河北大学医学部 河北 保定 071000
【摘 要】探讨内皮细胞向间质转分化促肺纤维化的信号转导机制。方法 建立肺纤维化模型，模型组气管内注射博莱霉素诱导肺纤维化模型，对照组气管内注射生理盐水，分离并培养大鼠肺微血管内皮细胞，应用免疫组织化学检测E-cadherin及I型胶原的表达，利用RT-PCR技术检测Smad、BMP、Snail及β-catenin的表达。结果 博来霉素模型组E-cadherin 蛋白的表达均明显低于正常对照组(P<0.01)，I型胶原的表达均明显高于于正常对照组(P<0.01)；博莱霉素后第7天肺组织中Smad、α-SMA、β-catenin、snaiL表达显著升高，且高于正常对照组( P<0.01) 。结论：TGF-β/Smad、Wnt/β-catenin和Notch通路相关基因在博来霉素致大鼠肺纤维化中表达的改变，对肺纤维化可能有促进作用。
【关键词】博来霉素；内皮细胞向间质转分化；肺纤维化；信号转导
Endothelial cells to mesenchymal transdifferentiation of pulmonary fibrosis promoting signal transduction mechanisms
Abstract: to investigate the endothelial cells turn mesenchymal differentiation and promote signal transduction mechanism of pulmonary fibrosis. Method to establish model of pulmonary fibrosis model group endotracheal bo lai doxycycline injection induced pulmonary fibrosis model, the control group endotracheal injection of saline, isolation and culture of rat lung microvascular endothelial cells, application of immunohistochemical detection of E cadherin and the expression of type I collagen, using rt-pcr technique to detect Smad, BMP, q, and beta catenin expression. Results of bleomycin model group E cadherin protein expression were significantly lower than normal control group (P < 0.01), the expression of type I collagen were significantly higher than in normal control group (P < 0.01);Give 7 days after Po lai toxin Smad in lung tissue, alpha SMA, a significant rise in beta - catenin, q, and higher than the normal control group (P < 0.01). Conclusion: the TGF - beta/Smad, Wnt/beta - catenin and Notch pathway related genes in bleomycin induced pulmonary fibrosis in rats expression changes, may have a role in promoting for pulmonary fibrosis.
Keywords: pulmonary fibrosis; pulmonary microvascular endothelial cells; bleomycin
【中图分类号】R473【文献标识码】A【文章编号】2096-0867（2016）13-260-02
相关研究提示肺纤维化的发病机制主要是肺组织损伤后肺重建异常、修复调节失控引起的病变，与诸多细胞信号转导通路的相关细胞因子密切相关[1]。本文通过建立动物模型，探寻肺纤维化发生时EnMT发生的信号转导通路，及其在肺纤维化发生过程中的作用。
1材料与方法
1.1 材料
盐酸博来霉素，总 RNA提取裂解液( RNAiso plus)，RT-PCR 反转录试剂盒和荧光定量试剂，PCR引物成。
1.2研究方法
1.2.1动物模型制备及分组
实验大鼠由河北省实验动物中心提供，共60只纯种雄性健康SD大鼠，体重250±10 克。所选大鼠进行为其一周的适应性饲养。随机进行分为博来霉素模型组和正常对照组，每组30只。博来霉素模型组，先采用3%戊巴比妥钠溶液进行腹腔麻醉，行微创手术充分暴露气管，以5mg/kg浓度向气管内注射博来霉素溶液0.2ml左右。正常对照组，同博来霉素模型组操作，但向气管内注入等量生理盐水。操作完毕后，将所有大鼠直立旋转30s，促进肺内的药物分布均匀。在造模后的7d、14d、28d 两组均随机抽取10只取材。
1.2.2分离培养大鼠肺微血管内皮细胞
于气管内注药后第7d、14d、28d取材，肺组织浸泡于无菌 PBS 中用作 PMVECs的原代培养。
1.2.3观察指标
应用免疫组织化学检测两组肺内皮细胞标记物E-cadherin及I型胶原的表达变化情况；
利用荧光定量 RT-PCR技术检测肺微血管内皮细胞Smad、BMP、Snail、β-catenin的表达。
1.2.4 检测方法
1.2.4.1 免疫组化检测E-cadherin及I型胶原的表达
参照试剂说明书进行操作，每张切片分别从中间及四周择选有代表性5张，于两百倍显微镜下，以计算机图像分析系统进行其整合光密度(IOD)的检测，计算公式:IOD=面积密度×平均光密度：阳性反应IOD越大，表示反应越强。
1.2.4.2 RT-PCR检测大鼠肺组织 TGF-β1、Smad3、α-SMA 、BMP、β-actin的表达参照说明书进行操作，引物由上海生工生物技术有限公司合成[2]。具体目的引物和内参引物序列见下表：
1.3 统计学分析
采用统计学软件SPSS22.0进行数据分析，计量资料以均数±标准差表示，组间差异采用单因素方差分析，并以 LSD检验法进行组间两两多重比较，以P<0.05 表示差异有统计学意义。
2结果
2.1免疫组化检测E-cadherin及I型胶原的表达
免疫组化检测大鼠微血管内皮细胞E-cadherin及I型胶原的表达,大鼠肺组织E-cadherin 蛋白表达以胞膜着色为主，I型胶原胞质为主，着色均为黄色或棕黄色。博来霉素模型组E-cadherin 蛋白的表达均明显低于正常对照组(P<0.01)，博来霉素模型组I型胶原的表达均明显高于于正常对照组(P<0.01)见表1。
2.2 RT-PCR检测Smad、BMP、α-SMA、Snail及β-catenin的表达与正常对照组比，给予博莱霉素后第7天肺组织中Smad、α-SMA、β-catenin、BMP相对表达量均显著升高( P＜0.01)，之后逐渐下降，但均显著高于正常对照组( P＜0.01) ，
3 讨论
肺纤维化是多种纤维化疾病的共同结果亦是各种肺部慢性疾病的终末期表现，纤维化的病理改变是不可逆性的。临床上早期发现、早期诊断以便早期治疗，对防治肺纤维化进展尤为重要。近年来的一些研究发现，Wnt/β-catenin 信号通路、TGF-β/Smad信号通路可促进纤维化疾病的发生发展，随后关于肺纤维化相关信号通路的研究逐渐增多，亦有关于各通路间相关性的研究。Notch 信号通路在肺内分布广泛，主要调控着细胞的增殖和分化，考虑到此生物学功能，可能与肺纤维化的形成有着密切的相关性。
博来霉素诱导肺纤维化大鼠模型，与人类纤维化病理学改变极为相似，是经典的肺纤维化动物模型，亦是当前公认的制作肺纤维化的模型。本文采用的是博来霉素诱导的肺纤维化模型，与大鼠气管内注入博来霉素制作。观察造模后的肺纤维化大鼠肺组织TGF-β/Smad 、Wnt/β-catenin和Notch信号通路中相关基因的表达，研究三大通路在博莱霉素诱导大鼠肺纤维化过程中的作用，探寻肺纤维化发生时EnMT发生的信号转导通路，及其在肺纤维化发生过程中的作用。器官纤维化的发生主要是多种因素引起细胞外基质异常增多和过度沉积在纤维组织而发生的病理过程[3]。其中细胞外基质的主要成分则则包含增多的纤维连接蛋白、腱蛋白以及各型胶原。
既往关于EMT与各个信号通路的研究较多，近年来关于EndoMT与各个信号通路的研究亦逐渐增多，由最初在肿瘤细胞的研究到心脏、肾脏、肺脏的研究，在肺脏研究较少。
本研究结果显示，博来霉素模型组E-cadherin 蛋白的表达均明显低于正常对照组(P<0.01)，博来霉素模型组I型胶原的表达均明显高于于正常对照组(P<0.01)。与正常对照组比，给予博莱霉素后第7天肺组织中Smad3、α-SMA、β-catenin均显著升高，明显高于正常对照组，随后逐渐下降，但仍高于正常组。
参考文献
[1]孔勤，陈民利．特发性肺纤维化发病机制的研究进展[J]．中国比较医学杂志，2012，22(8) :74 －74．
[2]柴文戍，李永春，刘玉玲，等．博来霉素致肺纤维化大鼠形态学变化的实验研究[J]．中国实验动物学报，2003，11( 2) :77 －80．
[3]经典转化生长因子β/Smad 信号和Wnt /β-catenin 信号间的相互作用．浙江大学学报医学版，2013，42(5) : 591 － 596．
论文作者:郭永庆,段斐
论文发表刊物:《系统医学》2016年13期
论文发表时间:2016/11/2
标签：霉素论文; 模型论文; 大鼠论文; 胶原论文; 信号论文; 对照组论文; 内皮论文; 《系统医学》2016年13期论文;