（黑龙江省中医药科学院 黑龙江哈尔滨 150036）
【摘要】 目的：探讨黄曲霉毒素的检测方法。方法：对黄曲霉毒素的检测方法较多，现对荧光反应，产毒株的筛选法，薄层层析法，高效液相色谱法，酶联免疫吸附法进行分析。结果: 黄曲霉毒素B1、B2、G1和 G2，在天然被污染的食品中，一般以黄曲霉毒素B1最多，而黄曲霉毒素B1、B2、G1只占很小部分，B1、G1毒性强，有致癌性。结论：早期研究时根据毒素在薄层板上产生荧光颜色不同，分为黄曲霉毒素B族和G族。由于黄曲霉毒素的剧毒性，强致癌性及存在的广泛性。
【关键词】 黄曲霉毒素；检测
【中图分类号】R446 【文献标识码】A 【文章编号】1007-8231（2015）15-0221-02
黄曲霉毒素是由黄曲霉产生的一种强致癌毒素，黄曲霉毒素主要来源于污染的玉米及花生油，黄曲霉毒素的检测方法较多，其生物学方法主要用于检测毒性，如鸡胚、鸭雏、大白鼠、小白鼠试验等，随灌喂毒素的多少及时间而引起动物的中毒死亡或出现肿瘤[1]。黄曲霉毒素还能产生荧光，有人将从含黄曲霉毒性的花生仁中分离出的酵母菌，接种于培养基后，培养基能产生荧光。现对检测方法分析如下。
1.荧光反应
取白色惰性硅藻土(本身无荧光)，可消除菌丝所产生的荧光干扰)，180℃干燥灭菌1小时，适量铺于平皿底，混入少量冷却至50℃的琼脂，凝固后倒入适量培养基制成平板，接种菌悬液于半个平板，30℃孵育，当生长良好时将平皿倒置，置紫外灯下观察，有特异的蓝色荧光出现，判为阳性[2]。在薄层层析板上，黄曲霉毒素B1、B2、G1与G2的荧光强度排列次序为：B2>G2>B1>G1，用荧光法测定黄曲霉毒素，所用的激发光波长为365毫微米，荧光波长B1、B2为435毫微米，G1、G2为465毫微米。
2.产毒株的筛选法
微栓过筛法：薄层层析法称TCL证实。即将部分净化后的提取液直接上微栓测定，毒素被硅镁型吸附剂或硅胶吸附后，在紫外光下呈蓝紫色荧光环，若无蓝紫色荧光环即为未检出。AM法筛选，TLC法证实：使用Difico公司AM培养基的配方，培养基灭菌后，分装无色比色管，用活化的菌种接种，28℃暗处培养。分别在接种后，培养4、7、14天，用cs-930扫描仪测定比色管的荧光强度，荧光强度增加1.00以为筛选阳性。阳性培养物用TLC法(国际标准法)测定和证实黄曲霉毒B1的含量，使每毫升提取液含1.69克培养物，这样最低检出量是12ppb。
3.薄层层析法
花生或花生制品样品以氯仿或70％丙酮水溶液，或甲醇：水(55：45)体积比，己烷等抽提，获样品抽提液。硅酸柱层析洗脱提纯，洗脱提纯的黄曲霉毒素以硅胶板薄层层析法测定。
3.1 AOAG方法(GB法)
用50g花生或花生制品样品加25ml水，25g硅藻土与250ml氯仿，震荡提取30分钟，过滤获样品提取液。层析朴直径22mm，长300mm，在柱底部加5g无水硫酸钠，再加上氯仿至占容积的一半高度后加入硅胶(粒度0.05～0.20μm)10g，以氯仿洗柱壁制层析柱，上层加无水硫酸钠，使氯仿存留高度与无水硫酸钠表面相齐，然后加样品提取液(约50ml)，以150ml己烷与150ml乙醚冲洗，最后以150ml甲醇：氯仿(3：97体积比)洗脱黄曲霉毒素，将此溶液收集挥发，加入少量氯仿在硅酸层析板上作薄层层析。展开剂为丙酮：氯仿。注意薄层层析的一些影响因素，如硅胶与硫酸钙的牌号、硅胶颗粒的大小、混入硅胶中硫酸钙比例、硅胶薄层板的厚度及含水量、展开槽中溶剂气体的组成以及展开剂种类等[3]。
3.2 层析板的制备方法
硅胶85g加15g石膏充分混合，取约3g于小研钵内加入约3倍的蒸馏水，用力研磨1～2分钟搅成糊状后倒入涂布器内推成三张厚约250μm的薄层板，在空气中干燥约15分钟后，或等薄层凝结后，在100℃烘2小时活化后放干燥器内待用(一般可保存2～3天)。点样以微量注射器或小毛细管点，注意标准样液约10μl待测液约20μl。观察结果可用10～125瓦紫外灯观察荧光点。
4.高效液相色谱法
用高压液相色谱(HPLC)测定黄曲霉毒素是近年较普遍应用的方法。
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4.1 仪器
高压液相色谱仪(Waters公司生产)，备有6000A型泵，420型荧光鉴定器，Ex 360nm Em425nm滤光片，U6K进样器，730型数据处理机，柱10μm C18 10cm；FSF型样品粉碎机；FZQ-A型分析振荡器；康氏电动振荡器；具活塞玻璃层析管(8×280nm)。
4.2 黄曲霉毒素(AFT)标准液的制备，准确称取AFTB，纯结晶溶于苯：乙腈(98∶2)，配成10μg／ml的贮备液，再取出一定体积稀释成10倍，配成1μg／ml的使用液，AFTG1、G2、B2按同法配制，AFTM1用氯仿配制。
4.3 样品处理
玉米、大米、花生经粉碎，过20目筛后，称取10.0g置200ml具塞三角烧瓶内，加入50ml氯仿和5ml水(花生加1ml)，盖紧瓶塞于振荡器上振荡30分钟，加入10g无水硫酸钠(花生不加)放置10分钟，经快速定性滤纸滤入具塞量筒中，再进一步净化。花生油经充分混匀，称取1.00g。用6ml氯仿分3次移入硅镁型吸附剂柱中直接净化处理。
4.4 净化反应与衍生反应
在层析管下端插塞一小团脱脂棉.加入约2ml无水硫酸钠和氯仿5ml，轻击管壁使紧密。称取0.4g硅镁吸附剂置于小烧杯内，用氯仿调成糊状移入管中，打开活塞，吸附剂随氯仿下沉，轻敲管壁并用少量氯仿洗管壁，再加入无硫酸钠约2cm高。当氯仿液或其它洗脱液流至硫酸钠表面时，按先后顺序加入样品萃取液5ml、氯仿-己烷(1∶1)8ml、氯仿-甲醇(9∶1)10ml，淋洗除去杂质，最后用20ml丙酮-水(99∶1)洗脱AFT，收集于50ml烧杯内，在50℃水浴中将溶剂挥至近干，以氯仿分次将残渣洗入2ml具塞试管中，再置于50℃水浴中通氮气吹干。向试管中加入200ml正己烷，50μl TFA，将试管塞紧，置分析振荡器上混匀30分钟，反应30分钟后用氮气吹干，加入100μl流动相，充分混匀，即可作HPLC测定。
4.5 标准液处理
取适量标准液，按样品同样过柱和衍生化、定容，使AFT最后浓度为0.1μg／ml。
4.6 HPLC测定
色谱条件流动相流速为1.3ml／min(压力约350Pa)，液相色谱仪稳定后开始进样，先注入已衍生化的标准AFT 10μl，设好730处理机工作条件，由峰高计算出响应因子，再注入样品液即可自动打印出该样品液中的AFT含量。
5.酶联免疫吸附法
黄曲霉毒素M1(AFM1)是黄曲霉毒素B1(AFB1)在哺乳类动物体内的主要代谢产物，经由乳、尿排出。分析AFM1的方法主要有薄层层析法，高效液相色谱、液相色谱法，但需复杂的提取步骤或昂贵的仪器，所以虽然灵敏度较高，但推广仍较难。八十年代建立了过氧化物酶标记的 AFM1的直接竞争酶联免疫吸附(ELISA)法，但AFM1与酶结合技术难于掌握和方法回收率不理想，以后在人们获取了AFM1抗体后又建立了间接竞争ELISA法，利用生物放大效应，提高方法灵敏度，使乳粉中AFM1最低检出量达Pg水平。方法如下。
5.1 AFM1抗体制备
取AFM1-牛血清白蛋白(BSA)结合物(Sigma公司产品)与福氏佐剂混制成乳剂，按表1程序免疫家免。分别于每次免疫注射前取兔耳血，测定血清AFM。抗体效价。于最后一次免疫后10天，经兔颈动脉插管放血.分离血清，用饱和硫酸铵溶液沉淀提取AFM1抗体(IgG)。
5.2 样本处理
称取乳粉样本，按1／4(W／V)加入70％甲醇溶液溶解，振摇过滤，滤液置4℃过夜，离心(2500rpm／min)取上清液，用PBS稀释10倍，混匀待测。
6.间接竞争ELISA法
包被抗原-溶菌酶蛋白结合物(AFB1-Lys)置4℃过夜。向板孔中加入样液(或标准溶液)和AFM1抗体(1∶5000)稀释液，37℃孵育1.5h。加HRP标记羊抗兔IgG(北京生物制品研究所)，(1∶2000)，37℃ 1.5h。每孔加酶底物邻苯二胺溶液显色后，终止反应[4]。每块酶标板均设空白、阴性、阳性三种对照孔。每步操作前要洗板3次，并吸净。检测及判定,用ELISA仪在490nm处测吸光度，以AFM。标准溶液浓度及其对应的吸光度百分值(OD％)绘制标准曲线，根据此标准曲线计算样品中的 AFM1含量。此法具有操作简便、安全、快速、高效、费用低廉等优点，适于大批量样本AFM1的筛选，是一种较好的检测食品中AFM1的新方法。
7.讨论
黄曲霉毒素其代谢主要由肝的上清液及微粒体酶的作用而脱甲氧基、羟化及环氧化。香豆素环的-OCH3基由微粒体酶脱去甲基而生成黄曲霉毒素P1，生成的羟基再分解为葡糖醛酸甙和硫酸脂从尿中排出。由在上清液存在的酶在还原型烟酰胺腺嘌呤磷酸二核苷酸存在情况下环戊烷还原成为黄曲霉毒醇，在肝微粒中的药物代谢酶作用下，黄曲霉毒素B1再羟化为M1。许多研究发现黄曲霉毒素B1的二呋喃环末端的双键的环氧化代谢产物与黄曲霉毒素的毒性、致癌性和致突变关系密切。能抑制DNA合成，减少人淋巴细胞有丝分裂，增加染色体畸变。
【参考文献】
[1]蔡其洪.黄曲霉毒素检测方法的应用及进展[J].现代食品科技. 2006. 22(2):233-236.
[2]高秀洁，邓中平，焦红等.黄曲霉毒素B1快速检测方法的研究进展[J].热带医学杂志.2008(12):1297-1300.
[3]柳洁，何碧英.黄曲霉毒素高效液相色谱检测方法研究进展[J].中国卫生检验杂志. 2005, 15(7):891-896
[4]刘作新，高军侠.黄曲霉毒素的检测方法研究进展(综述) [J].安徽农业大学学报. 2004, 31(2):223-226
论文作者:陆春光
论文发表刊物:《心理医生》2015年15期供稿
论文发表时间:2016/5/10
标签：黄曲霉论文; 层析论文; 毒素论文; 氯仿论文; 薄层论文; 荧光论文; 样品论文; 《心理医生》2015年15期供稿论文;