1.沈阳医学院附属中心医院骨一科 辽宁省沈阳市 110024；
2.沈阳医学院基础医学院病原生物教研室 辽宁省沈阳市 110034
摘要：目的：采用全骨髓贴壁法从兔骨髓中分离培养BMSCs，并进行成骨的诱导分化及鉴定。方法：采用全骨髓贴壁法分离兔BMSCs，观察其形态特征；选择维生素C、β-甘油磷酸钠、地塞米松等生长因子诱导BMSCs的成骨分化，碱性磷酸酶染色测定活性；流式细胞仪检测其表面抗原CD29、CD34、CD44、CD45的表达情况。结果与结论：体外培养兔BMSCs成梭型，细胞扁平，胞体狭长，增殖能力强。流式细胞仪分析结果显示，第3代培养的细胞CD29和CD44阳性，CD34和CD45阴性。成骨诱导培养10d，碱性磷酸酶染色阳性。提示全骨髓贴壁法分离兔BMSCs是一种简单有效的分离方法，可作为稳定种子细胞进行体内组织工程研究。
关键词：间充质干细胞；全骨髓贴壁培养；细胞鉴定；成骨诱导
BMSCs[1]在组织工程、细胞移植、基因治疗等领域备受重视，是存在于骨髓中的一类非造血干细胞，其可向多种细胞类型分化，且增殖能力强，已经成为重要的组织工程种子细胞[2]。目前，临床获取BMSCs的方式较多，一般通过密度梯度离心法、流式细胞仪分离法等[3]，然而各有优缺点，弊端主要体现在细胞纯度不够，局限性大，操作繁琐，且价格通常较为昂贵等，因此关于BMSCs方法的研究也也逐渐成为临床研究的热点。本实验利用全骨髓贴壁法从兔骨髓中分离BMSCs，通过测定表面抗原分子和成骨的分化潜能，寻找一种简单有效的BMSCs 分离方法。
1 材料和方法
1.1材料：
1.1.1实验动物
新西兰兔大耳白兔，雌雄不限，每只约1kg。
1.2方法：
1.2.1原代细胞的分离和传代培养
无菌操作取100g兔的股骨，直接用含10％胎牛血清的低糖DMEM培养基冲洗骨髓，37℃，5%CO2培养，贴壁培养60min。
1.2.2细胞免疫表型分析
将所收集的细胞分成每管5X105细胞，离心速度为800r/min，随后于内加100ul的PBS重悬细胞以及含有PE的抗CD29、CD34、CD44、CD45抗体，并设置10ul进行对照实验，结束后采用流式细胞仪检测。
1.2.3细胞分化潜能的鉴定
维生素C，地塞米松及β-甘油磷酸钠分别及联合诱导成骨细胞分化。
1.2.4细胞酶活性测定
成骨细胞具有合成分泌碱性磷酸酶功能，依照试剂说明书用碱性磷酸酶对BMSCs染色。
2 结果
2.1兔骨髓MSC生物学特性
MSC体积小，成梭形，细胞刚贴壁，呈圆形，换液后，贴壁细胞清晰可见（图1A）；2～3 d可见少量短梭形、星形细胞分散贴壁生长，伸出伪足呈逗点状或短棒状；传代细胞比原代细胞贴壁快，3～4 d可见长梭形细胞80%～90%铺满培养瓶形成单层（图1B）。
2.2细胞表型分析
流式细胞仪分析第3代兔BMSCs，结果表明细胞CD29（94.36%）和CD44（88.40%）阳性，CD3（4.81%）和CD45（13.52%）阴性，符合BMSCs的特点，第3代可获得较高纯度的BMSCs，可以作为稳定的种子细胞进行体内研究（图2）。
2.3 成骨诱导分化及碱性磷酸酶活性鉴定
通过维生素C，地塞米松及β-甘油磷酸钠分别及联合诱导成骨细胞分化，诱导3-4天后，可见细胞增殖迅速，为均匀簇状分布生长的长梭形成骨细胞（图3A-E）。成骨细胞具有合成分泌碱性磷酸酶功能，其细胞内碱性磷酸酶组化染色阳性（紫色）（图3F）。
3讨论
除了骨折会引起患者骨缺损外，外科手术治疗常会造成患者不同程度的骨缺损，尤其易出现长段的骨缺损，常会造成患者术后肢体关节功能活动受限，降低患者术后的生活质量，关于外科手术所致的骨缺损的防治也一直是临床研究的热点问题，但效果常不理想[4]。目前，针对手术治疗中出现的骨缺损情况，主要采用自体松骨质移植，效果较好，但治疗过程中仍有一定的局限性，彻底康复较为困难。组织工程学修复重建骨缺损给患者带来了完全康复的可能。BMSCs在组织工程、细胞移植、基因治疗等领域备受重视，是存在于骨髓中的一类非造血干细胞，易于获得和分离培养，已经成为重要的组织工程种子细胞。临床研究表明，骨髓细胞中的BMSCs水平一般不高，同时细胞成分与功能较为复杂，因此在进行原代培养时，应尽量分离出高纯度的BMSCs[5]。当前常用的获取BMSCs方法存在一定的局限性，弊端主要体现在细胞纯度不够，操作繁琐，价格昂贵等。因此，有必要寻找一种简单有效的MSC分离方法。
由于目前鉴定BMSCs没有确切的标准，因此常需要联合多种方法进行综合鉴定，形态学鉴定是目前常用的方法，且效果得到了广泛的证实。BMSCs呈梭形，细胞扁平，胞体狭长，核呈椭圆形，贴壁生长，成漩涡状或辐射状排列。我们将贴壁筛选法进行改良，实施全骨髓贴壁法，不需要特殊的试剂和器材，不仅使的机器对细胞的损伤变低，也有利于降低污染，使提取的成分纯度更高。
地塞米松、β- 甘油磷酸钠和维生素C是BMSCs 向成骨细胞分化和体外成骨的经典诱导方法，为最常用的成骨诱导剂[6]。本实验诱导后可见BMSCs细胞增殖迅速，为均匀簇状分布生长的长梭形成骨细胞，因成骨细胞具有合成分泌碱性磷酸酶功能，其细胞内碱性磷酸酶组化染色阳性（紫色）。
一般认为，BMSCs无特异性表面抗原，CD29、黏附分子CD44、CD166、CD105等皆可作为标志物。故筛选BMSCs表达阳性的CD29、CD44和表达阴性的CD34和CD45作参考指标。培养的细胞CD29和CD44阳性，CD34和CD45阴性，符合BMSCs的特点，与Pittenger等[7]研究结果相一致，这也进一步证实了本研究分离培养的细胞为BMSCs。
全骨髓贴壁法分离兔BMSCs是一种简单有效的分离方法，细胞纯度高，可作为稳定种子细胞进行体内组织工程研究。
参考文献：
[1]Friedenstein AJ，Gorskaja JF，Kulagina NN. Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs[J]. Exp Hematol，1976，4（5）：267-274.
[2]杨 丽，张荣华，谢厚杰，等.建立大鼠骨髓间充质干细胞稳定分离培养体系与鉴定〔J〕.中国组织工程研究与临床康复，2009；13（6）：1064-1068.
[3]Derubeis A R，Cancedda R. Bone marrow stromal cells（BMSCs）in bone engineering：limitations and recent advances.[J]. Annals of Biomedical Engineering，2004，32（1）：160.
[4]Jiang X，Zhao J，Wang S，et al. Mandibular Repair in Rats with Premineralized Silk Scaffolds and BMP-2-modified bMSCs[J]. Biomaterials，2009，30（27）：4522.
[5]赖平平，韩春茂，岑航辉，等.骨髓间充质干细胞的分离培养和生物学性状〔J〕.浙江医学，2004；26（5）：328-30.
[6]Wakitani S，Saito T，Caplan AL.Myogenic cells derived from rat bone marrow mesenchymal stem cells exposed to azacytidine〔J〕.Muscle Nerve，1995；18：1417-26.
[7] Pittenger M F，Mackay A M，Beck S C，et al. Multilineage Potential of Adult Human Mesenchymal Stem Cells[J]. Science，1999，284（5411）：143-147.
论文作者:陈拥1,刘,新2,朴成哲1
论文发表刊物:《中国误诊学杂志》2017年第25期
论文发表时间:2018/2/5
标签：细胞论文; 骨髓论文; 磷酸酶论文; 诱导论文; 碱性论文; 磷酸钠论文; 方法论文; 《中国误诊学杂志》2017年第25期论文;