韩丽君[1]2003年在《有机磷农药的酶免疫化学研究》文中提出农药小分子的酶免疫化学研究可以是针对单个化合物制备特异性抗体，也可以针对一类化合物制备“簇特异性”抗体从而进行多残留免疫分析。本论文第一部分首次较为系统地针对常用的二甲氧基(硫代)磷酸酯类农药化合物的共性结构进行了多残留酶免疫分析研究，合成了叁种具有共性结构特征的半抗原，并成功地得到了两种具有“宽谱特异性”的抗体。 根据我国常用的有机磷酸酯类农药的结构特征，将它们归为叁类：(1) 芳环硫代磷酸酯类，如甲基对硫磷、杀螟硫磷、甲基嘧啶磷等；(2) 直链硫代磷酸酯类，如乐果、马拉硫磷等；(3) 乙烯基磷酸酯类，如久效磷、磷胺、速灭磷等农药，分别针对它们的共性结构合成了叁种半抗原(分别简称为MP、SP和VP)，以期得到对结构类似化合物具有“宽谱特异性”的多克隆抗体。针对这叁种半抗原的活性基团特征，通过直接氨解法、重氮化法、混合酸酐法或活性酯法等方法，使之与不同的载体蛋白偶联，分别合成了人工抗原。以各种半抗原与BSA的偶联物作为免疫原进行动物免疫，分别得到了针对半抗原MP和SP的高效价抗体(VP免疫未成功)。获得的MP和SP抗血清与相应包被原结合的中点效价均为1∶12800倍，终点效价均大于50000倍。 采用间接竞争性ELISA方法，分别以甲基对硫磷和SP半抗原作为小分子竞争物，对其免疫分析条件进行了试验和筛选，在优化条件下建立了针对甲基对硫磷和SP半抗原的标准抑制曲线和回归方程。在此基础上进行了其它结构类似化合物的抑制试验。结果表明，甲基对硫磷对MP抗原抗体结合反应的I_(50)为0.13μg／mL，该抗体对杀螟硫磷和倍硫磷表现了较高的交叉反应性，二者的I_(50)分别为0.50μg／mL和0.35μg／mL。方法对这叁种农药的检测限(I_(20))分别为6.7、20.9和12.1ng／mL，说明产生的抗体对叁种农药均有识别能力，可用于叁种农药的多残留检测。采用所建立的ELISA方法测得黄瓜中甲基对硫磷、杀螟硫磷和倍硫磷叁种农药的添加回收率分别为83.10％～93.46％，80.45％～95.78％和74.89％～86.78％；C.V％分别为2.36％～10.36％，5.14％～7.14％和4.40％～6.34％，结果与GC测定数据基本吻合，在黄瓜中的最低检出浓度分别为0.003、0.01和0.006mg／kg，均低于相应的MRL值，符合残留分析的要求。 SP产生的抗体对乙酰甲胺磷、乐果、甲基对硫磷和马拉硫磷都表现了一定的交叉反应，四种化合物对SP抗原抗体结合反应产生抑制的I_(50)分别为2.66、3.31、8.26和14.9μg／mL，方法检测限(I_(20))分别为0.05、0.15、0.19和0.53μg／mL。表明针对这种化合物的共性结构产生的抗体对这些结构类似的化合物能够有一定的识别能力。 毒死蜱是一种中等毒性的广谱有机磷农药，在国内外农业生产中大量使用。本论文第二部分在国内首次进行了毒死蜱的免疫化学研究，并成功制备了针对毒死蜱的特异性抗体。从毒死蜱的磷酸酯乙氧基部位引入5-C间隔臂，通过混合酸酐法和活性酯法与不同的载体蛋白偶联，制备了人工抗原。以其BSA偶联物作为免疫原进行动物免疫，得到了对毒死蜱具有高度特异性和亲和力的高效价抗体。抗血清与包被原结合的中点效价为12800倍，终点效价大于50000倍。采用间接竞争性ELISA方法对免疫分析条件进行了试验和优化，建立了毒死蜱的标准抑制曲线和回归方程。中国农业大学博士学位论文 摘要一毒死婢对抗原抗体结合反应的I。。为 76．snghL，方法对毒死婢的检测限（I。。）为5．2 nghL。除甲基毒死婢以外uR％为66．9％），抗体对其它有机磷农药均不表现交叉反应。土壤、黄瓜和河水中毒死婢的添加回收率分别为73．sl％～89．45％、76．93％～102．吕％和89．30％～103．2％，Cv％分别为5．28％～9．83％、7．62％～12．25％和4．04％～5．18％，与GC测定数据基本吻合，最低检出浓度分别为0刀05mghg、0．003mghg和0．08pgh，均低于其在蔬菜中的MRL值，符合残留分析的要求。利用抗体进行的酶免疫分析方法灵敏度、准确性较好，操作简便，适于大量样本的快速筛选，可作为快速测定工具予以开发和利用。
郑伟华[2]2004年在《溴氰菊酯降解产物的免疫分析方法研究》文中研究表明为探索小分子免疫化学分析的基本规律并应用于农药残留分析实践，本论文选择拟除虫菊酯杀虫剂溴氰菊酯为研究对象，探讨溴氰菊酯残留的酶联免疫分析方法。 对二溴菊酸进行结构改造，合成了两种结构类似的溴氰菊酯半抗原，并进行结构鉴定。将两种半抗原分别与载体之一（四种蛋白和一种人工合成多肽）共价偶联。对不同的偶联物进行紫外光谱鉴定并估算偶联比。 选择偶联物 HⅠ-BSA 和 HⅡ-BSA 为免疫原免疫小鼠制备多克隆抗体。分别用得到的两种多克隆抗体建立溴氰菊酯降解物的衍生物的间接酶联免疫分析法，并进行河水的添加回收测定。 采用间接法检测血清效价，抗血清 HⅠ-BSA-2、HⅡ-BSA-3 的工作效价分别为 6.4×104 和 3.2×104，终点效价为 2.56×105。 抗 HⅠ血清 HⅠ-BSA-2、抗 HⅡ血清 HⅡ-BSA-3 的间接竞争 ELISA 工作条件为：包被原 HⅡ-OVA、HRP 酶标二抗的工作浓度分别为：2.12 ug/mL (1:5000)、2 ug/mL（1:500）；抗体 HⅠ-BSA-2 和 HⅡ-BSA-3 的稀释倍数都是 1:10000；竞争在 37℃下进行 30 min；半抗原 HⅠ、HⅡ以甲醇为溶剂。 用抗HⅠ抗体 HⅠ-BSA-2建立间接ELISA法测定溴氰菊酯半抗原HⅠ和HⅡ的 IC50分别为 54.5 ng/mL 和 26.9 ng/mL；多克隆抗体与溴氰菊酯、胺菊酯、氯氰菊酯、二溴菊酸、二溴菊酸甲酯的交叉反应均小于 0.1%。在河水样品中添加 HⅠ浓度为 50ng/mL 时，间接 ELISA 法的回收率为 75.64～90.45%；在河水样品中添加 HⅡ浓度为30 ng/mL 时，间接 ELISA 法的回收率分别为 87.30～104.32% 。 用抗HⅡ抗体 HⅡ-BSA-3建立间接ELISA法测定溴氰菊酯半抗原HⅠ和HⅡ的 IC50分别为 63.2 ng/mL 和 5.56 ng/mL，多克隆抗体与溴氰菊酯、胺菊酯、氯氰菊酯、二溴菊酸、二溴菊酸甲酯的交叉反应均小于 0.1%。在河水样品中添加 HⅠ浓度为 75ng/mL 时，间接 ELISA 法的回收率为 73.4～88.7%；在河水样品中添加 HⅡ浓度为 5ng/mL 时，间接 ELISA 法的回收率分别为 80.8～105.4% 。 两种抗体对半抗原 HⅠ和 HⅡ即溴氰菊酯降解物二溴菊酸的四碳和六碳衍生物的特异性较强，可以用于溴氰菊酯降解产物的残留分析检测。
刘毅华[3]2008年在《对硫磷半抗原分子设计研究》文中指出半抗原的分子设计与合成是建立小分子免疫化学分析方法的关键步骤,也是开展免疫化学研究的核心内容。本研究选取代表性有机磷杀虫剂对硫磷作为研究对象,通过研究农药半抗原结构与由其制备的免疫原的免疫活性之间的结构—活性关系(Structure Activity Relationship,SAR),探索了影响抗原免疫活性的一般规律,初步建立了免疫半抗原合理设计模型。研究采用分子结构参数化的方法,引入分子连接性指数法和分子模拟法设计农药免疫半抗原分子结构,计算了设计的42个免疫半抗原分子与对硫磷之间的欧氏距离,根据欧氏距离的大小来判定分子结构之间的相似性,并通过平衡透析和ELISA测定对计算结果进行验证和比较。研究表明分子连接性指数法适于表征半抗原的立体结构而对电性结构表现不足;分子模拟法则相反,能较好地表征半抗原分子结构的电性参数,这两种方法的结合能够更好地表征半抗原与目标化合物之间的分子相似度。因此采用分子连接性指数(MGI)与电性参数(EP)结合的方法建立了相应的分子设计模型,该模型能够较好地指导小分子农药免疫半抗原的分子设计。在采用MCI+EP的方法建立小分子农药免疫半抗原分子设计模型的基础上,进一步探讨了小分子农药竞争半抗原分子设计原则。首次提出了目标物(P)、免疫半抗原(I)、竞争半抗原(C)之间关系的叁角形模型理论:CP＞CI,即CP—CI＞0;Max(CP-IP),且CP＞IP,即CP—IP＞0;Max(CI)。同时结合异源ELISA方法及其结果,研究建立竞争半抗原分子结构与其反应原性之间的SAR关系后,提出了小分子农药竞争半抗原分子设计模型,并进一步提出了叁角模型的临界条件CI=2-4;CP=1-4。然后采用竞争半抗原(hapten 0325)对提出的竞争半抗原分子设计模型及其临界条件进行了验证。根据研究建立的免疫半抗原/竞争半抗原分子设计模型,在设计的42个半抗原中,筛选出0204/0322的组合,标准曲线方程为:y=10.012Ln(x)+32.768,IC_(50)为5.60 ng/mL,IC_(10)为0.10 ng/mL。进一步研究了免疫半抗原/竞争半抗原优化组合对ELISA分析方法的影响,结果表明:0204/0322组合的异源ELISA方法异源分析方法对对硫磷的检测灵敏度高于同源分析,以IC_(10)计,0204/0322组合相对于同源方法,灵敏度提高了16.1倍,而且该异源ELISA方法与仪器分析结果具有可比性。0204/0322组合建立的异源竞争ELISA方法对对硫磷的其它结构类似物的交叉反应率基本小于0.05%,仅甲基对硫磷为7.8%,对氧磷为2.5%。该方法应用于水、土壤、黄瓜、大米和玉米样品中对硫磷的残留检测,结果表明其检测能力均符合农药残留检测准则的要求。最后选取叁唑磷、2,4,5-叁氯苯酚和倍硫磷作为对象,对本研究提出的免疫半抗原和竞争半抗原分子设计模型进行了验证,实验数据来源均为其它研究者公开发表文章。模型验证结果证明了免疫半抗原和竞争半抗原分子设计模型的适用性和正确性,可以采用免疫半抗原分子设计模型配合合理抗体制备获得高亲和力的抗体,同时将竞争半抗原分子设计模型应用于小分子农药竞争半抗原设计,可以预测最佳竞争半抗原结构,从而提高方法的灵敏度。免疫半抗原和竞争半抗原分子设计模型的建立,对于解决目前半抗原设计从经验或是合成的难易出发而导致半抗原数量不足与设计角度的随意性,致使结果的代表性不足,不能找到半抗原合理设计的一般规律等问题具有很好的指导作用。本研究实现了半抗原的定量化、导向性设计。尤其是竞争半抗原分子设计模型的建立,对于提高免疫分析方法的特异性和灵敏度有重要意义。半抗原分子设计模型的建立将有助于丰富和完善农药残留免疫化学分析方法的基本理论,对于进一步开发农药等小分子化合物残留快速诊断技术有着十分重要的意义。
金茂俊[4]2009年在《农药残留检测的荧光和化学发光免疫分析方法研究》文中指出在课题组现有ELISA分析方法的研究基础上,进一步深化研究方法的相关影响因素,如基质效应、漂移现象及不同ELISA分析方法等。在ELISA叁种包被模式研究中,结果显示包被抗体法和包被二抗法在分析方法的方法灵敏度和数据平行性方面较包被抗原法更有优势。为建立具更高灵敏度且可商品化开发的免疫分析方法,本文对时间分辨荧光分析方法(TRFIA)和化学发光酶免疫分析方法(CLEIA)进行了系统的研究。通过对TRFIA分析方法荧光增强液中螯合剂β-NTA浓度、TOPO浓度及pH值等条件的筛选,得到了对于Eu~(3+)和Sm~(3+)这两种稀土离子具有良好性能的荧光增强液。在此基础上,通过对包被温度和时间、包被缓冲液、封闭物质、反应缓冲液等条件的优化。在优化基础上,建立了克百威的TRFIA分析方法并进行了标样添加回收率。结果表明,所建立的克百威TRFIA分析方法的检测灵敏度为1.86 ng/mL,样品添加回收率试验表明建立的克百威TRFIA分析方法可用于样品中克百威残留检测。通过对CLEIA化学发光增敏液中缓冲体系、发光增强剂、鲁米诺浓度及氧化剂浓度的筛选,得到具有良好性能的发光增敏液。在此基础上,通过对化学发光板、包被温度和时间、包被缓冲液、反应缓冲液及有机溶剂与浓度等条件的优化,结果显示:Costar白色发光板的吸附效果较佳,克百威抗体选择用0.1M,pH7.2Tris-HCl液作为包被缓冲液并在并在37℃包被两小时效果为佳,封闭物质选用1%胰蛋白胨(Tyrtone)且反应缓冲液选择0.05 M,pH7.2Tris-HCl液可得到最好的反应灵敏度和最大发光计数,有机溶剂中甲醇对CLEIA影响最小,反应体系中最终含量2.5%为佳。在此基础上,建立了克百威的CLEIA分析方法,其检测限(IC_(10))为0.362 ng/mL,检测灵敏度(IC_(50))为4.244 ng/mL,并通过LC-MS/MS数据确证。结果表明克百威CLEIA分析方法在灵敏度方面明显优于ELISA分析方法,并在样品检测中得到很好的应用,对多种样品的检测限已达到相关国家及CAC等设定的克百威MRL值。在构建成功化学发光免疫分析系统基础上,进一步将CLEIA分析方法应用到叁唑磷、毒死蜱和对硫磷叁种有机磷农药残留分析技术中,建立的叁唑磷、毒死蜱和对硫磷叁种有机磷农药的CLEIA分析方法IC_(50)值分别为0.852、21.01和2.247 ng/mL,IC_(10)值分别为0.063、0.694和0.203 ng/mL。并分别与叁种农药的ELISA分析方法的检测灵敏度和检测限进行比较,结果显示,CLEIA分析方法的检测限均有了较大的提高,特别是叁唑磷的CLEIA分析方法,相比于ELISA分析方法其检测灵敏度和检测限提高了2个数量级,显示出CLEIA分析方法在农药残留检测方面应用的良好前景。
丁晓燕, 卢平, 胡德禹[5]2011年在《酶联免疫分析方法在有机磷农药残留检测中的应用研究进展》文中提出对近年来酶联免疫分析方法(ELISA)在有机磷农药残留检测分析中的研究进展及其前景进行了阐述。
王春梅[6]2010年在《有机磷高特异性和宽谱单克隆抗体的筛选与比较研究》文中研究表明抗体的制备是小分子免疫化学分析方法的关键步骤,也是开展免疫化学研究的核心内容。为充分发挥异源免疫分析(免疫半抗原与竞争半抗原的结构不同)的优势,提高杂交瘤细胞的筛选效率,获得更高特异性或宽谱选择性的单克隆抗体,本研究选取有机磷类农药为研究对象,将异源ELISA引入到杂交瘤细胞的筛选过程中,提出并建立了一套高特异性和宽谱单克隆抗体的筛选体系。研究采用20种竞争原建立异源ELISA方法同时筛选杂交瘤细胞,获得了10株单克隆抗体,其中新制备得到的抗对硫磷高特异性单克隆抗体与传统方法(同源ELISA方法,免疫半抗原与竞争半抗原的结构相同)制备的5H7抗体相比,基于前者所建立的ELISA方法具有更高的方法灵敏度。而交叉反应率试验结果表明,新制备的抗体5D11与5F7具有宽谱选择性,其中基于5F7抗体所建立的异源ELISA方法可以用来检测对硫磷、甲基对硫磷、杀螟硫磷、倍硫磷和辛硫磷五种有机磷农药,IC50分别为7.06 ng/mL、32.34 ng/mL、164.84 ng/mL、500.94 ng/mL和96.97 ng/mL。根据不同抗原-抗体组合的ELISA方法表现,研究确定了采用异源ELISA方法进行抗体筛选时的包被半抗原设计原则,并设计对硝基苯甲酸为包被半抗原来验证前期所提出的抗体筛选制备体系和方法,获得了一株宽谱特异性单克隆抗体2H6。基于2H6建立的同源和异源ELISA方法可以用来检测对硫磷、甲基对硫磷、杀螟硫磷和水胺硫磷,最佳抗原-抗体组合的IC50分别为20.32 ng/mL、21.44 ng/mL、42.15 ng/mL和58.85 ng/mL。土壤样品中四种农药的单一添加和混合添加回收率试验结果表明,2H6抗体不仅可以用于土壤样品中四种有机磷的单一农药残留检测,而且其还可以用于对硫磷+甲基对硫磷的混合定量测定。而对于四种农药同时存在时,该方法可以用于农药残留是否超标的阳性判定,是仪器定量检测前的一种快速有效的初筛方法。在获得多种高特异性和宽谱单克隆抗体的基础上,本研究进一步采用分子模拟的方法对高特异性和宽谱抗体间识别特性差异的内在原因进行了探讨.研究采用Accelrys公司的Discovery StudioTM软件系统,通过同源建模法构建了高特异性单抗5H7和两种宽谱单抗5F7和5D11的可变区叁维模型,进一步采用LibDock模块模拟对接了有机磷农药与叁株抗体之间的分子互作行为,确定了抗体与农药分子互作的关键氨基酸残基.分子模拟的结果表明：叁株抗体与农药间的相互作用主要包括疏水相互作用、范德华力、氢键和π-π作用；CDR区特别是HCDR3区的氨基酸残基是抗体与农药分子互作的关键氨基酸残基,而且HCDR3区的苏氨酸(thr)是产生对硫磷高特异性的关键氨基酸,而丝氨酸(ser)和色氨酸(trp)则与抗体的选择性有密切联系.这些氨基酸作用位点和作用方式的确定,为下一步抗体的改造和宽谱基因工程抗体的制备打下了坚实的基础。
陈则利[7]2006年在《叁唑磷酶联免疫分析方法及试剂盒的研究》文中进行了进一步梳理本研究在不同间隔臂长的两种半抗原O-乙基,O-[1-苯基-(H-1,2,4-叁唑-3-丙基),N-(3-羧基-丙基)]硫代磷酸胺(THBu)和O-乙基,O-[1-苯基-(H-1,2,4-叁唑-3-丙基),N-(5-羧基-丙基)]硫代磷酸胺(THHe)基础之上,分别与BSA偶联获得免疫原,结合比分别为16.6:1和8.2:1,经免疫兔子得到两种抗叁唑磷多克隆抗体(抗THBu抗体、抗THHe抗体),相应冻干粉的效价分别为5.12×10~5和2.56×10~5。 通过比较不同的ELISA方法,选用了包被抗体直接竞争ELISA分析方法,包被抗THBu抗体与叁唑磷或酶标半抗原HRP-THHe竞争反应。对固相载体、包被缓冲液、盐离子浓度、甲醇浓度、包被温度、时间、减少非特异性吸附的方法等因素的筛选试验比较,优化了酶联免疫分析的方法和条件。优化后结果显示:用美国CoStar板,pH7.4 0.01M PBS稀释包被抗体,在37℃下包被2h效果最佳;反应介质加入2%牛奶可减少非特异性吸附,提高检测灵敏度;盐离子浓度0.02M,甲醇含量5%有利于抗原抗体竞争反应。利用优化后的分析条件,用直接竞争ELISA方法进行了抗体亲和性和特异性研究。结果表明,抗THBu抗体对叁唑磷有较高的亲和性,叁唑磷与抗体在1.95-1000ng/mL浓度范围内,抑制率与浓度呈线性关系,线性回归方程为y=12.622Ln(x)-2.092,R~2=0.993,抑制中浓度IC_(50)=62.0ng/mL,最低检测限IC_(20)=5.76ng/mL。抗THBu抗体对叁唑磷有很高的特异性,对各类似物如二嗪磷、毒死蜱等的交叉反应率<2.4×10~(-4)。 用抗THBu抗体初步研制了叁唑磷残留检测用直接竞争ELISA试剂盒,对样品基质影响、试剂盒保存期、试剂盒检测数据评价进行了初步试验,可用于水、稻米、黄豆(干)、胡萝卜、土豆、大白菜、洋葱、茄子、梨、柑桔等样品的检测。试剂盒准确度较好,除梨样品添加回收率在50%左右,其余样品在61.48～132.27%;试剂盒的重现性好,除胡萝卜样品外,其他板间变异系数均小于12.93%,可满足样品中叁唑磷残留量的检测。本研究为开发具有自主知识产权的国产化试剂盒奠定了基础。
张婧[8]2009年在《拟除虫菊酯酶联免疫分析方法研究》文中指出拟除虫菊酯(Pyrethroid)作为一类广谱性杀虫剂,广泛应用于农业生产,在作物体及其农副产品中的残留水平较高,危及到了人类健康。本研究在建立优化溴氰菊酯间接竞争ELISA检测方法的基础上,研制出溴氰菊酯残留检测ELISA试剂盒,并在拟除虫菊酯多残留ELISA检测方法建立方面进行了一些初探。试验建立优化了溴氰菊酯残留间接竞争ELISA检测方法,确定了抗原抗体最适工作浓度为112800,包被方式为37℃3 h或37℃3 h后4℃过夜,显色时间为15 min,反应环境为含10%甲醇、pH 7.4、0.1 mol·L-1磷酸盐缓冲液。在对以上反应条件进行综合测试的基础上,建立溴氰菊酯标准抑制曲线,得回归方程y=0.18x-0.1483, R2=0.9848, IC50=4.00μg·mL-1,线性范围为0.02～100μg·mL-1。研制出溴氰菊酯ELISA快速检测试剂盒,并以苹果为试样,对试剂盒的技术参数进行测定。试剂盒的灵敏度IC50为4.00～7.71μg·mL-1,空白苹果检出限为0.01～0.02 mg·kg-1；以0.1 mg·kg-10.5 mg·kg-1和1.0 mg·kg-1叁个水平添加苹果,回收率为86.2-105.8%,变异系数为6.0～9.8%；试剂盒中抗体对其他菊酯类农药(如：氯菊酯、高效氯氟氰菊酯、甲氰菊酯等)交叉反应较小；试验证明试剂盒可在2～8℃保存6个月。针对部分拟除虫菊酯的共有结构,以4’-羟甲基苯甲酸、2,2-二甲基环丙烷甲酸为原料,设计合成一种半抗原Hapten,将Hapten分别与BSA、OVA偶联制备人工抗原Hapten-BSA和Hapten-OVA,偶联物经紫外光谱扫描鉴定。以Hapten-BSA为免疫原免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,抗体效价为51200。以Hapten-OVA为包被原建立间接竞争ELISA检测方法,确定抗原最适工作浓度为1：6400,抗体最适工作浓度为1：12800,反应环境为含10%甲醇、pH 7.4、0.1 mol·L-1磷酸盐缓冲液。在上述反应条件下,将得到的抗体对多种物质进行特异性测试,探明拟除虫菊酯的免疫决定区。拟除虫菊酯通用半抗原设计必须要囊括苯环和叁碳环两个重要作用位点,而氰根离子、卤素以及与载体蛋白连接部位碳链的引入,可以提高检测的灵敏度,使拟除虫菊酯多残留ELISA检测方法在实际生产中的应用成为可能。
罗利[9]2008年在《川楝素间接竞争酶联免疫分析方法（IC-ELISA）初步研究》文中研究表明川楝素是从楝属植物中分离得到的一种杀虫活性物质,以其为主要有效成分研制开发出的植物源杀虫剂,已应用于农业害虫防治。随着川楝素制品在农业生产上的使用和推广,建立高效,快速,灵敏的川楝素检测方法,对进一步开展川楝素的环境安全性,作用机理、质量标准建立等方面的研究有着重要意义。本研究以川楝素为研究对象,开展了川楝素人工抗原的合成及其多克隆抗体的制备研究,并进行了川楝素间接竞争ELISA方法的建立及其确证研究。主要研究结果如下:1.成功合成了川楝素的人工抗原。合成了川楝素的两种半抗原,经HRMS、NMR及IR确证为琥珀酸单酰川楝素(TS)和戊二酸单酰川楝素(TG);采用混合酸酐法(MA)合成了两种免疫原TS-BSA和TG-BSA,采用活化酯法(AE)合成了两种包被原TS-OVA和TG-OVA,并经紫外光谱扫描法和红外光谱扫描法进行了鉴定。2.获得了抗川楝素的特异性多克隆抗体。用两种免疫原TS-BSA和TG-BSA分别免疫新西兰大白兔后,均获得了抗川楝素的特异性抗体。采用间接ELISA法和间接竞争ELISA法对抗体的鉴定结果表明:首次加强免疫后,两种免疫原免疫的兔子体内均已产生了抗川楝素的特异性抗体,并随着加强免疫次数的增多,抗体含量也不断增加,测得两种免疫原TS-BSA和TG-BSA免疫的兔子最高效价分别为:1/64,000和1/320,000。3.建立了川楝素的间接竞争ELISA方法并进行了确证。用筛选出的抗体TS-Ab和TG-Ab,在优化的条件下(10%甲醇的PBS溶液作为待测物的溶解剂,pH 7.4的PBS作为抗体的稀释液,酶标二抗工作浓度为1/4,000,以2.0μg/ml的TG-OVA作为包被原,抗体工作浓度分别为1/9,000和1/60,000),分别建立了川楝素的IC-ELISA检测方法。以(TS-Ab,TG-OVA)组合建立的川楝素IC-ELISA方法,半数抑制浓度(IC50)为1.3266μg/ml,最低检测限(IC10)为0.0363μg/ml,在线性检测范围0.01-50μg/ml内,抑制率的几率值与浓度对数呈线性相关,得线性方程为y=0.8203x+4.8993,r=0.9917;以(TG-Ab,TG-OVA)建立的IC-ELISA方法,川楝素的IC50为3.0323μg/ml,IC10为0.1178μg/ml,在0.1-50μg/ml线性范围内,得线性方程为y=0.9084x+4.5623,r=0.9858;用(TS-Ab,TG-OVA)组合建立的IC-ELISA方法检测自来水中川楝素的添加回收率为82.4%-106.0%,并以HPLC法进行了确证,基本符合残留检测要求,检测甘蓝样品中川楝素的添加回收率为66.0%-79.3%。
闫旭[10]2013年在《农药多残留酶联免疫分析方法研究》文中认为有机磷类和拟烟碱类杀虫剂是农业生产中广泛使用的两类农药,主要用于防治水稻、玉米和蔬菜等作物上的害虫。这两类农药在农业生产中的不当使用已经严重危害到环境质量、农产品安全和人类健康。因此,针对这两类农药建立一种快速的、灵敏的残留分析方法具有重要的研究意义。多残留酶联免疫分析技术具有操作简便、快速,价格低廉,适宜现场监控和大量样品筛选等优点,在农药残留快速检测中发挥着重要的作用。本研究建立了叁种农药多残留酶联免疫分析方法：①应用宽谱多决定簇抗体建立多残留间接竞争酶联免疫分析方法(ic-ELISA);②应用两种抗体建立多残留直接竞争酶联免疫分析方法(dc-ELISA)；③两种抗体混用建立多残留增强化学发光酶联免疫分析方法(ECL-ELISA).研究结果如下：应用宽谱多决定簇抗体建立多残留ELISA分析方法：合成对硫磷半抗原(P1)和吡虫啉半抗原(11),采用碳二亚胺法将P1和11依次与载体蛋白BSA偶联,制备得到多决定簇人工免疫原,以多决定簇免疫原免疫雄性新西兰大白兔,获得可同时识别对硫磷和吡虫啉的高亲和性宽谱多决定簇抗体。通过方阵滴定法筛选包被抗原和抗体的最适工作浓度,进一步研究不同包被原、有机溶剂、离子强度和pH值在ic-ELISA中对抗体亲和作用的影响,确立了对硫磷和吡虫啉ic-ELISA法的工作条件。在最优工作条件下,建立方法的工作曲线,对硫磷ic-ELISA抑制曲线线性范围在0.0017～1.85mg/L,回归方程为Y=-19.785x+25.300,R2为0.9925,抑制中浓度IC50为0.056mg/L,最低检测限IC10为0.0005mg/L;吡虫啉ic-ELISA抑制反应曲线在0.11～25.70mg/L,回归方程Y=-25.418x+55.847,R2为0.9924,IC5o为1.700mg/L,最低检测限为0.0045mg/L.制备的抗体除了对氯噻啉有较大的交叉反应,与其他的有机磷类和拟烟碱类杀虫剂均无明显交叉。通过自来水、河水、土壤和甘蓝中的添加回收率试验验证建立的ic-ELISA分析方法的准确性,添加浓度为0.002-1.000mg/L (mg/kg),添加回收率在84.4～116.9%,变异系数为0.4～7.2%。本研究建立的ic-ELISA方法符合农药残留分析要求。应用两种抗体建立多残留dc-ELISA分析方法：通过将对硫磷抗体(Pab-P)和氯噻啉抗体(Pab-I)分别包被在酶标板的不同微孔中,建立多残留免疫分析方法。通过方阵滴定法筛选包被抗原和抗体的最适工作浓度,进一步研究不同酶标抗体、有机溶剂、离子强度和pH值在dc-ELISA中对方法灵敏度的影响,确立了直接竞争酶联免疫分析方法的最佳检测条件。在最优条件下,对硫磷的回归方程为Y=-19.895x+25.291,R2为0.988,检测范围0.0018～1.84mg/L,IC50为0.057mg/L,最低检测限为0.0005mg/L；甲基对硫磷的回归方程为Y=-23.006x+32.283,R2为0.986,检测范围0.0084～3.42mg/L, IC50为0.169mg/L,最低检测限为0.0031mg/L;氯噻啉回归方程Y=-20.587x+23.562,R2为0.974,线性范围为0.0018-1.498mg/L, IC50为0.0525mg/L,最低检测限为0.0006mg/L;吡虫啉回归方程Y=-19.776x+24.784,R2为0.991,IC50为0.053mg/L,最低检测限为0.0005mg/L,线性范围为0.0016～1.745mg/L。该方法与其他的有机磷类和拟烟碱类杀虫剂均无明显交叉。通过河水、土壤和甘蓝样品中添加回收率对建立的方法进行准确性评估。添加浓度为0.005～0.500mg/L(mg/kg),添加回收率为82.5～116.3%,变异系数为1.6～8.1%。结果显示,建立的dc-ELISA方法符合农药残留分析要求。两种抗体混用建立多残留ECL-ELISA分析方法：混合应用氯噻啉抗体和噻虫啉抗体,筛选出抗体和酶标抗原的最适工作浓度,建立了应用一条标准曲线同时分析噻虫啉和氯噻啉的化学发光酶联免疫分析方法。回归方程Y=-33.609x-13.252,相关系数R2为0.988,工作浓度范围为0.0036～0.2750mg/L,最低检测限为0.0018mg/L。为了验证建立的ECL-ELISA分析方法的准确性,进行了番茄,甘蓝和稻米的添加回收率试验,添加浓度为0.04-0.25mg/L (mg/kg),添加回收率在83.7-109%,变异系数为2.0-5.8%。在方法的准确性研究中,应用番茄实际样品检测,高效液相色谱(HPLC)结果与ECL-ELISA的结果较一致(R2=0.996)。说明所建立的ECL-ELISA方法可以用于环境样品中氯噻啉和噻虫啉的快速定性及定量分析。本研究建立了叁种农药多残留酶联免疫分析方法。叁种方法的准确度和精密度均符合农药残留分析的要求,可适用于大量样品和现场样品的快速检测,为开发多残留检测试剂盒奠定了基础。
参考文献：
[1]. 有机磷农药的酶免疫化学研究[D]. 韩丽君. 中国农业大学. 2003
[2]. 溴氰菊酯降解产物的免疫分析方法研究[D]. 郑伟华. 新疆农业大学. 2004
[3]. 对硫磷半抗原分子设计研究[D]. 刘毅华. 浙江大学. 2008
[4]. 农药残留检测的荧光和化学发光免疫分析方法研究[D]. 金茂俊. 浙江大学. 2009
[5]. 酶联免疫分析方法在有机磷农药残留检测中的应用研究进展[J]. 丁晓燕, 卢平, 胡德禹. 山地农业生物学报. 2011
[6]. 有机磷高特异性和宽谱单克隆抗体的筛选与比较研究[D]. 王春梅. 浙江大学. 2010
[7]. 叁唑磷酶联免疫分析方法及试剂盒的研究[D]. 陈则利. 浙江大学. 2006
[8]. 拟除虫菊酯酶联免疫分析方法研究[D]. 张婧. 北京农学院. 2009
[9]. 川楝素间接竞争酶联免疫分析方法（IC-ELISA）初步研究[D]. 罗利. 西北农林科技大学. 2008
[10]. 农药多残留酶联免疫分析方法研究[D]. 闫旭. 南京农业大学. 2013
标签：有机化工论文; 植物保护论文; 半抗原论文; 对硫磷论文; elisa论文; 有机磷农药论文; 抗原抗体论文; 有机磷论文; 特异性论文; 回收率论文; bsa论文;