昆明市儿童医院肿瘤科 云南昆明 650000
摘要：白血病是一类造血干细胞的恶性克隆性疾病，近年急性淋巴细胞白血病的治疗取得了显著的进展，儿童急性淋巴细胞白血病治疗的完全缓解率可达75%-90%[1]，但是约20%-30%儿童急性淋巴细胞白血病患者最终复发，并死于本病，而治疗缓解后患者体内残留的白血病细胞水平，即微小残留是白血病复发的独立的重要因素，目前检测微小残留的方法中，最有前景的是PCR和FCM，与PCR相比，FCM具有简单、快捷、定量、廉价等特点，因而成为更为理想的检测微小残留病的工具。
一、关于微小残留
1.微小残留定义：微小残留（MRD）是指白血病经治疗后，临床上和血液细胞上达到完全缓解后，但体内仍残留白血病细胞的状态。研究发现当白血病初发时患者体内能检测到的白血病细胞常为1012-1013，诱导后残留的白血病细胞可高达108-1010，巩固化疗后体内残留的白血病细胞仍可高达106-108 [2]，即使是经验丰富的血细胞形态学家其最大检出能力也仅为5x10一2细胞水平[3]，若不进行进一步治疗，这些白血病患者极有可能复发。而依靠传统形态学方法难以看到这些微量残存的白血病细胞，随着免疫学、分子生物学及细胞遗传学等技术的广泛展开，使的检测方法得到了较快的改进，可更精准的检测患者体内的水平。已有学者以“分子缓解”，即诱导缓解治疗结束时，MRD<1×10-4重新定义分子生物学完全缓解。根据患者缓解后体内MRD水平，采取个体化缓解后治疗策略，提高完全缓解患者白血病的根治率。
2.检测微小残留的意义
（1）判断化疗的疗效、指导用药：MRD检测的最终目的是通过区分两类患者，指导治疗决策，达到个体化治疗。一类患者对化疗反应良好，无需继续化疗即可获得长期无病生存；而另一类患者则必须继续化疗，甚至强化治疗以减少复发的可能性[4]。根据MRD值，对高水平的患者，应及时给予强化治疗或更改治疗方案，对低水平的患者减少化疗强度，避免形态学缓解后治疗的盲目性。有研究发现，持续的MRD>10-4水平或者达到10-2水平预示即将复发，对于这些患儿有必要强化治疗方案。
（2）预测复发、判断预后：国外研究发现，在巩固治疗后MRD水平为高（>1×10-2），中（1×10-2—1×10-4），低（<1×10-4）的3年复发率分别为75%，23%，2%[5，6]。还有研究表示，早期MRD水平>10-4是B-ALL复发的高危因素[7，18]，且MRD升高较形态学早1-4月。但对于区分高低危不同预后组而言，单一时间点的检测结果仍是不够精确严密的[8，9，10，11，12]。根据诱导化疗后MRD状态只能确定复发低危组患者[13，14]，而对于高危组往往不能诊断[15，16]。根据现有方案治疗后检测的MRD结果制订新的临床治疗方案时，专家建议以下几点：（1）只有当真正MRD检测后，才能由MRD检测结果区分不同预后组从而评价治疗方案，一般在治疗开始后6~13周；（2）MRD检测前治疗方案不得更改，否则会直接影响其结果的预后意义；（3）至少要选择两个早期时间点进行检测，这样根据MRD确定不同危险组的结果更为准确[17，27]。
（5）判断造血干细胞移植的疗效：就异体骨髓移植而言，移植前患者体内的状态是其移植成功的一个重要的决定性因素，移植前MRD阴性患者较MRD阳性患者5年的总生存率更好[18]。白血病患者异体移植的效力受到移植当时体内缓解状态的影响，移植前体内白血病细胞负荷重的患者，接移植后易复发，预后差，故体内MRD杀伤到一定程度后再作移植可以提高其成功率[19]。微小残留病还是确定异基因造血细胞移植后进行供者淋巴细胞输注等过继免疫治疗的重要依据。
二、传统的微小残留（MRD）检测方法有哪些？
1.细胞形态学技术：细胞形态学技术是通过在高倍光学显微镜下观察细胞形态学的骨髓涂片来判断缓解期骨髓内是否存在微小残留白血病细胞。传统的CR，从形态学上鉴定，即原始、幼稚细胞<5%，而白血病经治疗后患者体内的白血病细胞仍可高达108-1010水平，依靠传统形态学方法难以看到这些微量残存的白血病细胞，且骨髓缓解期很难分辨出白血病细胞和造血干细胞，因此这种检测方法的灵敏度过低。
2.细胞遗传学技术：急性淋巴细胞白血病患者白血病细胞中发现一些染色体的易位，细胞遗传学技术可通过培养并观察急性淋巴细胞白血病患者缓解期骨髓细胞染色体情况来判断微小残留病的存在，这种方法大大提高了微小残留病检测的敏感度和特异度，但是并非所有急性淋巴细胞白血病患者白血病细胞都会出现染色体易位，因此该方法只适用于存在染色体异位的患者微小残留的检测。
3.荧光原位杂交技术（FISH）：荧光原位杂交技术是在细胞遗传学技术上发展的，应用染色体或基因特异的核酸探针识别染色体数目或结构的异常，从而对特异的序列进行分析。染色体的易位导致某种融合基因的产生，目前己研究清楚多种融合基因的具体核酸序列，并且根据已知核酸序列设计出了带有荧光标记的互补核普酸探针，应用荧光标记探针与缓解期骨髓细胞孵育结合，然后在荧光显微镜下观察并判断微小残留病的存在与否，但它同细胞遗传学方法一样只适用于部分患者微小残留病的检测，且检测灵敏度仅达10-2-10-3[20，21]。
4.多聚酶链反应技术（PCR）：PCR技术是目前常用的检测MRD的方法中灵密度最高的，可达10-4-10-6[20，21]，可对含有融合基因、突变基因、异常表达基因的白血病亚型进行精确检测，但PCR技术仅对具有特异性分子生物学异常的40%的急性淋巴细胞白血病和30%的急性髓系白血病患者适用，对于大部分发病时无特异的分子生物学标记可供检测的患者，检测受到限制[18]。且经过治疗后患者白血病基因重排可发生克隆性演进，产生新的重排基因，从而出现较高的假阴性结果。再者，PCR技术条件要求较苛刻，且整个流程耗时耗力，不适合临床广泛应用，也不适合各实验室之间的对比。
三、流式细胞术（FCM）
FCM是集激光技术、电子技术、流体力学、细胞免疫学、计算机技术等多门高新技术与方法为一体的细胞分析技术。它通过检测在正常骨髓或外周血细胞上不表达或低表达而在白血病细胞上表达或高表达的白血病相关抗原表型来定量MRD。其工作原理是利用荧光素标记的单克隆抗体作分子探针，通过测定液流系统中快速直线流动状态中的单个细胞的荧光、散射光等生物学特性来定量细胞的形态、体积大小及免疫标记等重要多参数分析白血病细胞的细胞膜和细胞质或细胞核的免疫表型，由此了解被测白血病细胞所属细胞系列及其分化程度，在单细胞水平上对大量细胞进行高速、准确、多参数的定量分析。由于FCM是对细胞大小、性质及免疫标记进行分析，因此不受分子生物学异常的影响，能准确定量残余白血病细胞数，灵敏度可达10-3-10-4[20，21]，具有高速、准确、多参数和方便等特点，不同实验室具有可重复性易，因而有较好的临床应用价值，尤其在检测微小残留病方面相对于其他检测方法有着不可替代的优势。
四、MRD检测影响因素
1.检测时间选择：有研究显示，在B-ALL诱导治疗的第8天，FCM检测MRD的水平与无复发生存率显著相关，MRD<0.01%的患者5年无事件生存率可达90±2%，而MRD>1%患者仅有54±7%[22]。也有研究表示在化疗的d33、3m、6m时间点时MRD水平>10-4组的复发率高于MRD水平<10-4组[23]。
2.样本的选择：MRD的检测可在外周血或骨髓中进行，但研究发现T-ALL骨髓和外周血MRD水平高度一致，而B-ALL外周血水平比骨髓低至少10%[24]。因此，T-ALL检测可仅取外周血标本，与骨髓标本检出率基本一致，而B-ALL骨髓检出率高于外周血，外周血不能完全代替骨髓，如外周血检测到阳性提示高危复发。但也有相关报道，骨髓MRD水平高于外周血，更利于早期预测复发[25]。
3.其他因素：如标本的采集、运送、处理，对细胞数、抗体量、孵育时间及离心速度，仪器调控、检测试剂、检测仪器等因素。
期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆
五、结语
现有的各种治疗措施使急性B淋巴细胞白血病患者获得了非常高的临床缓解率，但缓解后患者体内仍残存少量白血病细胞，成为导致白血病的复发的根源，目前有多种灵敏度很高的检测方法来监测患者体内的微小残留白血病水平，其中最有前景的是PCR和FCM[26]，与PCR相比FCM具有简单、快捷、定量、廉价等特点，因而成为更理想的检测MRD的工具。MRD的定量检测将急性白血病的缓解标准及监测水平提升到分子水平，在患者达到临床缓解期以后，准确定量微小残留病对预测复发及判断预后有着非常重要的临床意义。虽然受到免疫类型、采样时间等多种因素制约，但与其他方法相比，FCM检测有其无法比拟的优势，近年来已逐渐成为指导治疗和监测复发的重要措。虽然我们目前还不知道它最终能否彻底改变急性白血病病人的预后，但是作为一种目前最具价值的检查方法，随着 FCM 检测 ALL-MRD 的不断成熟，这一检测结果必将能成为临床医生治疗白血病的重要参考指标。
参考文献：
[1]Stock W，Estrov Z.Studies of mnimal residual disease in acute lymphocytic leukemia.Hematol Oncol Clin North Am，2000，14（6）：1289-1305。
[2]张之南等主编协和血液病学M第一版北京协和医科大学出版社，2004，349-368
[3]Pui CH，Evans WE，Gilbert JR.Meeting report：International Childhood ALL Workshop：Memphis，TN，3-4 December 1997.Leukemia，1998，12（8）：1313-1318
[4]陈洁，白血病微小残留病的研究进展J，国外医学内科学分册，2004，31（6）：23
[5]Thalhammer-Schemer R，Mitterbauer G，Simonitsch I，et al.The immunophenotype of 325 adult acute leukemias：relationship to morphologic and molecular classification and proposal for a minimal screening program highly predictive for lineage
Discrimination.Am J Clin Pathol.2002；117（3）：380-389
[6]万岁桂，巩文玉，孙雪静，等.86例儿童急性淋巴细胞白血病三色流式细胞术免疫分型研究[J].中华血液学杂志，2002，23（2）：83} 86
[7]袁婷婷，流式细胞术检测急性白血病完全缓解微小残留病及临床意义
[8]DworzakMN，FroschlG，PrintzD，etal[J]Blood，2002，99：19521958
[9]CoustanSmithE，SanchoJ，HancockML，etal[J]Blood，2000，96：26912696
[10]VanDongenJJM，SeriuT，PanzerGrumaverER，etal[J]Lancet，1998，352：17311738
[11]NyvoldC，MadsenHO，RyderLP，etal[J]Blood，2002，99：12531258
[12]CaveH，vanderWerfftenBoschJ，etal[J]NEnglJMed，1998，339：591598
[13]VanDongenJJM，SeriuT，PanzerGrumaverER，etal[J]Lancet，1998，352：17311738
[14]NyvoldC，MadsenHO，RyderLP，etal[J]Blood，2002，99：12531258
[15]vanderWerfftenBoschJ，etal[J]NEnglJMed，1998，339：591598
[16]CoustanSmithE，BehmFG，SanchezJ，etal[J]Lancet，1998，351：550554
[17]JacquesJM，vanDongenN，SzczepanskiT，etal[J]Hematology，2002，177192
[18]景卉，多参数流式细胞术检测急性白血病微小残留病的研究
[19]Mizuta S，KohnoA，MorishitaY，et al.Long- term follow-up of 14 patients with philadelphia chromosome-positive acute lyrilphoblastic leukemia following autologous bone marrow transplantation in first complete remission[J].Int，J，Hematol，2007，85（2）：140-145.
[20] CampanaD，CoustanSmithE [J]Cytometry，1999，15：716727
[21]CampanaD，ChingHonP [J]Blood，1995，85（6）：14161434
[22]Borowitz MJ，Devidas M，Hunger SP，et al.Clinical significance of minimal residual disease in childhood acute lymphoblastic leukemia and its relationship to other prognostic：a Children's Oncology Group Blood，2008；111（12）：5477-5485.
[23]王懿林，流式细胞仪检测儿童急性B淋巴细胞性白血病微小残留病的临床意义
[24]VAN DER VELDEN V，JACOBS D C，WUKHUUS J，et al.Minimal residual disease levels in bone marrow and peripheral blood are comparable in children with T cell acute lymphoblastic leukemia（ALL），but not in precursor-B-ALL [J]。
Leukemia，2002，16（8）：1432-1436.
[25]STOCK W，YU D，KARRISON T，et al.Quantitative of real-time RT-PCR monitoring of BCR-ABL in chronic myelogenous leukemia shows lack of agreement in blood and bone marrow samples[J]1099一1103.IntJ Oncol，2006，28（5）：
[26]Huh YO，Ibrahim S.Immunophenotypes in adult acute lymphocytic leukemia.Role of flow cytometry in diagnosis and monitoring of disease.Hematol Oncol Clin NorthAm，2000，14（6）：1251一1265
[27]DworzakMN，FroschlG，PrintzD，etal[J]Blood，2002，99：19521958
论文作者:祝建君
论文发表刊物:《健康世界》2018年20期
论文发表时间:2018/11/27
标签：白血病论文; 细胞论文; 微小论文; 患者论文; 淋巴细胞论文; 水平论文; 骨髓论文; 《健康世界》2018年20期论文;