高中生物学选修模块1中DNA相关实验的整合，本文主要内容关键词为：生物学论文,模块论文,高中论文,DNA论文，此文献不代表本站观点，内容供学术参考，文章仅供参考阅读下载。
高中生物学课程标准选修模块1涉及3个与DNA相关的实验：DNA的粗提取及鉴定，PCR和DNA电泳，这3个实验是基因工程的基础实验，可以将这3个实验看作一个有机的整体，基因工程正是通过这3个步骤获得目的片段的，掌握这3个实验的原理和步骤有利于学生对基因工程的理解。但是PCR和DNA电泳两个实验开展的难度较大，原因主要有3个方面：①学校硬件限制，PCR需要PCR仪，电泳需要电泳仪和电泳槽，这些仪器对于一般学校来说难以满足；②实验材料和试剂较贵且不易准备；③实验条件需要摸索。本研究针对后两个问题进行了探索，力求这些实验能够在高中生物学课程中顺利地开展。
一、材料与方法
1.DNA粗提取
实验材料：菜花。
将新鲜菜花于-20℃放置24h，去梗，切碎，称取10g，加入10mL研磨液（100mmol/L Tris-HCl pH 8.0，150mmol/L NaCl，100mmol/L EDTA，20％SDS），置于研钵中充分研磨。研磨液经双层纱布过滤，滤液1 000转离心5 min，取上清，加入2倍体积95％乙醇，用玻璃棒轻轻搅拌，将DNA粗提物缠绕在玻璃棒上。将DNA粗体物彻底晾干（注意：一定要使酒精彻底挥发，否则影响PCR反应），溶于500μL纯水，得到DNA粗提液。
2.PCR
引物设计：根据菜花ACO基因序，利用primer5.0软件设计引物pACOf：TTGAGAATGTTGATTGGGAAAG，pACOr：GTGCGTTATGCTCTTGTACCTTC，引物离心后溶于纯水（每OD引物加入200μL水）。按以下体系配制PCR工作液：PCR缓冲液2μL，pACOf（引物1）1μL，pACOr（引物2）1μL，菜花DNA粗提液（模板）1μL，dNTP（每种脱氧核苷三磷酸2.5mmol/L）2μL，Taq DNA聚合酶1μL加纯水将体积补充到20μL。
反应条件：预变性94℃5min，95℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸45s，以上3步重复30次，72℃延伸5min。
3.电泳
制胶：称取1g琼脂糖，加入99mL 1×TAE缓冲液，加热至溶液沸腾，从微波炉中取出冷却至60℃，倒入凝胶槽中并插入梳子。待完全冷却拔出梳子，凹陷处为点样孔。
电泳：将凝胶放入电泳槽，在电泳槽中加入1×TAE缓冲液，注意缓冲液要没过胶面，在PCR产物中加入1μL上样缓冲液，1μL荧光染料，混匀。将混合物加入点样孔，100V电泳30min。
在紫外灯下观察结果。
二、实验结果
目的片段的大小为649bp，通过电泳和紫外照片分析，PCR产物的大小在500～800bp之间（图1），结果与预期相符。
三、对教学安排及教学设计的建议
1.对教学安排的建议
这3个实验需要3～4个课时，用1课时讨论实验原理和注意事项（如果把不同实验的实验原理放在不同的实验课中讲解则用3课时，但这种方式会使3个实验的整体性降低），然后通过连续的3课时进行这3个实验，课时需要连续的原因有二：①3个实验在内容上是连续的，连续实验有利于学生理解通过PCR的方法获取目的基因的原理；②DNA粗提取实验中获取的产物中很可能含有DNA酶，DNA在这种条件下的保存时间有限，因此，后续的实验要尽快进行。
2.对教学设计的建议
因为这3个实验本身是一个有机的整体，其目的就是获取目的片段，所以进行教学设计时可以以探究如何通过PCR的方法获取已知目的基因为出发点，设置情景。这个问题的核心就是PCR，因此要从介绍PCR的原理入手，由于学生学过半保留复制的原理，所以容易理解PCR过程，但仍有3个难点：①DNA的合成只能在一段DNA后面延伸而不能从头开始，所以PCR一定要加入能够与模板结合的寡聚脱氧核苷酸作为引物；②DNA合成方向是一定的，只能从5′到3′的方向合成；③PCR中DNA分子解旋的方式是通过加热使其变性，通过退火（使温度降低至引物与模板可以结合）引物与模板DNA分子形成局部双链，通过延伸（温度升高到72℃，使DNA聚合酶活性最大）合成新链，所以变性、退火、延伸3个步骤完成一次复制，PCR循环次数相当于复制的次数。
通过对PCR的介绍可以明确PCR能够达到扩增DNA的目的，但是还不能解释为什么通过PCR能够获取目的基因。基因是有遗传效应的DNA片段，而从细胞中获取的DNA分子是以高分子量形式存在的，其分子大小可以达到几万甚至几十万个碱基对，通过基因组DNA的提取显然无法获得目的基因。而如果以基因组DNA为模板，通过PCR就可以特异性地扩增目的基因，因为引物是根据基因的碱基排列顺序人为设计并合成的，引物在退火时只能结合于模板的特定位置，而延伸的方向是5′到3′，这样在第1个循环的延伸步骤中，新合成的部分是从引物的5′端开始的一条脱氧核苷酸链（图2a，b），而当新合成的这条链在第2个循环做模板时，就会合成一条新的以上游引物5′开始到下游引物3′结束的脱氧核苷酸链（图2d，e），这条链在第3个循环作模板时合成其互补链（图2g，j），这就是目的基因，而在第3次以后的反应中，每个循环过后，目的基因的数量就会增加1倍，因此PCR使目的基因以指数形式增长。通过上述分析可以看出，PCR使2个引物之间的DNA扩增，因此，只要知道目的基因的碱基排列顺序，就可以设计并合成引物，有了引物和模板DNA分子，就可以通过PCR扩增目的基因。这里的引物是通过化学方法合成的，而模板要通过提取相应物种的DNA得到，或通过逆转录mRNA得到。
虽然PCR扩增了目的基因，但是PCR产物中并不是只有目的基因，里面还混有作为最初模板的基因组DNA，引物自身配对后扩增出的引物二聚体，以及由于引物错配后得到的产物，如果要得到目的基因，必须进一步分离，这样就涉及分离DNA的方法，其中最常用的方法就是琼脂糖凝胶电泳。DNA分子在溶液中电离，显正电，在电场中可以移动，通过琼脂糖凝胶时，移动的速度会受到分子量和分子空间构型的影响，相同的时间内，DNA分子在凝胶中的位置就会产生差异，形成不同的条带，达到分离DNA分子的目的。通过与已知分子量的Marker对比，就可以确定哪一条带是目的基因，将这一条带用手术刀切下来，就可以回收得到目的基因。
通过以上分析可以看出：通过DNA提取，PCR，电泳3个步骤就可以得到已知序列的目的基因，这就是通过PCR获取目的基因方法的基本原理。
通过对原理的讨论，一方面从实践的角度将PCR和获取目的基因2个知识点联系起来，让学生理解为什么可以通过PCR获取目的基因，另一方面，激发学生希望自己动手获取目的基因的热情，为实验做好铺垫。
四、讨论
这一部分内容从理论到实际操作都比较复杂，要不要做，做到什么程度，要视学校和学生的情况而定。但在课堂教学中应该对这3部分知识做联系，其原因有3：①PCR作为目的基因扩增的手段是容易理解的，但是为什么可以通过PCR获取目的基因，很多学生会产生疑惑，如果不解释清楚，这个知识点就变成一个死记硬背的知识点，而要解释清楚就必须把这3部分知识联系起来讨论；②很多物种的基因组测序已经完成，越来越多的基因序列已经可以在数据库中找到，在这种背景下PCR已经成为实验室重要的获取目的基因的手段，因此这部分的教学符合高中生物学课程标准中“认识生物科学和技术的性质”的目标；③近年来的高考中经常出现基因工程部分具体实验技术的问题，（如2009年福建第32题，2009年江苏第34题，2009年上海第37题，2010年福建第32题，2010年天津第7题，2010年江苏第27题），在这些问题中学生经常会因为缺乏实践经验而没有解题思路，而如果在教学中注意讨论基因工程的具体操作细节，甚至能够让学生亲自操作，那么教学效果会好很多。
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