王广金[1]2002年在《葡聚糖酶基因、高分子量谷蛋白优质亚基基因转化小麦的研究》文中进行了进一步梳理通过基因枪法和花粉管通道法，将β-1，3-葡聚糖酶基因导入到品质较好、产量较高，但抗病性差的龙辐3和龙辐10中；将HMW-GS 5+10基因导入到品质较好、产量较高的东农7742、龙辐10和龙辐8及产量较高、适应性广、抗逆性强，但品质差的新克旱九中。目的是选育出高产、抗病、质佳的转基因小麦新品系(品种)。 主要研究结果如下： 对12个基因型的幼胚进行培养效果研究。结果表明，分化率和培养力均存在基因型差异，而各基因型的出愈率差别不大。东农7742、龙辐3和龙6239培养力较高，是较理想的转化试材。叁种外植体(幼胚、幼穗和成熟胚)培养效果表明，幼胚、成熟胚的出愈率基本相同，高于幼穗，且差异达极显着。分化率差异较大，高低趋势为幼胚＞幼穗＞成熟胚，培养力大小为幼胚＞成熟胚＞幼穗。可见幼胚是较理想的遗传转化外植体，但选择何种外植体作为试材还应考虑试验条件，取材方便与否等因素。 利用基因枪法将葡聚糖酶基因导入龙辐3和龙辐10，经PCR扩增和RCR-Southern检测，有3株被证实已整合到小麦的基因组中。龙辐3的转化率为0.90％，龙辐10为0.88％。将HMW-GS5+10基因导入东农7742和龙辐10，经PCR检测证明有3株呈阳性，东农7742的转化率为2.63％，龙辐10为1.83％。经PCR检测和PCR-Southern杂交表明转基因龙辐10的T_1代中有3株被证实HMW-GS 5+10基因已整合到小麦基因组中。利用花粉管通道法将葡聚糖酶基因导入到龙辐3和龙辐10中，龙辐3中有3株，龙辐10中有1株经PCR扩增和PCR-Southern检测有与阳性对照相同的杂交带，转化率分别为1.55％和0.53％。另一DNA样本为龙辐10转葡聚糖酶基因形成的品系99K1354，其杂交带与阳性对照相同，证实该品系已将葡聚糖酶基因整合到基因组中。将HMW-GS 5+10基因导入到东农7742、龙辐10和龙辐8中，共获得9株PCR阳性株，经PCR-Southern杂交，这9株均具有与阳性对照相同的杂交带。东农7742、龙辐10、龙辐8的转化率分别为2.27％、2.44％和1.64％，其中21K867是5+10转新克旱九的品系(D_4代)，早期世代的选择采用半粒法的PAGE法。 显微压片观察表明：小麦自然授粉3min花粉尚未萌发，5min已开始萌发形成花粉管，20min时在于房顶部可见一些花粉管，30min时在子房内可观察到花粉管，40min花粉管已进入子房深处，有些已接近胚囊，60min时花粉管已开始有胼胝塞。小麦自然授粉不同时间剪掉柱头后的结实率调查结果表明，小麦自然开花20min就开始结实，40min后结实率比较平缓，因此，可以认为导入时间为小麦自然授粉后30-60min为好。 卡那霉素和G418均可以做为标记基因NPTⅡ的筛选剂，但G418的筛选效果要优于卡那霉素，G418的毒性较大，在去掉筛选剂的分化阶段，经G418筛选过的愈伤组织仍有一部分褐化、死亡。G418的适宜筛选浓度为25mg/L，卡那霉素为1000mg/L。对花粉通道法获得的Do代种子进行筛选时卡那霉素优于G418，理由是经卡那霉素处理后，芽鞘及叶片白化，易于区分抗性植株。PPT对愈伤组织的毒性较大，使愈伤组织变褐，甚至其毒性在分化阶段仍起作用。王广金 摘 要 222年n 月 花粉管通道是一种简便易行，成本低廉的转化手段之一，其主要难点是群体量大，筛选困难。本试验进行了花粉管通道法导人目的基因获得DO代种子筛选浓度的研究，并确定 PPT、Kan和 G418的适宜筛选浓度分别为 20mgh、1200mg／L和 50mglL。通过 PPT、Kn和G4筛选可淘汰大部分非转化植株，使检测工作量大大减少，提高花粉管通道法进行小麦转化的效率。 对转葡聚糖酶基因的品系99K 354进行了抗病性鉴定，其白粉病、赤霉病较受体龙辐 10提高 1．2级别，产量提高 3．2％；对转 HMW－GS 5＋10基因的品系 2lK867进行了品质分析，其沉淀值、稳定时间、延伸性和面积较受体新克旱九有较大提高，产量提高5．5％。两个转基因品系除目的基因性状表达外，其它农艺性状也产生了变化，这主要是由于目的基因整合位点的随机性及基因间互作造成的。 对转HMWAIS 5＋10基因的单株及转基因品系2lK867进行SDS。PAGE凝胶电泳检测，高分子麦谷蛋白亚基组成均具有5亚基和10亚基，从蛋白质水平证实了目的基因的表达。转葡聚糖酶基因单株初步抗性鉴定表明，绝大多数转基因植株的白粉病、赤霉病抗性较受体有所提高。
刘香利[2]2009年在《小麦遗传转化体系建立及高分子量麦谷蛋白14亚基基因的转化》文中研究指明小麦是世界上栽培面积最大的重要粮食作物。然而,小麦却是最后一个获得转化成功的重要禾谷类作物。主要原因就是目前常用的转化方法无论是基因枪法还是农杆菌介导法都依赖于组织培养技术,而小麦不同外植体组织培养受基因型影响很大,使其遗传转化集中在少数几种组织培养再生能力较高的品种上,而生产上大面积栽培品种由于再生频率低转化较困难,使得小麦的转基因工作进展缓慢,难以应用于育种实践。随着食品加工业的发展和人民生活水平的提高,对优质面包小麦的需求量日益增加。大量研究表明,小麦高分子量麦谷蛋白亚基(HMW-GS)组成与小麦加工品质密切相关。因此,利用优质高分子量麦谷蛋白亚基基因改良小麦品质具有重要理论及实践意义。本研究在克隆了小麦优质HMW-GS 1Bx14基因的基础上对生产上大面积种植的小麦品种组织培养特性进行研究,并利用基因枪和农杆菌转化法对1Bx14基因进行转化,同时对花粉管通道法转化法进行了初步探索,取得以下结果:1.对生产上大面积种植的不含1Bx14基因的小麦品种幼穗、幼胚和成熟胚组织培养特性进行研究,分析了不同小麦品种、不同外植体的出愈率及其愈伤组织的分化和再生潜力及其培养条件。结果表明,小麦不同品种和不同外植体愈伤组织诱导率均较高,都在90%以上,且不同品种间差异不大;而愈伤组织分化和植株再生率品种间和不同外植体间均存在很大差异;愈伤组织的诱导、分化和植株的再生是相互独立的,诱导率高并不表明分化率高,分化率高的品种再生率不一定高。同一品种不同外植体,幼胚愈伤组织分化和植株再生率最高,幼穗次之,成熟胚培养效果最差。不同小麦品种幼穗愈伤组织分化率依次为:绵阳19>洛阳8716>小偃107>陕354>小偃22>陕150>郑麦9023>西农88;幼胚分化能力依次为:绵阳19>小偃107>小偃22>郑麦9023>洛阳8716>陕354。成熟胚分化能力依次为:陕354>绵阳19>洛阳8716>小偃107>小偃22>郑麦9023。总体来说,绵阳19和小偃107幼胚、绵阳19和洛阳8716幼穗,以及陕354和绵阳19的成熟胚愈伤组织分化率相对较高,可作为遗传转化的受体材料。其中,绵阳19幼胚愈伤组织再生率最高,且多数为丛生苗,是转化最理想的材料。2.以绵阳19幼胚愈伤组织为材料,利用仅含有受控于1Dx2胚乳特异性启动子的1Bx14基因及其3-UTR的线性DNA表达框转化小麦幼胚愈伤组织。共转化小麦幼胚愈伤组织2480块,利用基因池法进行PCR筛选,从1219个转化再生植株中共检测出7株阳性单株,平均转化效率0.28%。7个转基因植株中有4个生长正常,3个植株出现表型变异(A1-14,B2-8和D5-10),表现为植株矮小,仅1～2个分蘖,且分蘖不能成穗,主茎成穗且穗较小,其中B2-8和D5-10未能结实,A1-14开花结实较晚,仅收获3粒种子。对5个正常结实的阳性植株所得的82个转化T1代种子用半粒法进行SDS-PAGE分析,L2、L4和L5叁个后代能检测到14亚基的表达,但表达量相对内源高分子量麦谷蛋白亚基较低;转基因植株A1-14的叁株T1代植株在大田均表现为雄性不育。初步建立了借助于PCR筛选的无标记转化体系。3.构建了胚乳特异性启动子驱动的HMW-GS 1Bx14基因植物表达载体,确立了绵阳19幼胚愈伤组织最适潮霉素筛选浓度50 mg/L,并利用基因枪法进行载体转化。共转化绵阳19幼胚愈伤组织652块,转化后的愈伤组织进行潮霉素筛选,共有11块愈伤组织分化出小植株,移栽后有8株存活,PCR和PCR-Southern结果显示7株为转化阳性植株,Southern杂交结果显示有6株转基因稳定整合,转化效率0.92%。SDS-PAGE结果显示,有叁个株系后代中检测到HMW-GS 1Bx14基因表达,但其他亚基都受到了不同程度的抑制。4.利用GUS瞬时表达对农杆菌转化体系进行优化,结果表明洛阳8716幼胚愈伤组织对LBA4404的敏感性高于绵阳19。EHA105对于两个品种幼胚愈伤组织侵染率都较LBA4404高。对于绵阳19幼胚愈伤组织,EHA105侵染的最佳参数为OD600 0.8×30 min,LBA4404为OD600 1.0×30 min;对于洛阳8716幼胚愈伤组织,EHA105侵染的最佳参数为OD600 0.8×30 min,LBA4404为OD600 0.8×60 min。利用LBA4404侵染绵阳19幼胚愈伤组织共483块,经潮霉素筛选和PCR分析后得到2株阳性植株;侵染洛阳8716愈伤组织321块,筛选后仅得到1株阳性植株。利用EHA105转化小麦绵阳19幼胚愈伤组织452块,筛选后得到5株阳性植株,侵染洛阳8716愈伤组织315块,得到2株阳性植株,所有处理平均转化率0.61%。5.以5个不含高分子量麦谷蛋白14亚基的小麦栽培品种为材料,对花粉管通道法转化条件进行了初步摸索。对转化后代利用基因池法进行PCR分析,结果表明,不同小麦品种不同处理间转化率存在很大差异,平均转化率0.56%。其中陕354处理2的转化率最高,为1.01%,其次为陕354处理4为0.93%。陕893的处理1、处理3和小偃107的处理1转化率也均较高,在0.8%以上。初步证明使用花粉管通道法对小麦进行遗传转化是可行的。
刘会云[3]2017年在《小麦无标记转基因体系建立和HMW-GS基因的转化》文中进行了进一步梳理高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)是小麦籽粒贮藏蛋白的重要成分,影响着面团弹性和加工品质。AS208为轮选987组织培养后代中鉴定出的无性系变异体,该材料缺失了1Bx20和1By20亚基,虽与对照轮选987相比其面包品质明显变差,但在鉴定其他HMW-GS功能和培育优质弱筋小麦等方面具有潜在应用价值。本研究拟在建立AS208、济麦22和矮抗58等中国商业化推广小麦品种(系)农杆菌转化体系及无筛选标记转基因植株获得体系的基础上,将相关HMW-GS基因转入AS208等小麦材料中。主要研究结果如下:1、以科农199、新春9号、CB037、Fielder和AS208等小麦品种(系)幼胚为材料进行农杆菌转化,建立了这些小麦品种(系)幼胚为外植体的稳定转化体系,并成功转化了大面积推广品种科农199、师栾02-1、石4185、川麦42和冀麦5265,转化效率分别达到22.7%、9.9%、8.0%、8.3%和14.7%。对获得的转基因植株进行试纸条检测,阳性植株率达到90%以上。2、通过培养基改良和愈伤组织生理状态调整,建立了小麦成熟胚高效再生体系,利用农杆菌转化Verry、CB037成熟胚成功获得了转基因植株,转化率分别为0.23%和0.61%。3、利用农杆菌介导法将携带GUS和bar基因的双T-DNA载体成功转入了科农199、新春9号、CB037和Fielder等小麦品种(系),对转基因植株T_0代进行组织化学染色、试纸条、PCR和Southern blot检测。结果发现,目标基因和标记基因共转化效率为49.0%左右。对T_1代植株中的GUS和bar基因进行组织化学染色、试纸条、PCR和Southern blot检测,获得了只含有GUS基因而不含有bar基因的转基因植株;通过统计T_1代中不同基因组合的频率,发现无筛选标记转基因植株频率为14.5%。结合Southern blot检测结果,认为载体上2段T-DNA区的长度和比例影响了2个基因在小麦基因组上整合的拷贝数和表达水平,进而影响了目标基因和标记基因的分离。4、通过对T_1代转基因植株进行试纸条和PCR检测,发现bar基因在T_1代中普遍存在沉默现象,沉默率达33.5%;而T_1代中对GUS基因进行的PCR检测与组织化学染色结果一致,证明T_1代中GUS基因没有发生沉默。通过重亚硫酸盐对bar基因测序分析,发现bar基因沉默由35S启动区一些位点的甲基化引起。5、利用农杆菌介导法分别将携带1By8、1Bx20、1By20和1Sx2.3等HMW-GS基因的双T-DNA植物表达载体转入了AS208中,利用试纸条共检测出69株转基因植株,其中,转1By8植株20株,转1Bx20植株20株,转1By20植株19株,转1Sx2.3植株10株。同时,对获得T_0代转基因植株中的Glu-1B基因进行了检测,结果发现,含有1By8基因植株4株,含有1Bx20基因植株8株,含有1By20基因植株5株,含有1Sx2.3基因植株4株。进一步对从阳性植株籽粒中提取的HMW-GS进行SDS-PAGE分离鉴定,发现除1Sx2.3亚基在AS208中有表达外,1By8、1Bx20和1By20亚基均没有表达。
王艳丽[4]2006年在《小麦不同外植体农杆菌转化体系研究》文中认为目前为止,小麦幼胚是利用农杆菌介导法成功转化小麦的唯一外植体,Bobwhite是常用的基因型,不但小麦幼胚的取材受季节的严格限制,而且存在着基因型单一、转化效率不稳定等缺点。筛选对农杆菌敏感的小麦基因型,建立或完善农杆菌转化小麦成熟胚、幼穗和幼胚的技术体系,同时将一些与性状改良有关的功能基因导入小麦,对于小麦新品种选育和功能基因组研究具有重要意义。本研究选用来自全国各地的91个小麦基因型,分别以其成熟胚、幼穗和幼胚为受体材料进行农杆菌转化,通过GUS基因的瞬间表达筛选对农杆菌敏感的小麦基因型,通过对受体材料处理方式和共培养方式的比较等技术环节的研究,将高分子量麦谷蛋白亚基编码基因154X、154Y、WT和标记基因npt Ⅱ、报告基因GUS导入小麦。 通过农杆菌侵染后GUS基因瞬间表达,从80个小麦品种中筛选到了97H2169、轮选208、豫麦66、扬麦6号等基因型,其幼胚对农杆菌感染非常敏感,GUS基因表达率达到了50.0%-93.3%。从83个小麦品种中筛选到京冬8号、CA9924、西农2611、京冬11等基因型的幼穗经对农杆菌感染比较敏感,GUS基因瞬间表达率达到了60.0%-82.8%,多数基因型的幼穗对农杆菌感染不敏感。对小麦受体组织与农杆菌的共培养方式进行了比较,结果表明,滤纸上共培养方式更有利于农杆菌对小麦叁种不同外植体的侵染,滤纸上共培养方式GUS基因表达率平均比固体培养基共培养方式高16.6%。对小麦成熟胚在农杆菌感染前采用了叁种不同的处理方法,结果表明,成熟胚纵切成两半后直接进行农杆菌转化更有利于农杆菌的侵染和抗性愈伤组织诱导、再生,首次利用农杆菌介导法转化小麦成熟胚获得了小麦转基因植株。利用农杆菌介导法转化小麦幼胚也获得了转基因植株,利用农杆菌介导法转化小麦幼穗获得了抗性再生植株。对转基因植株进行了PCR检测、ELISA检测和Southern blot检测,并对T_1代转基因植株进行了遗传分析,对T_2代转基因材料和T_3代转基因材料进行了跟踪检测。
刘亚西[5]2010年在《小麦LMW-GS基因类群品质效应及茎基腐病遗传特性研究》文中提出麦类作物包括小麦、大麦、燕麦、黑麦和小黑麦。其中小麦(Triticum aestivum L.)是我国乃至全世界最重要的粮食作物之一,和水稻、玉米一起并称世界叁大粮食作物,其种植面积和产量均居禾谷类作物之首,在农业生产中占有十分重要的地位。大麦(Hordeum vulgare L.)是全球第四大禾谷类作物,具有生育期短、适应性广、耐瘠、抗逆性强等生育生理特点,且用途广泛,集经济作物、粮食作物和饲料作物于一体。虽然前人围绕着加强抗性、提高产量和改善品质开展了卓有成效的工作,但是随着全球人口增长与气候变化,对小麦和大麦的抗性、产量和品质提出了新的要求。本论文主要围绕改善小麦加工品质,加强小麦和大麦茎基腐病抗性两方面做一些研究。在改善小麦加工品质方面主要研究了四川小麦地方品种低分子量谷蛋白亚基等位基因变异及其对品质的影响；在小麦和大麦茎基腐病抗性研究方面,系统解析了茎基腐病病原菌侵染机理,并对大麦种质资源的茎基腐病抗性进行了评价和筛选；同时,对小麦茎基腐病抗性机制进行了探索。取得了以下主要研究结果：1.利用分子标记技术,对67份四川小麦地方品种的低分子量谷蛋白亚基等位基因位点进行了鉴定,结果表明低分子量谷蛋白亚基等位基因变异较大,在Glu-3位点发现13种不同类群LMW-GS基因组合的类型,其中a组合类型(包括第一、第二和第八类群的LMW-GS基因)、f组合类型(包括第叁和第四类群的LMW-GS基因)和i组合类型(包括第五、第六、第七和第九类群的LMW-GS基因)分别为Glu-A3、Glu-B3和Glu-D3位点的优势类型。通过对低分子量谷蛋白亚基等位基因变异对品质相关指标影响的分析,在Glu-A3位点,发现第二类群的LMW-GS基因对小麦蛋白质含量、沉降值、湿面筋含量和稳定时间均具有负效应；在Glu-B3位点,发现第四类群的LMW-GS基因小麦面粉的面团稳定时间具有正效应：在Glu-D3位点,发现第五类群的LMW-GS基因对小麦湿面筋含量具有正效应,而第七类群的LMW-GS基因对小麦湿面筋含量具有负效应。2.利用小麦株高近等基因系,研究了小麦株高与茎基腐病抗性的相关性,发现在全部12对近等基因系中,矮秆基因型均比相对应的高秆基因型表现更好的茎基腐病抗性。同时,对12对近等基因系的赤霉素处理实验发现,赤霉素处理后导致所有基因型茎基腐病抗性下降,并且茎基腐病抗性变幅与苗长变幅呈负相关。因此,证实了矮秆基因增强茎基腐病抗性,外源赤霉素负向调节茎基腐病抗性,并推测细胞密度是造成高矮秆基因型茎基腐病抗性差异的重要因素之一。3.利用RT-qPCR技术测定了4对小麦株高近等基因系中9个防卫相关基因在不同生长发育时期被茎基腐病病原菌诱导的表达模式。结果发现PR3和PR4基因在不同生长发育时期和不同基因型中均被茎基腐病病原菌显着诱导上调表达,表明PR3和PR4基因是小麦茎基腐病病原菌侵染过程中的关键防卫反应基因。同时,分析了防卫相关基因分别在矮秆基因型和相对应的高秆基因型中的表达模式,没有发现在全部矮杆基因型中都一致被强诱导上调表达的防卫相关基因,表明矮秆基因型比高秆基因型具有更好茎基腐病抗性的原因可能不是由于矮秆基因调控防卫反应基因造成的,这对下一步寻找小麦株高近等基因系中高矮秆基因型茎基腐病抗性差异的原因提供了线索。4.利用RT-qPCR测定了不同时期茎基腐病病原菌在叁个小麦品种(Kennedy、Sunco和Wolloroi)和六个大麦品种(Commander、Dash、Franklin、Gairdner、Lockyer和Mundah)茎基部的相对含量。发现茎基腐病病原菌侵染小麦及大麦茎基部有叁个明显的阶段：1)品种茎基腐病病原菌相对含量显着上升的阶段；2)品种茎基腐病病原菌相对含量显着下降的阶段；3)品种茎基腐病病原菌相对含量再次显着上升的阶段。同时,通过比较大麦与小麦的相对茎基腐病病原菌含量,发现大麦相对菌含量明显高于小麦相对菌含量,表明大麦比小麦更易感茎基腐病。5.对1047份大麦种质资源进行了茎基腐病抗性鉴定,结果表明：当今大麦主栽品种抗性较差,全部高感茎基腐病,因此挖掘具有茎基腐病抗性的大麦资源,培育抗茎基腐病品种迫在眉睫；在澳大利亚冬季谷物中心随机选择的993份大麦资源材料中,没有发现茎基腐病免疫材料,但发现高抗材料33份,占总数的3%,包括147982、148012、140093、140961、151952、148090等,中抗材料47份,占总数的5%,其余92%的大麦种质资源均为感病材料。该结果明确了大麦种质资源的茎基腐病抗性,发现了一些优异的茎基腐病抗性资源材料,为改良大麦主栽品种的茎基腐病抗性提供了物质基础。
喻修道, 徐兆师, 陈明, 李连城, 马有志[6]2010年在《小麦转基因技术研究及其应用》文中认为近年来植物转基因技术研究迅速发展,大豆、玉米、油菜和棉花等转基因品种已大面积推广应用,取得巨大的经济和社会效益。小麦是世界上主要的粮食作物,自1992年第一株转基因小麦诞生以来,小麦转基因技术发展较快,为开展小麦分子育种奠定了基础。目前,小麦遗传转化主要采用基因枪法和农杆菌介导法,分别占68.8%和15.9%。研究涉及抗病、抗虫、抗逆、品质改良、提高产量等方面,其中研究较多的为抗病(39.7%)和品质改良(25.6%),部分转基因小麦品系已进行环境释放及生产性试验。本文综述了小麦转基因技术的发展和应用现状,讨论了小麦转基因研究存在的主要问题和今后的发展方向。
王际睿[7]2008年在《小麦种子蛋白及赤霉病抗性相关基因的分子鉴定》文中认为依据功能不同可将种子蛋白划分为贮藏功能的谷醇溶蛋白和维持正常代谢功能的非醇溶性蛋白两类。高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)属于种子醇溶性蛋白,优质HMW-GS可明显改善小麦加工品质。小麦近缘属种中广泛存在的HMW-GS等位变异基因可能成为小麦品质改良的重要基因资源。麦类作物种子中还富含属于种子非醇溶性蛋白中清蛋白的α-淀粉酶抑制因子(AAI),能有效抑制内源或外源α-淀粉酶活性,控制种子穗发芽、抑制昆虫繁殖。赤霉病是小麦主要病害之一,易感染开花期的小穗和发育早期的籽粒。赤霉菌会扰乱种子贮藏蛋白的合成或者消耗种子中的蛋白、糖来供自己繁殖,从而破坏发育中的籽粒。本文对小麦种子蛋白HMW-GS、AAI进行了基因克隆、与进化分析,并对抗赤霉菌材料的基因表达谱进行了分子鉴定,主要结果如下:1.从二倍体长穗偃麦草中分离并鉴定了4个新型HMW-GS编码基因,分别编码x-型亚基(Ee2.1、Ee1.9)与y-型亚基(Ee1.8、Ee1.5)。其中,Ee2.1和Ee1.5各存在1个与普通小麦HMW-GS相比特殊的Cys,推测这两个亚基在小麦品质育种中具有潜在利用价值。对小麦族不同物种HMW-GS的N-端序列进行比对分析发现,x-型和y-型HMW-GS均具有很高的同源性,但y-型HMW-GS变异程度比x-型亚基小。依据是否存在15bp或24bp的碱基插入将x-型HMW-GS及其编码基因划分为3种类型。系统进化分析表明,HMW-GS编码基因在漫长的基因复制过程中相对独立,且一直保持着其生物学功能。来自普通小麦A、B、D基因组的HMW-GS存在明显差异,具有染色体组特异性。2.从普通小麦及近缘物种中克隆获得与昆虫抗性有关的635个二聚α-淀粉酶抑制因子编码基因(WDAI),377个单聚α-淀粉酶抑制因子(WMAI)和20个四聚α-淀粉酶抑制因子(WTAI)编码基因序列。对α-淀粉酶抑制因子序列与功能分析,探讨了该家族成员间的理化、功能(如等电点、迁移率、对蛋白酶的抑制范围和活性)差异的分子基础。建立了一种利用序列中SNP位点开发出特异标记引物将功能基因定位于普通六倍体小麦具体基因组的方法,由此将来自普通小麦的WDAI基因定位在3BS和3DS上。虽然从A基因组一粒系小麦中得到了WDAI、WMAI编码基因序列,但分子证据揭示普通小麦A基因组不含有WDAI编码基因,而是否含有WMAI编码基因则需要进一步研究。依据序列特征,推测小麦及其近缘物种中WDAI源于共同的祖先基因,而小麦及山羊草的WMAI也可能由一共同的祖先基因通过复制与突变进化而来,但是WMAI相似性明显比WDAI高,变异程度更低。3.依据序列分析发现二倍体一粒系小麦由于碱基插入导致无α-淀粉酶抑制因子活性的分子基础。一粒系小麦中WDAI编码基因差异与基因组来源有关,与地理来源关系不明显。A~m基因组的WDAI基因与A~u基因组的基因相比进化速率更慢、变异程度更低。依据普通小麦B基因组和拟斯卑尔托山羊草组S(S、S~l、S~s、S~(sh)和S~b)基因组159个WDAI基因序列中SNP位点差异,共发现59种呈“星”形分布的单倍型,并可归为5个主要的单倍型组。普通小麦和野生二粒小麦B基因组上的WDAI基因与来自拟斯卑尔脱山羊草S基因组上的WDAI基因最相似,但是推测多个拟斯卑尔托山羊草组物种可能通过种间杂交时的基因渐渗参与了多倍体小麦B基因组WDAI基因位点的形成。小麦族11个属20个基因组的WDAI基因的分子系统进化分析表明,WDAI编码基因差异与基因组系统进化有关,且在基因组分化以前该位点就已经存在。这些结果为深入了解WDAI基因位点上基因重组、整合事件及发生过程提供了重要信息,有助于加深对WDAI功能的了解。4.对以色列野生二粒小麦α-淀粉酶抑制因子基因的遗传结构、分化程度及其与生态因子间的关系进行了系统研究。WMAI序列所包含遗传信息较低;WTAI序列同样非常一致。无论是在居群内还是居群间,野生二粒小麦WDAI基因位点都存在变异,居群间遗传距离与地理来源关系密切。野生二粒小麦WDAI基因序列ω值(Ka/Ks)大于1,表明该基因位点为正选择位点,存在明显的选择压力导致WDAI基因序列产生多样性及遗传和功能差异。WDAI编码基因中SNP标记所揭示的16个居群遗传多样性指数(P)、Nei's基因多样性(He)和Shannon指数(I)分别为0.887、0.404和0.589。SNP服从于自然选择,生态因子单独或联合作用导致WDAI基因序列中SNP位点的多样性,特别是几个水分因子对SNP位点有极显着影响,推测水分作为主要选择压力通过影响昆虫数量间接影响α-淀粉酶抑制因子遗传结构变异、分化程度。5.获得与过敏性哮喘相关的小麦种子潜在变应原编码基因。利用生物信息学手段对小麦种子蛋白质变应原与公认主要变应原α-淀粉酶抑制因子进行了比较,并预测编码蛋白质高级结构。由于过敏哮喘与由IgE介导的超敏反应有关,推测这些蛋白质具有能与IgE结合相似的结构域。6.对一套中国春-长穗偃麦草附加系、代换系、端体异附加系材料的赤霉病抗性进行了评价,发现7E附加系(CS-7E)和7ES端体异附加系(CS-YES)抗性最强,推测7E染色体上存在潜在的赤霉病抗性基因或能诱导/抑制普通小麦CS上抗性/易感基因表达的调控基因。利用基因芯片对CS、CS-7E、CS-7ES在赤霉菌诱导0-96小时后的表达谱进行了分析,初步筛选出70个赤霉病菌诱导差异表达的抗性相关基因;生物信息学比对和功能注解发现,候选基因所编码蛋白质或是属于某些特定的生理生化代谢途径关键酶、或是已知功能真菌诱导抗性应答蛋白、或与生物或非生物胁迫应答有关。利用实时定量PCR对16个候选基因的表达水平进行了验证,与芯片数据相比基因表达水平变化的方向(上调或下调)一致,但Q-PCR所检测到的差异要大于芯片所显示的表达差异。
吴金华[8]2008年在《小麦—黑麦抗白粉病衍生系遗传分析及其相关基因差异表达与克隆》文中认为小麦是世界上栽培面积最广且最重要的粮食作物之一,小麦产量的丰歉直接关系着世界粮食的供给。但小麦每年因病害减产约10 %～50 % ,尤其是白粉病对小麦的危害更为严重。小麦白粉病(Blumeria graminis f. sp. tritici)是目前危害我国小麦生产的主要病害之一。白粉病原菌的生理小种多,毒性变异速度快,很容易造成品种抗病性的丧失。因此,发掘、利用抗病品种,研究抗病机制是当前需要亟待解决的问题。本研究以小麦-黑麦抗白粉病衍生系为试验材料,对其白粉病抗性的遗传特性进行了分析,并通过抑制性消减杂交cDNA文库的构建和测序分析,对其抗白粉病相关基因的差异表达进行了研究,对部分基因进行了克隆。结果如下:1以小麦-黑麦衍生系N9436-1和N9436-2为材料,采用农艺性状调查、白粉病抗性鉴定、细胞学方法、基因组原位杂交、生化标记及分子标记等方法对其进行了遗传分析。结果表明,N9436-1为小麦-黑麦1R二体异附加系,对白粉病高抗至免疫且多小穗;N9436-2为小麦-黑麦6R二体异附加系,紫杆且高抗白粉病。2以抗白粉病小麦种质N9436-1为材料,利用抑制性消减杂交技术构建了白粉菌接种72h的正反交文库。正反交文库分别挑取了550个克隆进行菌液PCR鉴定,接着随机挑取鉴定为阳性的克隆进行测序。3正交文库随机挑取140个阳性克隆进行测序,去除冗余重复序列及小于100bp的序列外,递交GenBank数据库。GenBank收录号为EX567357—EX567450,dbEST-Id为50073321—50073414。对所获94个EST在NCBI的非冗余蛋白数据库进行BlastX比对,结果表明,49个EST与已知功能蛋白同源性较高,主要涉及初级代谢(2%)、能量代谢(24%)、细胞结构(2%)、转录(2%)、蛋白质合成加工与储藏(16%)、转运(4%)、信号转导(4%)及抗病防御(30%),此外,未知功能的EST占16%。经文库比对,得到白粉病抗病相关蛋白22个,其中与抗病信号转导相关蛋白6个,过敏性坏死反应(HR)体系表达蛋白2个,系统获得性抗性(SAR)体系病程相关蛋白4个,系统获得性抗性(SAR)体系诱导防卫蛋白10个。4反交文库中随机挑取120个阳性克隆进行测序,去除冗余序列和重复序列以及小于100 bp的序列后,将获得的的59个非重复序列递交GenBank。GenBank收录号为EX567298—EX567356,dbEST-Id为50073262—50073320。对所获59个EST在NCBI的非冗余蛋白数据库进行BlastX比对,结果表明,23个EST与已知功能蛋白同源性较高,主要涉及初级代谢(9%)、能量代谢(44%)、转录(4%)、转运(9%)、信号转导(4%)及抗病防御(26%),此外,未知功能的EST占4%。经文库比对,得到白粉病抗病相关蛋白7个,其中与抗病信号转导相关蛋白1个,系统获得性抗性(SAR)体系病程相关蛋白5个,系统获得性抗性(SAR)体系诱导防卫蛋白1个。5采用半定量RT-PCR方法,对文库中的部分EST进行验证。验证结果表明病程相关蛋白(Z25-1)、谷胱甘肽硫转移酶(Z440-1)、过氧化物酶(Z208)、细胞色素P450(Z219-1)、胁迫响应性蛋白(F76)、磷酸核酮糖激酶(F105)、乙二醛酶(F110-1)、羟基丙酮酸还原酶(F167)都属于白粉菌诱导型相关基因,参与抗白粉病反应中。其中病程相关蛋白、谷胱甘肽硫转移酶、过氧化物酶和磷酸核酮糖激酶属于白粉菌诱导后的上调基因,而细胞色素P450和乙二醛酶属于下调基因。6应用电子克隆技术对文库中5个EST进行延伸,然后根据序列设计引物进行RT-PCR验证。目的片段回收后测序结果分析表明,谷胱甘肽硫转移酶序列长度为875bp,有编码229个氨基酸的开放阅读框。将得到的氨基酸序列首先通过blastp分析蛋白质结构域,结果表明含有一个N端和C端谷胱甘肽硫转移酶结构域。接着利用InterProScan进行预测,发现该序列具有谷胱甘肽硫转移酶N端和C端结构域以及硫氧还蛋白折迭区结构域和谷胱甘肽硫转移酶超家族结构域。以上结果表明克隆得到一个编码谷胱甘肽硫转移酶的基因片段。利用SubLoc v1.0将该基因片段定位在细胞核上。Compute pI/Mw tool软件推测该蛋白的等电点为4.97,分子量为71910.41Da。
闻捷[9]2006年在《离子束辅助遗传转化小麦后代雄性不育现象研究》文中进行了进一步梳理本文以离子束辅助遗传转化小麦后代中出现的雄性不育变异株为材料首次进行研究，主要围绕不育性质的鉴定、不育的特性研究及不育性在小麦育种上的应用途径探索3个方面开展工作。主要研究结果如下： 1、不育性质的鉴定从不育的遗传性、不育程度和不育类型鉴定叁个方面来研究。结果表明：这种雄性不育变异是属于可遗传的部分不育；不育类型是显性单基因控制的小麦核不育类型。 2、不育性与农艺性状相关，田间容易区分和辨别。通过对不育株系内不育株和可育株的株高，穗数和穗长3个农艺性状的研究发现，两者的株高和穗数2个性状差异极显着，穗长差异不明显。与可育株相比，不育株的株高平均降低15.34cm，穗数平均减少2.50个。不育低株和可育高株的蛋白质含量的差异达到了极显着水平，低株的蛋白质含量高于高株的蛋白质的含量，且随着世代的增加，差距有增大的趋势。对于蛋白品质，两者均可以用回归方程来预测，但是不育低株的预测真实度要高于相应的可育高株。控制株高变异的基因属于显性矮变单基因。幼苗发芽试验表明：不育株的苗高、生长势及根部生活力都与可育株差异极显着。利用不育性与株高矮变及高蛋白性状高度相关的特征，可以在苗期较早的预测育性、蛋白品质，或者由后期的品质育性特点来推测株高，从而为下一步的工作的开展提供指导。 3、在不育性与蛋白质品质的相关关系研究过程中：首先通过对不育株连续叁代的蛋白品质追踪调查，研究分析了每个世代不育株蛋白质品质表现及他们的遗传表现得出如下主要结论：不育株的蛋白品质既继承了原来转基因后代的高蛋白特点，又表现出不育性与高蛋白性状是高度相关的新的遗传特点，并且随着不育世代增加，不育株的高蛋白性状表现越来越稳定，这种遗传相关性可以运用多项式回归来预测。 4、利用酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳(A-PAGE)和十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的方法对不育株的醇溶蛋白和麦谷蛋白进行分析，从蛋白质水平上进一步验证了不育性与蛋白品质的高度相关关系。研究结果表明：从醇溶蛋白电泳图谱上可以发现：不育株在γ、ω区与可育株有较大的差异。在γ区，
叶兴国, 马有志[10]1999年在《小麦基因工程育种的回顾和展望》文中研究说明１ 小麦分子育种的国内外进展１．１ 小麦遗传转化自１９８３年Ｚａｍｂｒｙｓｋｉ获得世界上第一例转基因植株，１９８５年Ｈｏｒｃｈ首创叶盘法以来，分别建立了农杆菌介导法、ＰＥＧ介导法、电激穿孔法、病毒介导法、显微注射法、花粉管通道法、超声波法、基因枪法等，转
参考文献：
[1]. 葡聚糖酶基因、高分子量谷蛋白优质亚基基因转化小麦的研究[D]. 王广金. 东北农业大学. 2002
[2]. 小麦遗传转化体系建立及高分子量麦谷蛋白14亚基基因的转化[D]. 刘香利. 西北农林科技大学. 2009
[3]. 小麦无标记转基因体系建立和HMW-GS基因的转化[D]. 刘会云. 中国农业科学院. 2017
[4]. 小麦不同外植体农杆菌转化体系研究[D]. 王艳丽. 中国农业科学院. 2006
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[6]. 小麦转基因技术研究及其应用[J]. 喻修道, 徐兆师, 陈明, 李连城, 马有志. 中国农业科学. 2010
[7]. 小麦种子蛋白及赤霉病抗性相关基因的分子鉴定[D]. 王际睿. 四川农业大学. 2008
[8]. 小麦—黑麦抗白粉病衍生系遗传分析及其相关基因差异表达与克隆[D]. 吴金华. 西北农林科技大学. 2008
[9]. 离子束辅助遗传转化小麦后代雄性不育现象研究[D]. 闻捷. 郑州大学. 2006
[10]. 小麦基因工程育种的回顾和展望[J]. 叶兴国, 马有志. 作物杂志. 1999
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