向娟娟[1]2003年在《氧化铁磁性纳米转运体系的研制及其在体内外基因转运中的应用》文中进行了进一步梳理基因治疗在恶性肿瘤治疗的地位越来越受到重视，有望成为化疗、放疗和手术治疗之后的又一常规治疗手段。高效的基因转移和基因的表达是基因治疗的关键技术。目前的基因载体包括多聚阳离子聚合物、脂质体及其衍生物和病毒载体。目前大约叁分之二的肿瘤基因治疗的临床试验是应用病毒载体来转运目的基因。但是病毒载体存在着很多难以克服的缺点，如：病毒载体具有免疫原性，细胞毒性，缺少组织特异性，不能装在大片段的DNA，具有潜在的致瘤性，在病毒重组过程中产生活性的病毒颗粒以及在外周血中被迅速清除。所以非病毒载体的研究日益受到重视。然而，目前应用的非病毒载体，如多聚阳离子聚合物和脂质体，存在着转染效率低，尤其在体内的转染效率低等缺点。缺乏高效，安全，靶向的基因载体已成为了基因治疗常规应用的主要障碍之一。因此寻找新的非病毒载体成为目前的研究热点。目前非病毒载体的研究已不局限于阳离子聚合物材料，其他的多种材料，如：无机化合物都成为了研究对象。无机化合物的制作工艺相对简单，造价低廉。这一类材料制成的基因载体多发挥着“工作台”的作用，装载目的基因的DNA和其他生物物质的进入细胞内。 本研究项目结合目前新兴的纳米材料科学和分子生物学，自组装了一种多聚赖氨酸修饰的氧化铁磁性纳米颗粒(poly-L-Lysine modified iron oxide nanoparticles，IONP-PLL)。通过体内外实验验证了IONP-PLL作为基博士学位论文 因载体的可行性，以及通过条件优化，使这一转运体系的转染效率达到 一较高水平。尤其是利用其能携带外源基因通过血脑屏障这一特性将其 应用于脑胶质瘤的基因治疗研究。 应用二价和叁价铁在高浓度的葡聚糖体系中共沉淀制成分散状态良 好的小颗粒悬浮状态的氧化铁磁性纳米颗粒（iron oxide nanoParticles， IONP、电镜检测显示氧化铁纳米颗粒直径约20urn士4．sum左右，分布均 匀。作为基因载体，与DNA的结合能力是必备条件之一。应用凝胶阻滞 实验和 DNA共沉淀实验来评价L 的 DNA结合能力。结果显示，该纳米 颗粒在pH－3日可以结合不保护DNA，但是在叫－7和9日就丧失了这种能 力。我们认为 IONP的 DNA结合能力是基于一种电负性 DNA磷酸骨架和 10NP的正电性之间静电结合。ZETA电位检测显示在d司，10NP的表面 电性为正性（6．3士0．36），可以结合电负性的mA。在州＝7和 9时，10NP 的表面电性为中性u．1士1．0）至负性（－9．6士0．91人 因此不能结合 电负性的 DNA。以上结果说明，表面电性为十 6左右对于 IONP己足够结 合电负性的DNA。纳米颗粒对于DNA的保护能力也是由于这种静电引力。 因此为了符合生理条件下的（PH 7．35－7．45）DNA结合和保护，我们 在氧化铁纳米颗粒的表面修饰多聚赖氨酸，成为IONP干LL。该纳米颗粒 粒径小，在生理条件下 ZETA电位为屹．7士0．36，凝胶阻滞实验和 DNA共 沉淀实验证实IONP干LL在生理条件下可以结合mA。同时结果显示随着 体系中的IONP干LL的增加，其DNA的结合力越来越强，体系中游离的DNA 越来越少。说明mA是结合到10NP干LL的表面。这种表面结合力也可保 7博士学位论义一 护洲A抵御核酸酶的降解。电镜显示IONP干LL的直径为58urn士14urn，负 染色显示出结合于N 干LL表面的DNA。我们应用MTT试验来检测 10NP－PLL，IONP－PLL／DNA复合物在不同细胞系MH／3T3，COS7。U251和 Hela的细胞毒性。MTT试验显示IONP－PLL和工ONP－PLL／DNA的细胞毒性 刁 小。 除了与DNA的结合能力以外，能够进入细胞，在细胞胞浆和胞核分 布也是基因载体的必备条件。电镜检测和不同时间的体外细胞普鲁士蓝 染色实验结果显示细胞可以吞噬m 干LL，在细胞的胞浆和胞核分布以 及L 干LL进入细胞的过程。以编码绿色荧光蛋白的报道基因EGFP｛ 和编码荧光素酶的报道基因PGLZ－CONTROL为目的基因，以IONP－PLL为 转染载体转染4种不同的细胞株。结果显示，N 干LL可携带外源基因 在各种细胞中分布并表达出目的蛋白。在10NP干LL与外源基因质量比为 I：2时，转染效率达到最高。不同细胞转染的效率各不相同。 除了环状质粒DNA以外，反义线性寡核昔酸选择性地调节基因表达 在基因治疗中也有重要的意义。在线性寡核昔酸的另一端修饰荧光物质 FHC。用荧光显微镜和流式细胞分析仪检测荧光信号，结果显示IONP干LL 可以将线性寡核昔酸高效地携带至细胞内。 9 将工ONP－PLL结合外源质粒 DNA形成复合物，将复合物从 BALB／C ／J’ 鼠尾静脉注射进入小鼠体内，应用电镜?
李征[2]2008年在《IONP-PLL进入细胞机制的研究及其在基因治疗中的应用》文中研究说明【IONP-PLL的特性及前期研究结果】氧化铁纳米颗粒是一种在生物研究领域得到广泛应用的纳米材料。我室向娟娟博士制备了一种自组装的多聚赖氨酸修饰的氧化铁磁性纳米颗粒(poly-L-Lysine modified iron oxide nanoparticles,IONP-PLL)。IONP-PLL为应用二价和叁价铁在高浓度的葡聚糖体系中共沉淀制成分散状态良好的氧化铁磁性纳米颗粒后经多聚赖氨酸修饰而成。前期研究表明:IONP-PLL颗粒表面能大量吸附生物大分子,如DNA、RNA,被该纳米颗粒吸附的物质能抵御各种生物酶的降解作用。且IONP-PLL颗粒对于细胞几乎没有毒性,可被体外培养细胞吞噬,在细胞浆和细胞核均有分布。表面修饰有多聚赖氨酸的氧化铁纳米颗粒已成功地将报告基因GFP,Beta-galactosidase转运至细胞内,并获得高效表达。同时IONP-PLL也可以将FITC标记的反义寡核苷酸转运进入细胞。体内试验研究结果表明IONP-PLL纳米颗粒大部分不被肝,脾的巨噬细胞吞噬,可以经肾脏排泄,且能通过血脑屏障在脑胶质细胞分布。转运报告基因GFP至体内后,用流式细胞仪观察,在肺部的分布最高,有34.9%。综上所述,IONP-PLL纳米颗粒具有将外源基因转运至体内、外细胞,且基因获得表达的能力。那么这种能力的具体机制是什么?我们能否利用这种能力进行基因治疗的应用呢?本论文将集中于这两方面的研究。【IONP-PLL入胞机制研究】电镜和普鲁士兰染色结果显示IONP-PLL进入细胞的表现类似于铁转运的过程。考虑到IONP-PLL的主要成分就是不同价态铁离子的混合物,那么IONP-PLL进入细胞的机制是否和铁离子进入细胞的机制存在相同或类似的原理呢?本文利用数种转铁蛋白—转铁蛋白受体途径的阻断剂进行了分析。结果发现在转铁蛋白存在状态下,IONP-PLL进入细胞表现出温度和时间的依赖性,在1h内随着时间的增加进入细胞的量增多。使用NH_4C1、CH_3NH_2和Trypsin对转铁蛋白—转铁蛋白受体途径进行干扰后均减少了IONP-PLL进入细胞的量,但并不能完全抑制IONP-PLL进入细胞。这说明IONP-PLL确实能通过转铁蛋白—转铁蛋白受体途径进入细胞,同时还存在非转铁蛋白—转铁蛋白受体途径,且该途径同样存在温度和时间的依赖性。因此,IONP-PLL进入细胞的机制同时依赖于转铁蛋白—转铁蛋白受体途径和非转铁蛋白途径。【IONP-PLL/DNA在体内器官和肿瘤组织中的分布】为了验证IONP-PLL能携带外源基因在体内器官分布,将IONP-PLL/EGFP-C2复合物从C57/BL6小鼠尾静脉注射入小鼠体内。在30min、1h、2h取血液进行涂片,48小时后,处死小鼠,取各组织器官观察荧光信号。结果显示:在肺,脾,肾均可见荧光信号,而在肝,胃,心基本未见荧光信号,该结果与向娟娟报道的实验结果一致。除此以外,本研究发现血液涂片中明显看到IONP-PLL/DNA复合物颗粒粘附于血细胞表面,部分分散在血液当中。淋巴结组织有明亮的绿色荧光信号,提示IONP-PLL可携带外源基因在血液系统中表达。将B16F10细胞通过尾静脉注射进入C57BL/6小鼠体内,成功建立了小鼠黑色素瘤肺转移动物模型。将IONP-PLL/pNM23-GFP复合物从尾静脉注射入肺转移瘤建模小鼠体内,NM23-H1抗体和GFP抗体进行免疫组化分析发现肿瘤细胞中有明显的NM23-H1-GFP融合蛋白的阳性表达。以上结果验证了IONP-PLL携带外源基因进入体内各器官和淋巴结组织以及肿瘤组织,并使基因在细胞获得表达的能力。【IONP-PLL携带pNM23-GFP质粒对小鼠黑色素瘤肺转移模型的实验性基因治疗及与化疗的联合治疗观察】肺整体外观观察和HE染色实验证明成功建立了小鼠黑色素瘤肺转移动物模型。pNM23-GFP质粒所表达的NM23-H1基因是在黑色素瘤高转移与低转移株之间差异表达分析发现的抑制肿瘤转移的基因,能明显的抑制黑色素瘤的转移。实验建模小鼠共分为6组:生理盐水注射对照组,IONP-PLL组,DNA组(空pNM23-GFP质粒),环磷酰胺(CTX)组,IONP-PLL/pNM23-GFP组,IONP-PLL/pNM23-GFP/CTX组。生理盐水注射空白组于肿瘤接种前1天,接种后6天,13天注射生理盐水各一次;IONP-PLL/pNM23-GFP混合物为将15μg的IONP-PLL滴加入30gg的DNA混匀合成,亦同样注射叁次;IONP-PLL组仅注射15μg IONP-PLL;DNA组仅注射30μg pNM23-GFP质粒。环磷酰胺溶于生理盐水中,以100mg/Kg剂量按同样规律给药叁次;IONP-PLL/pNM23-GFP/CTX组以相同剂量混合使用IONP-PLL/pNM23-GFP和CTX以同样规律注射C57BL/6建模小鼠叁次。通过肺的整体外观观察,转移瘤灶数目统计以及HE染色实验,检测了基因治疗及与化疗联合治疗抑制肿瘤转移、生长的效果。注射生理盐水的空白组、注射裸DNA和单独IONP-PLL的处理组均可见大量的黑色素瘤转移灶,转移灶布满整肺,形成巨大癌巢,有坏死、出血。单用DNA组转移灶发生率为214±32,单用IONP-PLL组转移灶发生率为210±19,两组与空白组相比没有太大差别(P＞0.05),其中,较大转移灶(直径大于0.7mm)的比例分别为16.9%和13.2%。而在IONP-PLL/pNM23-GFP复合物治疗组可见散在癌巢分布,未见明显巨大癌巢及坏死,转移灶形成率54±22,与前叁组区别明显(P＜0.005),较大癌巢比例下降为11.2%。环磷酰胺注射组肺部形成的黑色素瘤转移灶为130±36,其抑制肿瘤生长的效果更加明显,较大瘤灶的比率降低为6%。使用IONP-PLL/pNM23-GFP和环磷酰胺的联合治疗组转移灶的形成率进一步下降,仅为19±7,偶见较大瘤灶,抑制肿瘤转移和生长的效果都非常明显,取得了良好的治疗效果。生存曲线分析显示在注射生理盐水的空白对照组,小鼠的生存时间均短于28天,平均大概为15天。而在注射裸DNA组和空IONP-PLL组,生存时间与空白组相比无明显的区别。注射IONP-PLL/pNM23-GFP的治疗组和环磷酰胺治疗组均明显延长了小鼠的生存时间,分别平均达到了38天和34天,与空白对照组存在显着的区别,P＜0.05。值得注意的是,联合使用的IONP-PLL/pNM23-GFP和环磷酰胺的治疗组更加显着的延长了小鼠的生存时间,与单独应用组相比,其P值均小于0.05。而且在第100天结束观察时,联合治疗组仍有两只小鼠生存,解剖肺组织发现,其中一只小鼠基本未见黑色素瘤转移灶,另外一只小鼠仅见极少量黑色素瘤转移灶。以上结果充分说明IONP-PLL能携带pNM23-GFP质粒进入肿瘤细胞,并且NM23-H1-GFP融合蛋白在肿瘤细胞中获得表达产生了基因治疗的效果。联合使用化疗药物一环磷酰胺和IONP-PLL/pNM23-GFP基因治疗较单独使用化疗或基因治疗能更加明显的抑制肿瘤的转移和生长,延长小鼠的寿命。综上所述,IONP-PLL以类似于铁转运的方式进入体内、外细胞,能携带外源基因进入体内各器官、淋巴结组织和肿瘤组织,并使外源基因获得表达。IONP-PLL携带抑制肿瘤转移的基因进入小鼠体内后,能明显的抑制肿瘤的转移和生长,显着延长小鼠的寿命达到基因治疗的效果。而且当与常规化疗药物联合应用进行肿瘤转移的治疗能达到更好的效果。
王江峰[3]2010年在《可溶性壳聚糖季铵盐（CSTM）的合成、表征及其在基因载体和MR分子探针中的应用》文中研究指明为筛选具有更佳性能的纳米粒载体材料,本课题对天然可生物降解高分子材料——壳聚糖进行结构修饰,以修饰产物壳聚糖季铵盐(CSTM)、壳聚糖季铵盐-g-聚乙二醇-叶酸(CSTM-g-PEG-FA/pDNA)为材料制备了载基因纳米粒和CSTM/TPP-SPIO MR分子探针并对其特性进行了系列研究。本课题第一部分完成了壳聚糖季铵盐和壳聚糖季铵盐-g-聚乙二醇-叶酸纳米材料的制备。首先将壳聚糖与甲基丙烯酰氧乙基叁甲基氯化铵反应,将壳聚糖修饰成可溶性壳聚糖季铵盐,然后在此基础上进一步用叶酸和PEG来修饰壳聚糖季铵盐得到CSTM-g-PEG-FA。用IR和1H-NMR对聚合物进行结构鉴定,TM和PEG-FA的特征峰明显。本课题第二部分进行了壳聚糖季铵盐-g-聚乙二醇-叶酸载基因纳米粒的制备及形态学表征。首先采用自组装法制备了CSTM/pDNA纳米复合物和CSTM-g-PEG- FA/pDNA纳米复合物,然后通过不同介质溶液、有无血清、不同N/P等因素对两纳米复合物的粒径和zeta电位分别进行考察,实验结果证明在水溶液中能够得到粒径在200nm以内、粒径分布均匀、形态圆整、zeta电位高的纳米复合物。凝胶阻滞实验中发现,当聚合物/pNDA的N/P大于等于5时,两种纳米复合物都能完全包裹pNDA,而且两种壳聚糖衍生物都能很好保护pNDA不受酶降解。本课题第叁部分从细胞毒性和转染效率两个方面进行了两种纳米复合物的体外细胞实验。选择叶酸受体高表达的293T细胞株,通过MTT比色法测定两种壳聚糖衍生物以及两种纳米制剂的细胞毒性,结果显示无论是两种壳聚糖衍生物还是两种纳米制剂的细胞存活率均在70%以上,说明合成的CSTM和CSTM-g-PEG-FA材料具有良好的安全性。在细胞转染实验中,CSTM/pDNA纳米粒和CSTM-g-PEG-FA/pDNA纳米粒都有较高的转染效率,且CSTM-g-PEG-FA/pDNA纳米粒的转染效率要高于CSTM/pDNA纳米粒,证明CSTM-g-PEG-FA/pDNA纳米粒具有一定的细胞靶向性。本课题第四部分制备了CSTM/TPP-SPIO分子探针。采用凝聚法制备CSTM/TPP空白纳米粒,然后与SPIO结合生成CSTM/TPP-SPIO分子探针。CSTM/TPP-SPIO分子探针的粒径在200~280nm之间,zeta电位在10.0~16.0mv之间。SPIO的包封率在80%以上。本课题第五部分进行了CSTM/TPP-SPIO分子探针的体外毒性实验和动物体内淋巴结病变定性诊断实验。在体外细胞实验中,应用CSTM/TPP-SPIO分子探针后HepG2肝癌细胞存活率都在80%以上,表明CSTM/TPP-SPIO分子探针是一种安全低毒的纳米制剂。淋巴结病变定性诊断实验的结果显示,家兔给予CSTM/TPP-SPIO分子探针24hr后MR影像下T1WI信号较处理前明显增强,说明CSTM/TPP-SPIO分子探针能够在病变淋巴结中分布,对于于病变淋巴结的临床诊断和肿瘤转移的诊断与治疗具有重要意义。
张皓[4]2016年在《基于基因和分子靶向治疗技术的C225/p5HRE-cfosp-iNOS-IFNG磁性白蛋白纳米球治疗肺癌的实验研究》文中研究指明肺癌是目前世界上发生率和死亡率最高的恶性肿瘤之一,并且呈明显上升趋势。最新的肿瘤流行病学调查显示,男性肺癌的发病率和死亡率居所有恶性肿瘤首位,女性肺癌死亡率也高居所有恶性肿瘤第二位。肺癌已经成为对人类健康和生命危害最大的恶性肿瘤之一。在本研究中,我们以肺癌为治疗目标,构建以IFN-y为目的基因的基因电路,以PEI-Fe3O4为基因载体,联合西妥昔单抗设计了靶向载基因磁性白蛋白纳米球,将分子靶向治疗、放疗和免疫基因治疗有效联合起来治疗肺癌。主要研究内容如下：第一章肿瘤治疗基因合成和表达研究：基于乏氧/辐射双调控基因电路技术的p5HRE-cfosp-iNOS-IFNG真核表达质粒的构建与鉴定及其在细胞内的诱导表达[目的]：构建pYr-ads-5HRE-cfosp-iNOS-IFNG(即p5HRE-cfosp-iNOS-IFNG)真核表达质粒,并对其进行鉴定。评价其在GLC-82细胞中的诱导表达情况。[方法]：①以pUC57-Simple-cfosp为模板,将cfosp片段酶切下来连接至pYr-adshuttle-8载体得到pYr-ads-8-cfosp典核表达质粒。②以pDONR223-IFNG为模板,PCR扩增IFNG片段(IFNG即IFN-y的基因片段),然后将其亚克隆至pYr-adshuttle-8载体,构建pYr-ads-8-IFNG真核表达质粒。③将pUC57-SimpIe-cfosp及目的载体pYr-ads-8-IFNG双酶切,然后进行连接,构建pYr-ads-8-cfosp-IFNG真核表达质粒。④以pUC57-Simple-5HRE为模板,获得5HRE片段,并将其构建至pUC57-Simple-cfosp载体上,获得pUC57-Simple-5HRE-cfosp。再将其酶切,得到5HRE-cfosp片段,然后将其构建至pYr-adshuttle-8载体上,构建pYr-ads-8-5HRE-cfosp真核表达质粒。同时,将5HRE-cfosp片段,构建至pYr-ads-8-IFNG载体上,得到PYr-ads-8-5HRE-cfosp-IFNG真核表达质粒。⑤以pIRES2-ZsGreenl为模板,PCR扩增IRES片段,并将其构建至pYr-ads-1-iNOS载体上,构建pYr-ads-iNOS-TRESc再以pDONR223-IFNG为模板,PCR扩增IFNG基因片段,并将其构建至pYr-ads-iNOS-IRES载体上,得到pYr-ads-iNOS-IFNG。⑥ pUC57-Simple-cfosp为模板,PCR扩增cfosp片段,然后将其构建至pYr-ads-iNOS-IFNG载体上,得到pYr-ads-cfosp-iNOS-IFNG真核表达质粒。⑦将5HRE-cfosp片段,构建至pYr-ads-iNOS-IFNG载体上,获得PYr-ads-5HRE-cfosp-iNOS-IFNG真核表达质粒。⑧每个步骤后均需挑取阳性克隆,酶切测序鉴定后进行下一步构建,最后大量抽提质粒。⑨将pYr-ads-8-cfosp、pYr-ads-8-IFNG、pYr-ads-8-cfosp-IFNG、 pYr-ads-8-5HRE-cfosp-IFNG、pYr-ads-cfosp-iNOS-IFNG、pYr-ads-iNOS-IFNG、 pYr-ads-5HRE-cfosp-iNOS-IFNG分别转染GLC-82细胞,用2Gy X射线处理后,用QT-PCR分析IFN-y和iNOS(诱导型一氧化氮合酶)基因的表达量。评价基因电路的放大作用及乏氧序列的增强作用。⑩将P5HRE-cfosp-iNOS-IFNG质粒转染GLC-82细胞后,2Gy剂量的X射线照射后的6h、12h、24h、48h、72h收集细胞,分析IFN-y和iNOS基因的表达量。分别取转染后的细胞给予0、1、2、4、8Gy五种剂量进行X射射线照射后24h收集细胞,分析IFN-y和iNOS基因的表达量。[结果]：①酶切、测序鉴定结果表明每步均得到了目的质粒,测序发现插入片段序列无改变,并且开放读码框正确。②用QT-PCR检测IFN-y和iNOS基因的相对表达量,结果表明P5HRE-cfosp-iNOS-IFNG与其他质粒相比,表达量最高,与没有乏氧序列的组(⑥pYr-ads-cfosp-iNOS-IFNG)相比,IFN-y的表达量高了约1.46倍,iNOS的表达量高了2.11倍(p<0.05)。与没有基因电路的组(⑤Yr-ads-8-5HRE-cfosp-IFNG)相比,IFN-y的表达量高了约1.32倍(p<0.05)。③在处理后6h、12h、24h、48h、72h集细胞。用QT-PCR检测IFN-γ和iNOS基因的表达量发现,在诱导6h,IFN-γ和iNOS基因的表达量即开始升高,24h升到最高值。在24h之前,IFN-γ iNOS基因的表达量随时间的延长而增加,之后逐渐减低。④细胞给予0、1、2、4、8Gy五种剂量进行X射线照射后24h用QT-PCR检测IFN-y和iNOS基因的表达量发现,2Gy组的表达量最高,其IFN-y的表达量是1Gy组的4.37倍,4Gy组的1.52倍,8Gy组的2.05倍(p<0.05)。其iNOS的表达量是1Gy组的4.96倍,4Gy组的1.56倍,8Gy组的2.17倍(p<0.05)。[结论1：①成功构建了基于乏氧/辐射双调控基因电路技术的p5HRE-cfosp-iNOS-IFNG真核表达质粒及中间各用于比较的质粒。并且酶切鉴定、测序鉴定均证实构建成功。②用QT-PCR检测了C-fos启动子的时效性,C-fos启动子在2Gy的X射线诱导24小时后,靶基因的表达量最高。评价了p5HRE-cfosp-iNOS-IFNG在肺癌细胞内的诱导表达,验证了HRE在缺氧环境中对辐射启动子的增强作用,和基因电路技术的有效性。第二章C225-Fe304/p5HRE-cfosp-iNOS-IFNG(靶向载基因磁性白蛋白纳米球)的制备及靶向性研究[目的]：①制备表征Fe3O4磁性纳米粒,用PEI修饰Fe3O4磁性纳米粒并进行表征,研究PEI-Fe3O4复合物作为基因载体的可行性。②制备载基因磁性白蛋白纳米球及靶向载基因磁性白蛋白纳米球。③鉴定靶向载基因磁性白蛋白纳米球的免疫特性(即靶向性)并观察其转染效率。④从体内外水平,探讨靶向载基因磁性白蛋白纳米球对人肺癌细胞GLC-82细胞的靶向效应。[方法]：①采用化学共沉淀法制备Fe3O4磁性纳米粒,聚乙烯亚胺(PEI)对其进行表面修饰。②采用透射电镜(transmission electron microscope, TEM), ZETA SIZER3000激光粒度分析仪,傅立叶红外光谱(fourier transform infrared spectroscopy, FTIR)对修饰前后纳米粒进行表征。③琼脂糖凝胶电泳检测PEI-Fe3O4结合DNA的情况。利用pEGFP-Cl观察PEI-Fe3O4介导外源基因转染的效率。④采用去溶剂化-交联法制备载基因磁性白蛋白纳米球,用异型双功能交联剂SPDP耦连纳米球和西妥昔单抗(C225),制备成靶向载基因磁性白蛋白纳米球,运用TEM^ ZETA SIZER3000激光粒度分析仪对其表征,在不同时间点测其在PBS缓冲液和RPMI1640培养液中的粒径,评价其稳定性。动态测定其体外释放基因速率。用硫氰酸盐分光光度法测其含Fe量。⑤用靶向载基因磁性白蛋白纳米球转染GLC-82细胞,观察其转染效率。⑥运用玻片凝集实验、免疫荧光染色实验鉴定纳米球的免疫特性。⑦采用普鲁士蓝染色、细胞免疫荧光实验及细胞MRI实验观察靶向载基因磁性白蛋白纳米球与人肺癌细胞体外特异性结合的能力。⑧建立裸鼠肺癌移植瘤动物模型,待肿瘤直径达0.5cm左右用于实验,对裸鼠进行MRI。将裸鼠分成C225靶向组、非C225靶向组和C225抑制组。分别经尾静脉注射靶向载基因磁性白蛋白纳米球、非靶向载基因磁性白蛋白纳米球和靶向载基因磁性白蛋白纳米球+C225。在注射前及注射后2h、8h、24h、72h分别进行7.0 Tesla超高场强实验动物MRI系统成像,观察不同时间点肿瘤的信号变化,成像序列包括SE-TIWI、SE-T2WI、GRE-T2*WI。量化分析肿瘤组织信号改变的程度、范围、随时间的改变。测量感兴趣区(肿瘤、肌肉组织)T2WI及T2*WI信号强度,计算信号变化率。最后用SPSS 18.0统计软件进行统计、分析。病理组织学检查：包括常规HE染色、普鲁士蓝染色。[结果]：①制备的Fe3O4和PEI-Fe3O4磁性纳米粒表征：TEM检测显示磁性纳米粒电子密度高、大小较一致,并且修饰前后形态大小差别不大；FTIR结果显示了修饰后纳米粒的特征峰值,证明了PEI的成功吸附；激光粒度分析仪电位分析显示在pH为7的中性环境,Fe3O4纳米粒的zeta电位值为0±0.5mV,而PEI修饰后纳米粒子的电位值为36.3±0.6mV。②琼脂糖凝胶电泳检测到PEI-Fe3O4与DNA结合情况良好；PEI-Fe3O4可将外源基因转染至GLC-82细胞并高效表达。③自制的空载白蛋白纳米球及靶向载基因磁性白蛋白纳米球在TEM检测下为球形,大小均匀,并且在靶向载基因磁性白蛋白纳米球中明显地观察到在电子密度较低的白蛋白纳米球中包裹着电子密度较高的磁性纳米粒。ZETA SIZER3000激光粒度分析仪显示载基因磁性白蛋白纳米球的水合粒径为189.5±2.4nm；靶向载基因磁性纳米球的水和粒径约为211.9±3.1nm。在pH为7的中性环境中,载基因磁性白蛋白纳米球的zeta电位值是-37.9±0.4 mV,而耦联了C225的靶向载基因磁性白蛋白纳米球的电位值为-40.2±0.7 mV。在不同时间点测其在PBS缓冲液和RPMI1640培养液中的纳米球粒径差别不大,稳定性良好。④体外动态释放基因速率,计算其累积释放率显示,该材料15小时释放基因为96.45%,曲线平缓；硫氰酸盐分光光度法测含Fe量平均在2.2 mg/ml;转染实验结果显示靶向载基因磁性白蛋白纳米球能够有效转染GLC-82细胞,且转染效率高于非靶向载基因磁性白蛋白纳米球。⑤靶向载基因磁性白蛋白纳米球玻片凝集实验与对照组相比,靶向载基因磁性白蛋白纳米球组与抗血清孵育后观察到明显地凝集现象；免疫荧光染色显示靶向载基因磁性白蛋白纳米球表面发出明亮绿色荧光,而对照组未观察到荧光。⑥普鲁士蓝染色结果显示在靶向组与GLC-82细胞孵育后,细胞内有大量明显蓝染的铁颗粒存在,而非靶向组细胞内少见；细胞免疫荧光染色显示靶向组细胞的表面有绿色荧光,而非靶向组未观察到绿色荧光；细胞MRI实验结果显示靶向组与GLC-82细胞共孵育后在T2WI上信号强度不同程度的降低,而非靶向组与GLC-82细胞共孵育后在T2WI上信号强度无明显降低。⑦在体MRI成像结果显示,C225靶向组注射后肿瘤组织不同时间点的T2WI、 T2*WI强度及信号变化率均有明显下降,具有统计学差异(p<0.05)。而非C225靶向组和C225抑制组在注射后8h和24h两个时间点的信号亦有轻度下降,但下降幅度较C225靶向组小,且持续时间较靶向组短。不同时间点的T2弛豫时间,从24h时间点开始,C225靶向组与非靶向组和C225抑制组比较具有明显差异,结果有统计学意义(p<0.05)。⑧常规HE染色结果表明所建立的裸鼠荷肺癌皮下移植瘤动物模型符合小鼠肺癌的形态结构。普鲁士蓝染色结果显示：C225靶向组肿瘤组织内见较多的蓝染的颗粒,代表Fe颗粒多；而非C225靶向组和C225抑制组内少见蓝染的Fe颗粒存在。[结论]：①应用化学共沉淀法已成功制备了Fe304磁性纳米粒且PEI成功地修饰于Fe304磁性纳米粒。②修饰后的PEI-Fe3O4磁性纳米粒可以作为基因的载体。③成功制备了白蛋白纳米球、载基因磁性白蛋白纳米球,成功耦连了西妥昔单抗与载基因磁性白蛋白纳米球。④靶向载基因磁性白蛋白纳米球具有缓释作用,并且能高效转染人肺癌细胞GLC-82。⑤细胞实验和体内磁共振实验都说明靶向载基因磁性白蛋白纳米球对人肺癌细胞GLC-82具有良好的靶向效应。第叁章基于基因和分子靶向治疗技术的靶向载基因磁性白蛋白纳米球治疗肺癌的体内外实验研究[目的]：①体外水平探讨靶向载基因磁性白蛋白纳米球治疗人肺癌的作用。②通过动物实验,从体内水平探讨靶向载基因磁性白蛋白纳米球对肺癌的治疗作用。[方法]：①体外采用CCK8及流式细胞技术测定靶向载基因磁性白蛋白纳米球体外治疗肺癌的效果。并用透射电镜观察细胞超微结构的变化。②建立裸鼠肺癌移植瘤模型,将靶向载基因磁性白蛋白纳米球经尾静脉注射入裸鼠,经辐射3次,6周后处死裸鼠。计算肿瘤体积抑制率和质量抑制率,制作肿瘤组织标本,进行常规病理学检查。③通过血清生化检查和血常规检测及各内脏器官组织病理学观察初步评价靶向辐射基因联合治疗的安全性。[结果]：①CCK8实验结果显示靶向载基因磁性白蛋白纳米球能明显抑制人肺癌细胞GLC-82的增殖,FCM检测显示其能诱导GLC-82细胞的凋亡,且其效果较其他组显着。透射电镜下可观察到各组细胞均有不同程度的凋亡,细胞内可见磁性材料沉积。②靶向辐射基因联合治疗组的肿瘤质量抑制率和肿瘤体积抑制率分别为82.54%和85.72%,明显高于单抗治疗组(36.51%、34.33%)、辐射放疗组(42.06%、40.89%)、辐射基因联合治疗组(64.29%、65.64%)和靶向辐射联合治疗组(70.63%、72.57%)(p<0.05)。③各治疗组肿瘤有不同程度坏死,部分坏死灶可见炎性细胞浸润。其中靶向辐射基因联合治疗组坏死程度最严重。可见大片坏死灶,坏死区域呈红染,肿瘤细胞崩解,胞核消失,部分细胞核固缩。其它治疗组也均有不同程度的坏死,程度较靶向辐射基因联合治疗组轻,但也可见肿瘤细胞的密度下降,细胞排列松散,胞浆呈红染。阴性对照组与各治疗组的心肝脾肺肾等内脏组织均没有发现明显的病理学变化。④建模前和治疗结束后各组裸鼠血细胞计数,各实验组与阴性对照组及建模前之间均无统计学差异(p>0.05)。提示建模和各治疗对骨髓造血系统无明显抑制作用。[结论]：①靶向辐射基因联合治疗能显着抑制培养人肺癌细胞GLC-82的增殖,诱导细胞凋亡。②分子靶向治疗、放疗和基因治疗叁者联合治疗肺癌具有明显的协同作用,能有效抑制肺癌的生长,效果优于单一治疗也优于两两联合治疗。第四章靶向载基因磁性白蛋白纳米球治疗肺癌的分子机制研究[目的]：从分子水平探讨靶向载基因磁性白蛋白纳米球介导的分子靶向联合基因治疗肺癌的机制。[方法]：①采用免疫组织化学方法检测治疗后各组肿瘤组织中Bcl-2、Bax、 survivin、VEGF、EGFR、PCNA、p53、Ki67蛋白的表达。②采用western blot检测各治疗组中Bcl-2、Ki67、survivin、caspase-3与caspase-8的表达量,使用Gel-Pro32软件对结果进行灰度分析。从分子水平上探讨靶向载基因磁性白蛋白纳米球介导的分子靶向联合基因治疗肺癌的分子机制。[结果]：①单抗治疗组、辐射放疗组、辐射基因联合治疗组、靶向辐射联合治疗组、靶向辐射基因联合治疗组的Bax蛋白均有升高,但靶向辐射基因联合治疗组上升最明显。而单抗治疗组、辐射放疗组、辐射基因联合治疗组、靶向辐射联合治疗组、靶向辐射基因联合治疗组的Bcl-2、Ki67、p53、PCNA和survivin蛋白均有下降,其中靶向辐射基因联合治疗组下降得最明显。② Wesrern blot的结果显示,各治疗组与阴性对照组相比Bcl-2、Ki67、survivin均有下调,而caspase-3与caspase-8的表达上调。其中以靶向辐射基因联合治疗组最为显着。[结论]：靶向载基因磁性白蛋白纳米球介导的分子靶向联合基因治疗肺癌的机制可能与下调PCNA、Ki67蛋白表达而抑制肿瘤增殖；抑制Bcl-2、p53、survivin蛋白表达,上调Bax蛋白表达从而诱导肿瘤细胞凋亡；抑制肿瘤新生血管的形成,抑制EGFR表达有关。
夏泽锋[5]2006年在《生物磁性纳米微粒的研制及磁控靶向基因治疗大肠癌的体外实验研究》文中指出第一部分:医用纳米级Fe3O4磁流体的制备及急性毒理学研究目的制备医用纳米级Fe304磁流体,观察其急性毒性,为进一步研究长期毒性、以及载附药物的实验作参考。方法采用化学共沉淀法制备Fe304磁流体,观察其理化性质。按不同剂量分别以口服法、静脉注射法及腹腔注射法对小白鼠进行给药,观察小白鼠的急性毒性反应和主要脏器的病理学改变。结果Fe304磁流体呈黑褐色混悬液,粒径范围8.3 14nm-89.465nm,平均粒径为19.920nm。小白鼠的口服半数致死剂量(LDso)>2104.8mg/kg,最大无作用剂量(EDo)为320.10mg/kg;静脉注射LD50>438.50mg/kg,EDo为160.05mg/kg;腹腔注射LD5o>1 578.6mg/kg,EDo为320.10mg/kg。主要脏器未见明显病理改变。结论用化学共沉淀法制备的医用纳米级Fe304磁流体,其急性毒性很低,可以考虑作为药物载体的基材。第二部分:葡聚糖磁性纳米微粒的制备及理化性质的研究目的制备具有磁响应性强、粒径小且分布均一的葡聚糖磁性纳米微粒,为消化道恶性肿瘤的磁控靶向治疗提供磁性载体。方法利用超声波的粉碎空化作用,采用化学共沉淀法一步合成葡聚糖磁性纳米微粒。通过扫描电镜和原子力显微镜观察微粒的形态和大小,激光光散射粒度分析仪检测微粒的粒径及Zeta电位,磁强计检测微粒的磁响应性。结果该方法制备的葡聚糖磁性微粒多呈球形或椭圆形,有效粒径为93.1±2.2nm,半峰宽为26.7±1.3nm,Zeta电位为正。在外加场强为104Oe、温度为18℃的条件下微粒的磁响应强度为26.0±1.1emu/g,撤除磁场时剩磁为零,提示微粒具有超顺磁性。结论用该法制备的葡聚糖磁性微粒,具有有效粒径小、粒径分布窄以及磁响应性高的优点,可考虑作为化疗药物或核酸的磁性载体。第叁部分:磁性基因复合物的合成及特性研究目的了解葡聚糖磁性纳米微粒与核酸类物质的结合情况,以及转染肿瘤细胞的能力。方法以不同剂量的葡聚糖磁性纳米微粒与pGenesil-1质粒载体充分混合作用,按二者质量比分组,并设置单纯质粒(不加磁液)作为对照组。经溴化乙锭染色后,通过琼脂糖凝胶电泳观察二者的结合情况,并用BANDSCAN软件分析结合率;以不同基因载体(包括Lipofactamine2000、Sofast梭华及葡聚糖磁性纳米微粒)载附相等量的pGenesil-1质粒(含绿色-荧光蛋白表达框)体外转染大肠癌细胞Lovo细胞,分别给予外加磁场和不加磁场作用后,于不同时间点在倒置荧光显微镜下观察细胞的绿色荧光蛋白的表达,比较转染效率。结果电泳结果显示,随着葡聚糖磁性纳米微粒的含量逐渐增加,与其结合的pGenesil-1逐渐增多,没能结合而显影的DNA逐渐减少。BANDSCAN软件分析显示,当二者的质量比从1增加到5时,二者结合率有一个快速升高的过程,而继续增加磁性微粒的含量,结合率升高的过程趋缓;磁性转染后Lovo细胞中绿色荧光蛋白的检测结果显示,外加磁场作用能显着提高葡聚糖磁性纳米微粒的早期转染效率。结论本实验制备的葡聚糖磁性纳米微粒能够较好的与质粒DNA相结合,起到基因载体的作用;在外加磁场的作用下,其早期转染效率得到显着提高。第四部分:磁控靶向RNA干扰抑制大肠癌c-myc基因的表达目的观察磁性纳米微粒介导的RNA干扰技术基因转染大肠癌Lovo细胞后,c-myc基因转录及表达的变化,以及对大肠癌细胞的影响。方法构建含有c-myc基因潜在特异性干扰序列的质粒DNA(pGenesil-1-X1、pGenesil-1-X2),以及含对照引物的pGenesil-1-HK。以自行制备的葡聚糖磁性纳米微粒为载体载附该质粒DNA,设裸质粒pGenesil-1、单纯葡聚糖磁性纳米微粒、不加药组作为对照组。在外加磁场的作用下,体外转染大肠癌Lovo细胞。转染后24小时,通过rt-PCR及western-blot方法分别检测大肠癌细胞内c-myc基因的mRNA转录水平及c-myc蛋白的表达,采用流式细胞术检测细胞凋亡率,透射电镜观察细胞改变情况。结果磁性转染pGenesil-1-X2的Lovo细胞,其c-myc基因的mRNA转录水平降低82%,c-myc蛋白的表达降低85%,24小时的凋亡率为23.7%。结论磁控靶向RNA干扰技术在体外能够发挥干扰作用,显着抑制了c-myc基因mRNA的转录以及相关蛋白的表达,并能使大肠癌细胞产生凋亡。
刘岚[6]2004年在《谷氨酸修饰的磁性叁氧化二铁纳米颗粒的安全性和药物代谢动力学研究》文中进行了进一步梳理“纳米”是一种度量单位,1nm为10-9m。纳米材料是结构单元尺寸小于100nm的晶体或非晶体。由于结构上的特殊性使得纳米材料具有一些独特效应,如表面效应和小尺寸效应等,从而在实际应用中,表现出优异的性能和全新的功能,如纳米药物控释系统可缓释药物、靶向输送、延长药物作用时间、提高药物的稳定性、减少给药量,致使全身毒性反应降低[1]。以磁性氧化铁为核心的各种纳米颗粒作为恶性肿瘤的靶向治疗剂,靶向性高,疗效好,可望成为今后肿瘤靶向治疗的主要手段之一。本课题组研究发现,谷氨酸修饰的磁性叁氧化二铁纳米颗粒(以下称nano-Fe2O3-Glu)具有理化性质稳定、分散度好、磁靶向性能优越、初步动物实验治疗效果好等优点,但其进入人体后对人体的影响尚未见报道,影响了临床的安全、合理用药。本研究由静脉途径给予实验动物nano-Fe2O3-Glu,对其在机体内的安全性及分布情况进行了研究,根据国家药品监督管理局2002年1月制定的《化学药品和治疗用生物制品研究指导原则》(试行),用急性毒性实验(单次给药实验)、长期毒性实验(重复给药实验)研究nano-Fe2O3-Glu对机体的一般毒性情况;在特殊毒理研究中,采用小鼠骨髓细胞微核实验、小鼠精子畸形实验、鼠伤寒沙门氏菌回复突变实验,从细胞水平和基因水平探讨了nano-Fe2O3-Glu的致突变性。通过药物代谢动力学实验,以59Fe为示踪剂,研究nano-Fe2O3-Glu进入机体后的组织分布及血中浓度的变化情况。通过对nano-Fe2O3-Glu急性毒性、长期毒性研究发现,nano-Fe2O3-Glu静脉给药的昆明种小鼠LD50为247.66mg/( kg?bw),参照日本药学会对医药品的毒性分级, nano-Fe2O3-Glu属于“普通药”。对SD大鼠连续14d腹腔注射后,与同性别阴性对照组比较,除各染毒组大鼠的白细胞均数显着升高,其中中性粒细胞比例增高外,高剂量组雌鼠的血小板增多(p<0.05)。此外,高、中剂量组大鼠的肝/体比下降,高剂量组雌鼠的肺/体比升高,高剂量组大鼠、中剂量组雌鼠丙氨酸氨基转移酶(ALT)下降,高剂量组雌鼠的肌酐(Crea)显着升高,但脏/体比及血生化指标的改变仍在正常范围内。光镜检查未见组织病理学改变。为研究nano-Fe2O3-Glu的致突变性,我们进行了Ames实验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核实验及小鼠精子畸形实验,实验结果均为阴性。提示在本实验条件下,尚未发现nano-Fe2O3-Glu具有致突变性。为了了解nano-Fe2O3-Glu进入机体后的代谢分布情况,给临床用药提供依据,我们采用了同位素示踪法,在合成nano-Fe2O3-Glu的同时加入59Fe作为示踪剂,合成终产物经鉴定为直径15nm的nano-59Fe-Fe2O3-Glu。以5.12mg/( kg?bw)小鼠尾静脉给药,分别于0min、10 min、20min、30min、60min、2h、7h、12h、1d、2d、4d、8d、16d、32d、64d处死,取脏器测量放射性计数率值。结果显示,nano-59Fe- Fe2O3-Glu在各脏器中的分布状况及分布峰时不同,其中在肝脏、脾脏中含量较多,脂肪、肌肉、脑组织、性腺、眼球中含量较少,能通过血脑屏障、血睾屏障、血眼屏障。nano-59Fe-Fe2O3-Glu在心脏中出现峰值的时间为7h和2d;在肝脏中的高峰为60min;在脾脏中的分布曲线呈波浪形改变,在20min和12h时浓度较高;肺脏在给药的一瞬间浓度较大,之后迅速下降,处于较低水平,未见明显波动;肾脏放射性在64d的测定中一直稍高于本底,未见规律性改变;脂肪、肌肉、脑、眼<WP=7>球、性腺的放射性处于较低水平,其中脑在24h和34d时达到高峰,眼球在7h达到高峰,性腺的2个峰分别在2d和64d。另取3只昆明种小鼠,以同一剂量经小鼠尾静脉给药,分别于不同时间点眼球取血20μl,测定计数率值,绘制药—时曲线图,计算代谢动力学参数。结果显示,经静脉给药的nano-59Fe-Fe2O3-Glu符合静脉注射双室模型,方程为c=29.09e-4.29t+1.13e-0.009673t。T1/2(α)=0.16h,T1/2(β)=71.65h。以上结果表明,nano- Fe2O3-Glu静脉给药对哺乳动物毒性较小,未见有致突变性。nano- Fe2O3-Glu在各主要器官中均有分布,其中肝脏、脾脏中分布最多,血液中的分布与肝脏、脾脏中的分布呈消长关系,可以推测肝脏、脾脏为其靶器官。nano-Fe2O3-Glu能通过血脑屏障、血睾屏障和血眼屏障。
参考文献：
[1]. 氧化铁磁性纳米转运体系的研制及其在体内外基因转运中的应用[D]. 向娟娟. 中南大学. 2003
[2]. IONP-PLL进入细胞机制的研究及其在基因治疗中的应用[D]. 李征. 中南大学. 2008
[3]. 可溶性壳聚糖季铵盐（CSTM）的合成、表征及其在基因载体和MR分子探针中的应用[D]. 王江峰. 第二军医大学. 2010
[4]. 基于基因和分子靶向治疗技术的C225/p5HRE-cfosp-iNOS-IFNG磁性白蛋白纳米球治疗肺癌的实验研究[D]. 张皓. 东南大学. 2016
[5]. 生物磁性纳米微粒的研制及磁控靶向基因治疗大肠癌的体外实验研究[D]. 夏泽锋. 华中科技大学. 2006
[6]. 谷氨酸修饰的磁性叁氧化二铁纳米颗粒的安全性和药物代谢动力学研究[D]. 刘岚. 东南大学. 2004
标签：生物医学工程论文; 基因合成论文; 纳米论文; 肺癌转移论文; 纳米效应论文; 纳米粒子论文; 氧化铁论文; 辐射危害论文; 辐射剂量论文; 细胞转染论文; 基因治疗论文; 质粒载体论文; 肺癌论文; 癌症论文; 科普论文;