乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，我国女性乳腺癌的发病率与死亡率正逐年增加，严重威胁着妇女的健康。早期诊断和早期治疗是防治乳腺癌和降低死亡率的最有效的办法。目前应用于临床诊断乳腺癌的肿瘤标志物主要有癌胚抗原（CEA）和糖类抗原153（CA153）等，但这些肿瘤标志物在乳腺癌的早期中效能较差[1]，难以满足早期诊断的需求。微小RNA（microRNA，miRNA）是一类长度约18-25bp的内源性非编码小分子RNA。研究发现在乳腺癌与正常人中存在着差异表达的miRNA，这些差异表达的miRNA在乳腺癌的早期诊断中有较高效能[1]。miR-503为miRNA家族中的一员，不少研究报道miR-503在不同细胞及组织中的差异表达。本研究的主要目的是通过应用实时定量RT-PCR检测乳腺癌患者血浆与正常人群血浆中miR-503的表达水平，分析miRNA-503在乳腺癌患者血浆中的表达水平与正常人的差异，为miR-503有希望作为乳腺癌辅助诊断的分子标志物提供实验依据。1 材料与方法1.1研究对象选择宁波市妇女儿童医院乳腺癌住院患者20例（女性，年龄51.18±5.37岁）和15例健康体检者（女性，年龄50.13±4.77岁）作为研究对象（两组研究对象年龄差异无统计学意义（P>0.05）。所有患者均经宁波市临床病理诊断中心确诊。收集各研究对象的外周静脉血3ml至EDTA抗凝试管，3000转/分离心10分钟，取上层血浆于1.5mlEP管。所有血浆标本放于-20°C冰箱冻存待测。1.2 主要试剂及仪器RNA提取试剂为美国Ambion产品Trizol LS reagent；逆转录试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒、U6及miR-300特异RT及PCR引物均购于宝生物工程有限公司（大连TAKARA公司）。实时定量PCR仪为美国Stratagene的 MX3005P PCR自动系列化分析仪。1.3 方法1.3.1血浆总RNA提取及含量测定 使用抽提RNA试剂Trizol LS reagent抽提各样本血浆总RNA，具体操作按照说明书进行。抽提的RNA溶解于10 μl DEPC水中。使用分光光度计测定提取的RNA样品260 nm和280 nm的吸收值，分析RNA的纯度。OD260 / OD280在1.8~2.0时RNA纯度较高。计算提取的RNA含量。1.3.2逆转录反应及实时荧光定量PCR检测miRNA-503的水平使用逆转录试剂盒将总RNA逆转录为cDNA，按厂家说明书进行操作。以逆转录的cDNA为模板，用荧光定量PCR技术检测miRNA-503的表达水平。每一样品设3个复孔，取其平均值，以U6为内参，分别扩增miRNA和U6小RNA，用Mx5035P QPCR System进行反应。Ct值为扩增产物达到临界阈值时所对应的循环数。ΔCt= Ct miRNA - Ct U6；ΔΔCt= ΔCt实验组 - ΔCt对照组。以2-△Ct表示miR-503的相对表达水平，最后以2-△△Ct表示实验组miR-503的表达水平相对于对照组的差异倍数。1.3.3统计分析数据采用SPSS 22.0统计软件分析，数据用平均数±标准差（mean ± SD）表示，样本均数比较采用独立样本t检验，实验至少重复3次，P < 0.05认为有统计学意义。2 结果统计20例乳腺癌患者2-△Ct结果显示，20例乳腺癌患者血浆中miR-503的相对表达水平为0.075±0.05，同样方法得出对照组血浆中miR-503的相对表达水平为0.272±0.12，与正常人相比，乳腺癌患者血浆中miR-503的表达水平明显下调，差异有统计学意义(P=0.001)。通过2-△△Ct得出20例乳腺癌患者血浆中miR-503的表达水平相对于对照组的0.244，即对照组的miR-503的表达水平为实验组的4.10倍。若以对照组血浆中miR-503的相对表达水平的均数0.272为正常人血浆miR-503的标准表达水平，20例乳腺癌中有19例乳腺癌患者血浆中的miR-503表达水平不到正常人的1/2。具体结果见图1。
图1 乳腺癌患者血浆中miR-503表达水平与正常对照组的比较3 讨论miRNA是人体内广泛存在的非编码小分子RNA，与人类肿瘤的发生、发展以及侵袭转移等密切相关，在人类肿瘤的发生和发展、侵袭转移等扮演着重要角色。miRNA与乳腺癌的发生发展、侵袭转移有关，另外miRNA在乳腺癌的诊断和预后判断等方面的作用也受到研究者的关注[2]。miR-503为miRNA家族中的一员，可通过不同作用机制在多种癌症如肺癌、乳腺癌、结直肠癌、胃癌、肝癌、前列腺癌等的发生发展、侵袭、转移及治疗等方面发挥着重要的作用。已有研究表明miR-503在不同癌组织中有异常表达，与正常的癌旁组织及正常细胞相比，miR-503在许多癌组织及癌细胞中表达水平明显下降，如肺癌[3]、胃癌[4]等。但也有研究发现与癌旁正常组织相比miR-503在癌组织中的表达水平明显升高,如研究者发现miR-503在食管鳞癌[5]中表达上调，发挥促癌作用。由此可见miR-503在不同癌组织及癌细胞中存在着表达水平的差异，这提示miR-503可能参与许多癌症的发生和发展，在癌症的发生发展过程中可能发挥抑癌或促癌作用。本研究发现miR-503在乳腺癌患者血浆中表达水平明显下调，与正常人相比，miR-503在乳腺癌血浆中的表达仅为正常人的0.244。本研究将为miR-503有希望作为乳腺癌辅助诊断的分子标志物提供了可能性。但是本研究还存在着不足，如病例标本数量不多，非大样本量的研究，实验结果是否存在一定偏差等，需扩大病例标本数量、结合患者的临床表现进行进一步的研究等。参考文献[1]姚颖，陆奎英，张敏，等.miR-10b与乳腺癌相关肿瘤标志物在早期乳腺癌中诊断效能比较.国际检验医学杂志，2020，41（3）：310-317[2]Hamam R,Hamam D,Alsaleh KA,et al. Circulating microRNAs in breast cancer: novel diagnostic and prognostic biomarkers. Cell Death Dis.2017,8(9):e3045.[3]Wei Y, Liao Y, Deng Y,et al. MicroRNA-503 Inhibits Non-Small Cell Lung Cancer Progression By Targeting PDK1/PI3K/AKT Pathway.Onco Targets Ther. 2019,12:9005-9016.[4]Li W, Li J, Mu H, et al. MiR-503suppresses cell proliferation and invasion of gastric cancer by targeting HMGA2 and inactivating WNT signaling pathway.Cancer Cell Int. 19:164.[5]Liu ZH,Chen LD,He YB,et al. Study of expression levels and clinical significance ofmiR-503and miR-375 in patients with esophageal squamous cell carcinoma. Eur Rev Med Pharmacol Sci.2019,23(9):3799-3805.基金项目：浙江省教育厅一般科研项目（编号：Y201534751）作者简介：龙香娥（1984-），女，湖南邵阳，硕士，讲师，研究方向：从事肿瘤分子生物学研究。
论文作者:龙香娥1,孙静2,周立2,郑霓亚3,唐鲁兵3
论文发表刊物:《中国保健营养》2019年第8期
论文发表时间:2020/5/7