钱虹妹[1]2004年在《农杆菌介导的一种新型鲑鱼降钙素（msCT）转化生菜的研究》文中研究指明骨质疏松症严重地威胁着人类健康，随着人口结构老龄化其发病率有逐年增加趋势。 降钙素(calcitonin，CT)是甲状腺内的滤泡旁细胞(C细胞)分泌的一种32肽激素，1985年被FDA批准用于OP(原发性骨质疏松)的治疗，降钙素可以与破骨细胞表面受体结合抑制破骨细胞增殖，阻止骨溶解，对骨质疏松症治疗有确切疗效。利用植物生物反应器生产降钙素对于解决临床急需、材料来源有限、降低生产成本和提高安全性均具有积极意义。 本研究以生菜作为生物反应器来表达降钙素中生物活性较高的鲑鱼降钙素，以期通过鲜食表达降钙素的生菜达到防止或治疗骨质疏松目的。首先按植物偏爱密码子设计合成了编码鲑鱼降钙素的msCT基因，为了提高msCT吸收效率，从C_(83912)菌株克隆了菌毛蛋白基因pil，并将其连于目的基因msCT的5’端，形成了融合基因pil-sCT；其次考虑到转基因产品安全性构建了含“twin T-DNAs”的植物双元表达载体p35S-2300-twin T-DNAs：：pil-sCT：：noster，通过冻融法导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105中，构建基因工程菌；然后采用农杆菌介导法转化生菜(皱叶生菜)，获得卡那霉素抗性植株169株，对转基因T_0代植株进行PCR检测，有35株为阳性，阳性率为20.7％；对其中的4个株系(9号、19号、37号和50号)T_1代的358株PCR检测，阳性植株263株，阴性苗95株，基本符合孟德尔的3：1分离比例；进一步的分子检测、植物中表达msCT活性的检测和动物实验正在进行中；该研究对利用植物系统表达外源药用蛋白进行了初步地尝试，将对进一步的研究提供了最基本的技术平台和理论依据。
梁利恒[2]2011年在《重组sCT-CGRP基因转生菜体系的建立及表达的研究》文中研究表明心血管疾病与骨质疏松症正威胁着人类的生命健康,尤其给老年人的生活带来严重影响。目前治疗两种疾病的有效药物分别是降钙素基因相关肽(hαCGRP)和鲑鱼降钙素(sCT),但目前临床用hαCGRP与sCT主要是通过组织提取或化学合成的方法获得,存在来源有限和价格昂贵等问题。本课题为了满足同时预防和治疗心血管疾病与骨质疏松症的要求,应用基因工程技术对重组鲑鱼降钙素与降钙素基因相关肽(msCT-hαCGRP)融合基因进行了研究,并已成功将msCT-hαCGRP融合基因整合到植物双元表达载体中。研究拟利用生菜作为表达系统来表达该融合基因。选择美国大速生生菜品种,通过对再生体系的优化,获得最优再生条件:8%次氯酸钠对种子消毒灭菌30 min,播种于1/2 MS无菌培养基,取苗天数7 d,子叶柄为受体材料,正面朝上接入不定芽分化培养基。利用本实验室构建的重组基因工程菌株pBI AMV/hαCGRP/msCT EHA105,通过对遗传转化体系的优化,获得最佳转化条件:筛选分化培养基中Cefx浓度500 mg/L,Kan浓度25 mg/L,转化过程预培养2 d,菌液浓度OD600值0.1,侵染时间5 min。选择10株转基因抗性生菜进行扩大繁殖,对后代植株提取基因组DNA进行PCR检测,发现有8株表现为阳性,转基因阳性率为80%。选择一株阳性植株提取融合基因进行DNA序列测定,结果表明已成功将msCT-hαCGRP融合基因导入生菜基因组中,获得了具有保健和药用功能的生菜新品种。最终期望通过直接食用或提取融合表达产物来达到预防和治疗心血管疾病与骨质疏松症的目的。
参考文献：
[1]. 农杆菌介导的一种新型鲑鱼降钙素（msCT）转化生菜的研究[D]. 钱虹妹. 南京农业大学. 2004
[2]. 重组sCT-CGRP基因转生菜体系的建立及表达的研究[D]. 梁利恒. 黑龙江大学. 2011