1拉萨市人民医院儿科 西藏拉萨 850000；2徐州医学院附属医院儿科 江苏徐州 221002
摘要：目的 探讨苦参碱对人横纹肌肉瘤RD细胞株CyclinD1、Fas和凋亡的影响。方法 对数生长期的人横纹肌肉瘤RD细胞株，不同浓度苦参碱（0、0.5、1.0、1.5mg/ml）分别作用48h后，RT-PCR法检测CyclinD1和Fas mRNA的表达，流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果 RT-PCR结果显示，CyclinD1/β-actin比值分别为0.59±0.06、0.35±0.05、0.27±0.02、0.05±0.01，各实验组与对照组比较、实验组两两比较差异均有统计学意义（P＜0.01）；Fas mRNA的表达：对照组及各实验组的灰度值分别为：0.322±0.02、0.393±0.025、0.516±0.404、0.707±0.252，各实验组与对照组比较、实验组两两比较差异均有统计学意义（P<0.05）；流式细胞仪检测对照组及各实验组细胞凋亡率分别为（3.61±0.212）%、（8.70±0.232）%、（17.26±0.12）%、（29.52±0.348）%。各实验组与对照组比较、实验组两两比较差异均有统计学意义（P<0.05）。结论 苦参碱能下调横纹肌肉瘤RD细胞的CyclinD1 mRNA，上调Fas mRNA，诱导横纹肌肉瘤RD细胞的凋亡。
关键词：苦参碱；横纹肌肉瘤；CyclinD1；Fas mRNA；细胞凋亡
ABSTRACT：Objective Approach the effect of matrine on CyclinD1 and Fas of human rhabdomyosarcoma RD cells.Methods Affter the human rhabdomyosarcoma RD cells line treated with matrine of different concentrations（0、0.5、1.0、1.5mg/ml）for 48hours
respectively，the expressions of CyclinD1 and Fas mRNA were examined by RT-PCR，and cells apoptosis rates were examined by flow cytometry（FCM）.Results The results of RT-PCR showed that expressions ofCyclinD1 mRNA were0.59±0.06，0.35±0.05、0.27±0.02、0.05±0.01，respectively（P＜0.01），Fas mRNA were 0.322±0.020、0.393±0.025、0.516±0.404 and 0.707±0.252，respectively（P＜0.05）.The total apoptosis rates were（3.61±0.212）%、（8.70±0.232）%、（17.26±0.120）%、（29.52±0.348）%，respectively（P＜0.05）.Conclusion The CyclinD1 mRNA of RD cells is down- regulated，the Fas mRNA is up-regulated，and the apoptosis is induced by matrine.
Key words：Matrine；Rhabdomyosarcoma；CyclinD1；Fas mRNA；Cell Apoptosis
近年来，苦参碱的抗肿瘤作用越来越引起国内外学者的关注，然而，苦参碱抗肿瘤作用的相关机制仍不清楚，我们通过苦参碱作用于儿童软组织肿瘤中最常见、恶性度高的人横纹肌肉瘤RD细胞株，来探讨苦参碱抗肿瘤的作用机制。
1.材料和方法
1.1材料 人横纹肌肉瘤RD细胞株购自上海中科院细胞库，苦参碱购自陕西中鑫生物技术有限公司，总RNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司，细胞凋亡检测试剂盒购自上海碧云天生物公司，PTC-200型PCR仪购自美国MJResearch公司，RT-PCR 两步法试剂盒购自北京天根生化科技有限公司，CyclinD1、Fas和β-内因子（β-actin）引物购自上海艾博思生物有限公司，CyclinD1、FAS单克隆抗体购自Santa Cruz公司，CO2恒温培养箱购自美国LRB MODEL 2300，FACS流式细胞仪购自美国Becton-Dickinson公司。
1.2方法
1.2.1细胞培养和传代 细胞置于含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的RPMI 1640培养瓶内，置37℃、5%CO2的培养箱中孵育，每2-3天换液一次，当细胞覆盖率达80-90%时，按1：3传代，取对数生长期的细胞进行试验。
1.2.2实验分组 药物干预组：苦参碱浓度分别为 0.5、1.0、1.5（mg/ml）；对照组：含等量细胞、培养液及稀释苦参碱的等量溶剂RPMI1640培养基，不加苦参碱。细胞6-12h贴壁，处理后继续培养48h，每组设5个复孔。
1.2.3 RT-PCR法检测CyclinD1和Fas的表达 每瓶细胞接种浓度为107个，贴壁，处理后收获细胞，Trizol提取试剂盒提取RNA，-80℃保存；按说明书步骤逆转录mRNA为cDNA；PCR扩增，CyclinD1引物上游序列为5'-GGAGCTGCTCCTGGTGAACA-3'，下游序列为5'-TGTTGGGGCTCCTCAGGTTCA-3'，扩增的目的片段长度为245bP；Fas引物上游序列5'-GTCCAAAAGTGTTAATGCCCAAGT-3'，下游序列为5'- ATGGGCTTTGTCTGTGTACTCCT-3'，扩增的目的片段长度为232bP；β-actin引物上游序列为5'-TCACCACCACAGCCGAAAG-3'，下游序列为5'- GGTCAGCAATGCCAGGGT-3'，扩增的目的片段长度为300bP。将产物94℃变性2min，CyclinD1 54℃退火1min，72℃延伸 1 min，35个循环，最后一次循环72℃延伸10min；Fas mRNA64℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环，最后一次循环72℃延伸2min。终止反应后，产物于-20℃保存，1.5%琼脂糖-凝胶电泳，80V电泳40min；利用电脑成像统计泳带密度，通过密度分析测定目的基因产物与内参照基因产物的比率（PCR率），半定量分析目的基因的表达。
1.2.4 FCM法检测细胞凋亡率 收集细胞，PBS洗两遍并离心（2000rPm、5min），加入500μl Binding Buffer悬浮细胞，加入5μl Annexin-V-FITC混匀，加入5μl PI，室温，避光，染色15min后，于1h内流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。
1.3统计学处理：实验数据以均数±标准差（±s）表示，采用SPSS16.0统计软件进行统计学分析。各组间比较采用单因素方差分析法（One-way ANOVA），检验水准：α=0.05。
2结果
各组CyclinD1、Fas mRNA表达和细胞凋亡率见表1
与对照组比较：△P＜0.01，﹡P＜0.05；实验组两两比较：△P＜0.01，﹡P＜0.05。
3讨论
我们的实验结果显示，苦参碱（Matrine）作用于人横纹肌肉瘤RD细胞株后，RD细胞株凋亡率增加，Cyclin D1下调，Fas上调，均存在浓度依赖性。
肿瘤的发生、发展和凋亡是一复杂过程，受许多因素影响，多种细胞因子和通路参与调控。以Cyclins/CDKs/CKI/PRb为核心的G1/S期细胞周期网络调控系统是肿瘤发生中最常改变的共同通路[1、2]，调控G1/S期限制点的各细胞周期调节因子，成了肿瘤相关DNA病毒所产生的致瘤蛋白活化细胞周期的靶子。其中，Cyclin D1与肿瘤关系最为密切，在多种恶性肿瘤中均高表达，与肿瘤的发生、发展及对化疗药物的反应均有密切的关系[3、4]。下调Cyclin D1能起到促进肿瘤细胞凋亡，抑制增殖的目的[5、6]。Fas则是重要的细胞凋亡启动基因，其基因表达产物属于肿瘤坏死因子受体家族，Fas与相应配体结合后，通过其胞内段的死亡域与胞浆内含有死亡域的Fas相关蛋白（FADD）分子羧基端的死亡域相互作用，FADD的氨基端含有死亡效应域（DED），该区域可与Caspase-8酶原的DED相互作用，把Caspase-8募集到Fas区域。Fas、FADD和Caspase-8形成凋亡诱导信号复合体，引起Caspase-8激活，最终将在细胞内以无活性的酶原形式存在的Caspase-8前体（ProcasPase3）活化、进一步剪切为活性片段而诱导细胞凋亡[7～11]。
苦参碱是豆科槐属植物苦参中所含的一种生物碱，具有抗炎、抗病毒、抗纤维化、抗心律失常、免疫抑制、中枢抑制等多种药理作用[12]。近年来的研究表明，苦参碱能通过抑制肿瘤细胞增殖、诱导凋亡而发挥抗肿瘤作用[13-15]，且因其毒副作用远小于常规化疗药物而备受关注，但其抗肿瘤的作用机制尚不清楚。
我们认为，苦参碱下调Cyclin D1，使RD细胞株停留在G0/G1期，细胞增殖受阻，同时上调Fas，启动细胞凋亡通路，加速细胞凋亡，是其抗肿瘤作用的机制之一，这种作用随着苦参碱浓度的增加而增加。
参考文献：
[1]Wang MT，Chen G，et al.Prognostic significance of cyclinD1 amplification and the co-alteration of cyclinD1/pRb/ppRb in patients[J]Dis Esophagus.2012；25（7）：664-70
[2]Bartek J，Lukas J，et al.Perspective defects in cell cycle control and cancer[J].Pathol，1999；187：95-9
[3]王前，邓晶，等．cyclin D1的研究进展［J］．现代肿瘤医学，2009；17（2）：350-3
[4]Feng Z，Chen J，et al，The risk factor of gallbladder cancer：hyperplasia of mucous epithelium caused by gallstones associates with p16/CyclinD1/CDK4 pathway.Exp Mol Pathol[J].2011；91（2）：569-77
[5]Jung KH，Noh JH et al.Targeted disruption of Nemo-like kinase inhibits tumor cell growth by simultaneous suppression[J].J Cell Biochem.2010；110（3）：687-96
[6]Guo L，Xue TY，et al.Effects of matrine on the proliferation and apoptosis of human rhabdomyosarcoma RD cells[J].Zhongguo Dang Dai Er Ke Za Zhi.2012；14（10）：780-4
[7]Ramaswamy M，Siegel RM.Autoimmunity：twenty years in the fas lane[J].J Immunol.2012；189（11）：5097-100
[8]Uesugi K，Hiasa Y，et al.Wilms' tumor 1 gene modulates Fas-related death signals and anti-apoptotic functions[J].J Gastroenterol.2012
[9]Grunert M，Gottschalk K，et al.The adaptor protein FADD and the initiator caspase-8 mediate activation[J].Cell Death Dis.2012；3：e414
[10]Yang D，Torres CM，et al.Decitabine and vorinostat cooperate to sensitize colon carcinoma cells[J].J Immunol.2012；188（9）：4441-9
[11]Mata JF，SilVeira VS，et al.Low mRNA expression of the apoptosis-related genes CASP3，CASP8，and FAS is associated with low induction treatment response[J].Pediatr Blood Cancer.2010；55（1）：100-7
[12]许红兰.苦参的药理研究进展[J].现代医药卫生，2008；24（20）：3066-7
[13]Zhao B，Li B，et al.Effects of matrine on proliferation and apoptosis of cultured retinoblastoma cells[J].Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol.2012；250（6）：897-905
[14]Wu DJ，Zhou YH，et al.Study on matrine alleviating retinoic acid resistance in acute promyelocytic leukemia.Zhonghua Xue Ye Xue Za Zhi.2011；32（5）：313-6
[15]Li H，Tan G，et al.Therapeutic effects of matrine on primary and metastatic breast cancer[J].Am J Chin Med.2010；38（6）：1115-30
论文作者:樊丽1,高吉照2,薛天阳2,许伟2,郭雷2,李艳2
论文发表刊物:《健康世界》2015年11期供稿
论文发表时间:2016/2/1
标签：细胞论文; 横纹肌论文; 实验组论文; 凋亡论文; 细胞株论文; 肉瘤论文; 苦参碱论文; 《健康世界》2015年11期供稿论文;