ＋ＩＬ３ ＋ ＧＣＳＦ组合在有效扩增造血细胞的同时可保留造血干／祖细胞的自我更新及造血重建能力。
郭荣, 邹萍[5]2002年在《NOD/SCID小鼠模型在人脐血体外扩增后移植中的应用》文中研究表明造血细胞体外扩增时总细胞及祖细胞数量均倍增,但干细胞是否扩增的证据不足。动物移植模型是检测干细胞扩增的最佳实验。最近建立了一种人-非肥胖糖尿病重症联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠模型,可有效评估干细胞体外扩增后体内再植力水平。本文就NOD/SCID小鼠模型的发展、影响造血细胞植入的因素及其在评估造血细胞体外扩增后体内再植力的应用进行综述。
李玉艳[6]2008年在《携带HBB基因shRNA的人脐血CD34+细胞构建及其应用基础研究》文中研究指明β-血红蛋白病是一组多相群的单基因疾病,重型可致死。为了探讨其基因治疗的可行性及潜在价值。本课题拟选择对β-珠蛋白基因具有靶向RNAi的特异序列,并构建慢病毒载体,采用体外筛选法获得目的序列及质粒,以期能与β-珠蛋白等位基因特异性结合抑制RNA的表达,并了解感染细胞的体内植入和增殖情况,以期在以后试验中与其它基因表达载体组合共同用于治疗β-血红蛋白病。内容和方法1.从GeneBank查找HBB mRNA序列,设计挑选3个RNAi靶点,每个合成两条单寡核苷酸链,退火后连入酶切的pGCL-GFP载体,将连接产物转染感受态细菌,对长出的克隆进行PCR鉴定,测序比对。对阳性克隆进行质粒抽提。2.用PCR方法从模板钓取相应的HBB序列片段,将片段与pdsRED2-N1载体进行双酶切后定向连接,转染感受态细菌,长出的克隆进行PCR鉴定,测序和比对分析后,对阳性克隆进行质粒抽提。3.HBB-RNAi-LV质粒和HBB过表达质粒,按低浓度组(0.5:1)和高浓度组(1:1)用Lipofectamine2000共转染293T细胞,48h后FM观察GFP表达,Western Blot检测FLAG-HBB融合蛋白表达。4.将HBB-RNAi-LV质粒和慢病毒包装载体pHelper 1.0及pHelper 2.0载体按4:3:2比例添加,转染293T细胞,培养48小时后收集培养上清,利用Plus-20离心超滤装置对病毒上清进行离心超浓缩。5.人脐血MACS法分离的CD34+细胞,加入细胞因子进行无血清无基质预培养,慢病毒感染,48h后FM观察感染率,Real-Time PCR检测感染2、4、5天的HBBHBG基因表达情况,Western Blot检测感染7天的HBB蛋白表达。6.人脐血CD34+细胞,体外用高浓度细胞因子预刺激培养过夜后感染慢病毒24小时,经皮注射入SCID新生小鼠腹腔,密切观察小鼠存活情况。7.移植后3周,用FM和FCM检测小鼠外周血中人HbF细胞和成人红细胞,外周血有核细胞中的GFP阳性细胞;骨髓细胞中的GFP阳性细胞,并观察小鼠肝、脾、肾脏、小肠等组织中的GFP阳性细胞分布。结果1.构建了3个HBB基因的RNAi-LV载体(PSC1、PSC2、PSC3)及一个对照质粒PSCNC。2.构建了含有相应HBB基因片段的过表达载体HBB- pdsRED2-N1-3Flag质粒。3.外源筛靶试验中PSC1、PSC3对HBB融合蛋白有明显敲减作用,随着浓度增加敲减作用增强,其中PSC1靶点的敲减效果最好。4.包装并获得高滴度的PSC1、PSC3和PSCNC慢病毒。5.慢病毒在CD34+细胞中的感染率为15~30%,病毒感染明显激活细胞中的HBB和HBG基因表达,PSC1促进HBB珠蛋白表达,PSC3则显着抑制HBB和HBG珠蛋白表达,其抑制效果与感染率有关。6.移植CD34+细胞后,小鼠外周血中人HbF细胞及成人红细胞为0.1~1.2%;有核细胞中GFP细胞,PSCNC组为3.2~10.2%, PSC3组为4.4~8.8%;骨髓细胞中GFP细胞PSCNC组为1.5~5.5%, PSC3组为1.3~6.2%,各组间均无统计学意义。肝、脾、肾和小肠等组织均未见明显的GFP阳性细胞。结论1.系统建立了完整的人脐带血CD34+细胞分离、无血清无基质培养和慢病毒感染的实验方法。2.成功构建了3个β-珠蛋白基因shRNA的慢病毒载体,通过外源筛靶方法初筛出2个有效序列,经慢病毒包装获得了高滴度的病毒颗粒。3.成功筛选到一条对HBB基因有抑制作用的RNAi序列。4.人脐血CD34+细胞移植入未骨髓抑制的免疫缺陷病新生小鼠腹腔,可成功归巢、增殖,主要增殖为自身缺陷的淋巴系统,红系缺乏表达优势。
邓婷芬[7]2009年在《脐血间充质干细胞联合细胞因子支持人脐血单个核细胞体外扩增的探讨》文中研究表明脐血作为一种造血干细胞资源越来越受到广泛重视,但由于单份脐血中造血干细胞数量不足,不能满足大多数成人和高体重儿童造血干细胞移植重建造血及免疫功能的需要,故限制了其广泛应用。体外扩增虽然可以增加造血细胞数量,但可能导致造血干细胞分化并降低其归巢和长期造血重建能力,因此提高脐血造血干细胞体外扩增质量仍是脐血移植中亟待解决的问题。间充质干细胞作为造血微环境主要细胞成分基质细胞的前体细胞,可以分泌与造血干细胞生长发育相关的黏附分子、细胞外基质和多种细胞因子,为造血干细胞体外扩增提供适宜的微环境。随着培养技术的提高,脐血间充质干细胞有着与其他来源的间充质干细胞所无法比拟的优势。本实验研究脐血间充质干细胞对人脐血单个核细胞体外扩增的支持作用。目的探讨脐血来源间充质干细胞(UCB-MSCs)体外分离、培养和初步鉴定的方法,以及UCB-MSCs联合外源性细胞因子对人脐血单个核细胞(UCB-MNCs)体外扩增的支持作用和最佳收获时间,为配合造血干细胞移植的临床应用提供实验方法。方法用羟乙基淀粉(HES)和人淋巴细胞分离液(Ficoll-Hypaque)以密度梯度离心法分离脐血单个核细胞,采用贴壁筛选法以MesencultTM专用培养基培养出脐血间充质干细胞,并通过流式细胞仪检测其细胞表面抗原。将新鲜脐血标本分离出的脐血单个核细胞接种于无血清培养体系(Stem spanTM)中培养18天,实验分叁组,A组:为空白对照组(培养体系中无外源性细胞因子和UCB-MSCs滋养层);B组:为因子组(培养体系中有外源性细胞因子但无UCB-MSCs滋养层);C组:为实验组(培养体系中既有外源性细胞因子又有UCB-MSCs滋养层)。在第0、7、10、14及18天检测有核细胞总数(MNCs)、CD34+细胞数、CD133+细胞数、集落形成单位数(CFU)和细胞在周期(G2+M+S期)含量的变化。结果①从脐血中分离、培养的出间充质干细胞,稳定表达CD29、CD105和CD44,不表达CD34和CD133。②在体外培养过程中,外源性细胞因子及UCB-MSCs均对脐血单个核细胞的扩增起支持作用,但以UCB-MSCs联合外源性细胞因子组效果最好,该组各项指标在同一时间点较其它两组高,有统计学意义(P﹤0.05),且维持造血至少达18天。③以UCB-MSCs联合外源性细胞因子对脐血单个核细胞扩增,第10天上述各项指标达到最高峰,有统计学意义(P﹤0.05)。结论①采用密度梯度离心联合贴壁筛选法并通过流式细胞检测技术,可以成功地实现从脐血中分离、培养出间充质干细胞,并完成其细胞表型的初步鉴定。②UCB-MSCs联合外源性细胞因子可有效扩增脐血单个核细胞。③UCB-MSCs联合外源性细胞因子体外扩增脐血单个核细胞细胞收获的最佳时间为第10-14天。
张曦[8]2003年在《人脐血基质细胞生物学特点及其体外扩增的研究》文中提出造血微环境(hematopoietic inductive microenvironment，HIM )是造血干/祖细胞归巢定位、增殖、分化和发育的“土壤”，造血基质细胞是造血微环境的重要组成部分。大量研究结果表明，基质细胞存在于骨髓、脾脏、胸腺等组织器官，造血基质细胞通过与造血干/祖细胞直接接触、分泌造血细胞因子(hematopoitic growth factor,HGF)和细胞外基质(extracellular matrix,ECM)参与正常的造血调控。关于造血功能损伤与修复的研究与应用，既往多侧重于造血实质细胞，对构成造血微环境重要成分的造血基质细胞尚需深入研究。脐血来源方便，富含造血干细胞，临床运用前景广阔。人脐血中是否存在造血基质细胞及其生物学特点如何，脐血基质细胞能否在体外有效扩增，国内外相关的系统性研究较少。鉴于此，本课题应用人脐血CD34+细胞，采用Dexter贴壁细胞培养体系行脐血基质细胞培养，探讨人脐血中分离基质细胞的可行性，观察不同时间人脐血基质细胞的体外生长情况和不同细胞因子及其组合方案的扩增效果。主要实验结果如下：1. 人脐血基质细胞生长的动态观察：Dexter培养3~4d脐血CD34+细胞形成贴壁细胞，为圆形、叁角形或不规则形；9~14d(平均11.2d)开始形成基质细胞集落；15~22d(平均19.6d)贴壁细胞集落数量明显增多，随着培养时间的延长，细胞体积逐渐增大，细胞圆形、椭圆形或梭形，以巨噬样细胞、成纤维样细胞为主；至培养28d贴壁细胞铺满培养皿底。2. 脐血基质细胞的形态学特征：培养第3d贴壁细胞为小梭形、叁角形、圆形；随培养时间的延长细胞体积逐渐变大，瑞氏染色胞浆呈灰兰色，胞核圆形或椭圆形，可见多核及分裂相细胞，核仁1~2个。培养至28d基质细胞的形态主要表现为：①"成纤维样"细胞，约占56.5%，细胞呈梭形，胞浆丰富，紫红色，核染色质较粗，核仁不明显；②"巨噬样"细胞，约占38%，圆形，胞体较大，胞膜突起有嵌合，胞浆丰富，核染色质粗，核仁明显；③ "小圆"类细胞，约占5.5%，胞体较小，类淋巴样细胞，胞浆兰色，核染色质细，核仁明显。3. 脐血基质细胞的鉴定：(1)细胞化学染色：①非特异性酯酶染色法(NSE)：阳性率100%；②过氧化物酶染色法(POX)：阴性；③糖原染色(PAS)：阳性率100%；④碱性磷酸酶(ALP)染色：阳性率35%；(2)免疫组织化学染色：①CD106(VCAM-1)：阳性率96%；② CD29(整合素-β1)：阳性率93%；③CD44阳性率：98%；④ CD45：阴性；⑤ CD50：阳性率68%；⑥纤维粘连蛋白(Fn)：阳性率92%；⑦层粘连蛋白(Lm)：阳性率74%；⑧胶原Ⅳ：阳性率83%。<WP=8>4. 脐血基质细胞超微结构：经透射电镜观察：成纤维样细胞胞浆内可见丰富的线粒体、粗面内质网，胞核较大，核仁不明显，常染色质丰富，异染色质疏松；巨噬样细胞胞浆内可见丰富的线粒体、粗面内质网、高尔基体及大量溶酶体样空泡，胞质突出，核椭圆形，核仁清晰，常染色质丰富，异染色质疏松；“小圆”类细胞，胞浆内游离核糖体含量丰富，富含粗面内质网和高尔基复合体，常染色质丰富，少见染色质，核仁明显，大部分含2个以上核仁，位置靠近核膜。5. 脐血基质细胞细胞周期、贴壁率检测及其生长曲线的绘制：培养28d G0/G1期细胞占70.4%，S期占22.5%，G2+M期占7.1%；脐血基质细胞传代后10h贴壁率为58%，24h为82%，48h为90%；基质细胞生长曲线：培养第1-3d为脐血基质细胞的潜伏适应期；3d后进入对数生长期，到第8d达到顶点，第8d后细胞生长进入平台期，数量减少。脐血基质细胞的倍增时间为31.92h。6. 造血生长因子及其组合对人脐血基质细胞体外扩增的效果：不同细胞因子组合方案培养21d与对照组比较： IL-3、bFGF等组扩增作用不明显(P>0.05)；SCF、IL-3+SCF、IL-3+bFGF 、IL-3+bFGF+SCF、SCF+bFGF组合对脐血基质细胞的扩增效果显着(P<0.01)，其中SCF+bFGF、IL-3+SCF+bFGF组最为显着(P<0.01)；SCF+bFGF、IL-3+SCF+bFGF组间比较无显着性差异(P>0.05)； SCF+bFGF和SCF+bFGF+IL-3组见索条状排列融合成片的基质细胞。7. 造血抑制因子TNF-α对脐血基质细胞扩增的影响：培养21d与对照组比较， 含TNF-α的各组扩增作用明显(P<0.01)，其中SCF+bFGF+TNF-α与其他组间比较有显著性差异(P<0.01)。TNF-α分别交合SCF、IL-3+bFGF、IL-3+SCF等组合对脐血基质细胞的扩增作用无显着性差异(P>0.05)。与不含TNF-α的组合相比生长方式上有一定差异：①培养21d，组成脐血基质细胞集落的细胞数较多；②培养28d， SCF+bFGF+TNF-α组形成基质细胞粘附层，细胞的密集程度非常高，呈索条状排列或散射状。结论：① 人脐血中存在基质细胞的前体细胞；② 人脐血基质细胞具有造血基质细胞的基本特点；③ 细胞因子及其合理的组合能够使人脐血基质细胞体外扩增。
张伶[9]1998年在《人脐血造血干/祖细胞体外扩增的研究新进展》文中进行了进一步梳理人脐血造血干／祖细胞增殖能力强，在不同的细胞生长因子联合作用下，可以有目的地扩增，使单份脐血造血干／祖细胞数量增加。动物实验证实了体外扩增并未降低造血干／祖细胞在小鼠体内的造血重建能力。因此，脐血造血细胞体外扩增有望解决成人济血移植中存在的造血干／祖细胞数量不足的问题。
刘颖[10]2011年在《人脐血基质细胞联合移植促进造血细胞归巢植入及支持造血重建的实验研究》文中研究表明造血微环境(hematopoietic inductive microenvironment,HIM)是支持和调节造血干/祖细胞(haemopoietic stem/progenitor cell,HSPC)生长发育的内环境,其结构和功能的完整统一是维系造血功能正常进行的重要环节。作为造血微环境的重要组成部分,基质细胞可能通过形成造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)生长的“龛”,分泌造血生长因子(hematopoietic growth factor,HGF)和细胞外基质(extracellular matrix,ECM)等参与造血细胞的自我更新、增殖分化和归巢定位,在免疫调节方面也具有重要的作用。深入探讨基质细胞对骨髓造血功能的影响,从修复或重建骨髓微环境正常功能入手治疗造血功能损伤具有重要的理论价值和实际意义。基质细胞由间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)分化而来,是一个包括成纤维细胞、内皮细胞、成骨细胞、脂肪细胞、巨噬细胞和网状细胞等成分复杂的异质细胞群。自1977年Dexter在体外培养出人骨髓基质细胞(human bone marrow stromal cells,hBMSCs)获得成功后,人们对hBMSCs进行了深入的研究。经实验研究和临床实践证实,hBMSCs体外培养扩增联合HSC回输是重建造血功能的有效方法。但hBMSCs来源受限,采集骨髓增加供者痛苦和风险,且细胞数量及增殖分化潜能随供者年龄增加而下降。自体移植中患者自身基质细胞存在异常,而异体移植亦有可能带来移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)等免疫相关问题,均限制了hBMSCs在临床上的广泛运用。人脐血来源丰富,取材方便,具有未成熟的干/祖细胞比例高且免疫原性较低等特点,在多种造血系统恶性疾病临床治疗中具有潜在的应用价值。本课题组长期从事人脐血源基质细胞(human umbilical cord blood-derived stromal cells,hUCBDSCs)及脐血造血微环境的研究,前期研究通过特定的细胞因子使hUCBDSCs得以有效扩增,扩增后的hUCBDSCs在细胞成分和免疫表型上与hBMSCs相似,能够分泌表达多种细胞因子,具备造血基质细胞的基本特征。以hUCBDSCs为滋养层的培养体系能有效支持脐血CD34+细胞体外扩增,特别对于促巨核细胞集落形成单位(colony forming unit-megakaryocte,CFU-Mk)形成的作用明显优于hBMSCs,提示hUCBDSCs在促进巨核系增殖分化成熟方面可能具有重要的意义。深入探讨hUCBDSCs移植在体内支持和调控造血、重建造血微环境的作用可为造血功能损伤修复治疗提供新的思路。基于上述分析,本课题首先建立两种不同来源基质细胞滋养层(hUCBDSCs和hBMSCs)培养体系,采用CCK-8法和Transwell法分别观察两种基质细胞对脐血单个核细胞(human umbilical cord mononuclear cells,hUCB-MNCs)增殖、粘附和迁移的影响,并采用RT-PCR法检测hUCBDSCs对归巢相关分子mRNA的表达情况。在此基础上建立BABL/c小鼠造血微环境辐照损伤模型,采用hUCB-MNCs单移植,或分别联合两种不同来源基质细胞共移植的方法,比较观察两种基质细胞促进造血细胞体内归巢与植入、重建造血微环境及支持造血重建的作用,为安全有效的临床移植治疗提供新的辅助措施和手段。方法:1.体外构建hUCBDSCs和hBMSCs两种不同来源基质细胞滋养层培养体系。采用CCK-8法和Transwell法分别检测两种基质细胞对hUCB-MNCs体外增殖、粘附和迁移的影响;采用RT-PCR法检测hUCBDSCs对归巢相关因子(SDF-1、CXCR-4、ICAM-1、VCAM-1、HCAM、PECAM-1、Fn)mRNA的表达情况。2.以近交系BABL/c小鼠作为受体鼠,经60COγ射线致死剂量8.5 Gy全身照射预处理后分别接受不同剂量hUCB-MNCs(2、4、6或8×10~6/只)单移植,或联合hUCBDSCs(2×10~6/只)共移植,移植后第6周流式细胞仪检测小鼠骨髓人源CD45+细胞植入率。3.采用CM-DiI荧光染料预染hUCB-MNCs,辐照后BABL/c小鼠分别接受hUCB-MNCs(2×10~6/只)单移植,或联合两种不同来源基质细胞(2×10~6/只)共移植。激光共聚焦显微镜追踪观察移植后荧光标记hUCB-MNCs在小鼠体内的迁移分布情况,比较各组造血细胞归巢率。4.辐照后小鼠分别接受hUCB-MNCs(2×10~6/只)单移植,或联合两种不同来源基质细胞(2×10~6/只)共移植。观察移植后各组小鼠存活情况,记录生存率;动态检测外周血血象恢复情况,骨髓组织病理切片观察骨髓病理变化;不同时相点计数各组小鼠骨髓成纤维细胞集落形成单位(CFU-F)、脾集落形成单位(CFU-S)、粒/巨噬细胞集落形成单位(CFU-GM)和巨核细胞集落形成单位(CFU-Mk)产率。结果:1. hUCBDSCs对脐血单个核细胞体外增殖、粘附和迁移能力的影响同hBMSCs共培养组和hUCB-MNCs单独培养组相比较,hUCB-MNCs在hUCBDSCs共培养条件下增殖能力显着增强。两种基质细胞均能促进hUCB-MNCs的粘附,且共培养后hUCB-MNCs迁移能力也显着(P<0.05)强于无基质细胞支持对照。hUCBDSCs明显表达与造血细胞归巢植入密切相关的粘附分子、细胞因子及受体(SDF-1、CXCR-4、ICAM-1、VCAM-1、HCAM、PECAM-1、Fn)mRNA,揭示其对造血细胞在体内的归巢和植入具有重要作用。2. hUCBDSCs联合移植促进造血细胞归巢和植入辐照后小鼠分别接受不同剂量hUCB-MNCs(2、4、6或8×10~6/只)单移植,或联合hUCBDSCs(2×10~6/只)共移植。采用不同剂量的hUCB-MNCs单移植后的植入率随hUCB-MNCs输注量增加而增长。hUCBDSCs联合移植能不同程度提高小鼠骨髓中人CD45~+细胞植入比例,尤其当输注低剂量hUCB-MNC(s2×10~6/只)时,hUCBDSCs共移植较单移植的植入率提高最为显着。激光共聚焦显微镜下观察CM-DiI标记的hUCB-MNCs在移植后2～3天主要归巢至骨髓和脾脏。移植后48小时,hUCBDSCs共移植组归巢率显着(P<0.05)高于hBMSCs共移植组和单移植组,显示移植后早期hUCBDSCs能促进造血细胞向骨髓迁移归巢。3.hUCBDSCs联合移植修复受损微环境,支持造血重建两种基质细胞共移植组在移植后均能促进小鼠存活,血象恢复较快,在移植后28天内恢复至照射前水平。其中,hUCBDSCs共移植组血小板受抑程度较轻,回升也较快,并于移植后21天恢复至照射前水平;h BMSCs共移植组白细胞于移植后10天迅速回升,在此后恢复趋势高于hUCBDSCs共移植组;共移植两组间血红蛋白变化趋势无显着性差异。hUCBDSCs联合移植移植后促进骨髓组织恢复,重建受损微环境,提高CFUs(CFU-F,CFU-S,CFU-GM,CFU-Mk)产率,特别是CHU-Mk数量较h BMSCs联合移植增多,提示hUCBDSCs对于促巨核系增殖分化具有重要作用。结论:1. hUCBDSCs能促进脐血单个核细胞增殖、粘附和迁移,且促增殖能力较h BMSCs强。人脐血源基质细胞显着表达一些归巢相关因子的mRNA。2. hUCBDSCs联合移植能提高移植后小鼠造血植入率,特别当造血细胞输注为低剂量时,这种作用更加显着。3. hUCBDSCs联合移植能促进造血细胞早期迁移归巢至骨髓和脾脏,提高归巢效率。4. hUCBDSCs联合移植能提高小鼠存活,促进移植后造血重建并修复受损微环境。
参考文献：
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