邢伟[1]2002年在《非小细胞肺癌血管生成的MR动态增强研究》文中研究指明大量研究表明非小细胞肺癌(NSCLC)的生物学特性与肿瘤的血管生成呈密切相关。临床评价肿瘤血管生成绝大多数采用免疫组化法检测肿瘤组织微血管密度(MVD)或血管内皮生长因子(VEGF)表达的水平。其缺陷在于：有创、难以重复实施和取材范围的局限性。最近，国内外学者开始用MR动态增强对胶质瘤、宫颈癌和肝癌等的血管生成研究，但是在NSCLC血管生成方面的研究，国内外未见相关报道。 目的：探讨非小细胞肺癌的微血管密度(MVD)及其血管内皮生长因子(VEGF)与MR动态增强指标间的关系。 材料与方法：对平片或CT首次发现的肺内肿块随机进行MR动态增强检查，将其中36例经手术证实为NSCLC的病例作为本课题的研究对象，并对肿瘤标本进行免疫组化检测；分析肿块边缘和中央的强化斜率(Srim、Scen)、到达峰值的时间(TPrim、TPcen)以及最大强化幅度(Asi)分别与肿瘤的免疫组化结果(MVD、VEGF)进行各自的相关性统计分析。 结果：①肿瘤的Slope与MVD和VEGF之间呈显着正相关，(r分别为Srim：0.629，0.733；Scen：0.615，0.723，P＜0.001)；TP与MVD和VEGF之间的呈显着的负相关(r分别为TPrim：-0.554，-0.601；TPcen：-0.478，-0.538，P＜0.001)；Asi与MVD和VEGF之间无显着相关性(r分别为0.087，0.196，P＞0.05)。②Slope和TP值在反映肿瘤血管生成时，边缘优于中央， 非小细胞肺癌血否生成的MR动态槽强研究 中文箔要 两者之间 有明显的统计学差异（Seenl．4肚0．56．S而1．73土0＊9．卜2二98． P＝0＊引＜0＊5；TPCC 217＊肚 47．575，TPim 19H34．765，t＝2．546， P＝0．of 3功．05）；③按病理类型分析，腺癌的Sriln和h 高于鳞癌，而 TPrim和 hcen则低于鳞癌，它们间均有明显的统计学差异p划刀 1和 叼刀5）；腺癌的Mp和VE GF阳性数均高于鳞癌（MVD腺癌：50．19纠．59， 鳞癌33．16土5石5，P＜0．001（tr．34）；VE GF的阳性率：腺癌13／8，鳞癌 4n，P＜0＊5）；WGF＊性肺癌的MV’D显着大于阴性（so．0牡9．15， 34．41士5．24；ie 5．803，P＜0＊01）。 结论：Alll动态增强的相关指标，可以反映NSCLC的MVD和VEGF 表达的高低，从而推测其血管生成状况；其中Sriln、TPrAn为最佳指标。
邢伟, 胡春洪, 张晓膺, 郭亮, 谢道海[2]2003年在《非小细胞肺癌MR动态增强表现与肿瘤血管生成的相关性》文中研究指明目的 探讨非小细胞肺癌 (NSCLC)的微血管密度 (MVD)及其血管内皮生长因子 (VEGF)与MR动态增强指标间的关系。资料与方法 以 3 3例经手术证实为NSCLC的病例作为研究对象 ,分析肿块的最大强化斜率 (Smax)和峰值到达时间 (TTP)。组织切片经CD3 4和VEGF免疫组织化学染色 ,分析MVD和VEGF表达的阳性率。将Smax和TTP分别与肿瘤的病理类型以及免疫组织化学结果 (MVD、VEGF)进行各自的比较。结果 ( 1 )肺癌的Smax与MVD和VEGF之间呈显着正相关 (r分别为 0 .6 1 5 ,0 .72 3 ,P <0 .0 0 1 ) ;( 2 )TTP与MVD和VEGF之间呈显着的负相关(r分别为 - 0 .4 78和 - 0 .5 3 8,P <0 .0 1和 0 .0 0 1 )。结论 MR动态增强指标Smax和TTP能够反映NSCLC的MVD和VEGF表达的高低 ,从而推测其血管生成状况。
孙昌进[3]2005年在《多层CT首过时间动态增强对肺周围型占位病变的定量研究：与延迟动态增强模式对照》文中认为目的 利用16层螺旋CT首过时间动态增强技术定量评价不同性质肺孤立结节(SPNs)的血流模式,评价不同性质肺孤立结节、周围型非小细胞肺癌微血管密度(micro-vessel density,MVD)与各动态定量参数的相关性,探讨各首过时间定量参数在肺部结节良恶性鉴别诊断中的临床价值。初步评价首过时间动态增强CT各动态定量参数与周围型非小细胞肺癌病理学参数的关系,进一步探讨各首过时间定量参数在非小细胞肺癌N分期、TNM分期中的价值。并与延迟动态增强CT对照。材料和方法 对75例肺孤立结节、32例周围型非小细胞肺癌患者同时行首过时间动态增强CT与延迟动态增强CT扫描(以7ml/s的流率注入对比剂)。进行图像质量评价后,有61例肺孤立结节、32例周围型非小细胞肺癌进入下一步研究。使用siemens dynamic evaluation软件进行图像处理。记录并计算肺孤立结节时间平扫CT值,首过、延迟峰值时间(time to peak TP),强化峰值(PH),最大增强线性斜率(the slope of enhancement,SE),结节—主动脉最大强化值(S/A)比值或肿瘤—主动脉最大强化值(T/A)比值及时间—密度曲线(time-density curve T-DC)分型。其中40例良恶性结节、32例周围型非小细胞肺癌标本用免疫组化(S-P法)测定微血管密度(MVD),采用直线相关分析评价以上两种动态扫描参数(PH值、SE
邢伟, 胡春洪, 张晓膺, 郭亮, 丁乙[4]2003年在《非小细胞肺癌肿瘤血管生成与动态增强MRI表现的相关性》文中进行了进一步梳理目的 探讨非小细胞肺癌的微血管密度 (MVD)及其血管内皮生长因子 (VEGF)与MR动态增强指标间的关系。方法 3 3例经病理证实的NSCLC ,分析其MR动态增强的最大强化斜率 (Smax)和峰值到达时间 (TTP)。将Smax和TTP分别与肿瘤的病理类型以及免疫组化结果 (MVD、VEGF)进行相互比较。结果 (1)腺癌的Smax高于鳞癌 ,而TTP则低于鳞癌 ,它们间均有明显的统计学差异(Smax :t=3 .2 2 ,Ρ <0 .0 1和TTP :Z =-2 .795 ,Ρ <0 .0 5 ) ;(2 )腺癌的MVD和VEGF阳性数均高于鳞癌 ,它们之间的差异有统计学意义(MVD :t=6.3 4,P <0 .0 0 1;VEGF :Ρ =0 .0 15 <0 .0 5 )。结论 MR动态增强的Smax和TTP ,可以反映NSCLC的MVD和VEGF表达的高低 ,从而推测其肿瘤血管的生成状况
孙江涛[5]2006年在《非小细胞肺癌中VEGF、VEGF-C、CA-Ⅸ基因表达及其与动态增强CT首过时间峰值和临床病理特征相关性的研究》文中指出背景和目的 肺癌是发病率和死亡率增长最快的恶性肿瘤，是胸部影像学研究的重点，传统影像学主要根据肺癌的形态学特征进行诊断。随着现代细胞生物学、分子生物学和功能影像技术的迅速发展，以及分子生物学与影像学的相互结合，形态与功能相结合的影像技术为肺癌的研究提供了新方法。已有的研究表明，肺癌的侵袭、转移与肿瘤血管形成、淋巴管生长因子及乏氧代谢密切相关。近年来，应用灌注CT扫描观察肿瘤的血供情况，以及与转移相关基因的相关性已成研究的热点。本研究通过CT灌注成像技术，探讨良恶性肺部病变血流灌注首过时间峰值(PH)的差别，应用免疫组织化学方法检测肺标本中MVD、VEGF、VEGF-C、CA-Ⅸ的表达水平，探讨其与临床病理特征和首过时间峰值(PH)相关性。 材料与方法 对32例非小细胞肺癌，25例良性病变进行灌注CT扫描，以7ml／S的速度注入对比剂，使用Siemens dynamin evalution软件进行
邢伟, 张晓膺, 孙益芳, 俞逵仑[6]2005年在《动态增强MRI在评价非小细胞肺癌血管生成中的临床价值》文中研究指明目的探讨非小细胞肺癌(NSCLC)血管内皮生长因子(VEGF)的表达水平与动态增强MRI指标间的关系,从影像学角度评价肿瘤血管生成在NSCLC的诊断及淋巴结转移中的价值。方法分析33例NSCLC患者的动态增强MRI资料,测量病灶的最大强化斜率(Smax)及峰值到达时间(TTP),手术标本用免疫组化染色检测其VEGF表达水平。对病灶Smax、TTP值、VEGF表达水平及淋巴结转移情况进行统计学分析。结果33例NSCLC患者Smax及TTP值分别为(1.40±0.50)和(143.00±35.50)s;其中早期患者Smax和TTP分别为(1.21±0.30)和(187.50±28.96)s,中晚期患者为(1.97±0.70)和(96.00±16.12)s,(P<0.01和P<0.05);有淋巴结转移组Smax和TTP值分别为(2.14±0.69)和(90.5±22.55)s,无淋巴结转移组则为(1.26±0.33)和(198.08±26.88)s,(P<0.01)。VEGF阳性表达者22例,中晚期患者的阳性表达高于早期(P<0.01),淋巴结转移组高于非淋巴结转移组(P<0.01);NSCLC患者Smax与VEGF阳性表达呈明显的正相关(r=0.723,P<0.01),而TTP值与它们呈负相关(r=-0.538,P<0.01)。结论动态增强MRI有关指标能够反映NSCLC的肿瘤血管生成,并与淋巴结转移情况密切相关,有助于NSCLC的诊断及分期,并且可以从肿瘤生物学行为方面补充恶性肿瘤国际临床病期分类(TNM)不足。
崔磊[7]2016年在《磁共振扩散加权成像联合CT灌注成像预测非小细胞肺癌放化疗疗效的临床研究》文中研究表明第一部分自由呼吸、呼吸门控和屏气叁种方法所测肺癌表观扩散系数的一致性研究目的:探讨自由呼吸、呼吸门控和屏气叁种成像方法所得肺癌表观扩散系数(ADC)在观察者内和观察者间一致性。方法:利用Siemens 3.0T MR仪对22例肺癌患者行自由呼吸、呼吸门控和屏气叁种方法的DWI,两位观察者独立测量病灶的ADC值二次。采用单因素方差分析(ANOVA法)比较各种成像方法所得肺癌ADC值差异,并评估叁种方法的观察者内和观察者间一致性。数据分析采用组间相关系数(ICC)、个体间变异系数(WCV)以及Bland-Altman图。结果:观察者1测量屏气、呼吸门控和自由呼吸叁种成像方法ADC值为(1.289±0.320)×10-3mm2/s、(1.292±0.270)×10-3mm2/s和(1.365±0.299)×10-3mm2/s,观察者2依次为(1.280±0.256)×10-3mm2/s、(1.300±0.271)×10-3mm2/s和(1.357±0.292)×10-3mm2/s。不同成像方法所得ADC值无统计学差异(观察者1:F值=0.909,P=0.406;观察者2:F值=0.945,P=0.391)。叁种成像方法观察者内和观察者间均具有很好的一致性(ICC:0.913~0.998,WCV:3.4%~5.7%)。结论:自由呼吸、呼吸门控和屏气叁种方法所测肺癌ADC值在观察者间和观察者内具有很好的一致性。第二部分肺癌CT和MRI长径测量的一致性研究目的:研究周围型肺癌及中央型肺癌进行MRI常规序列(T1WI、T2WI、DWI)和CT的形态学测量之间的一致性,为两者交替使用评估肺癌疗效提供参考标准。方法:53例肺癌患者,使用西门子公司16层MSCT和64层MSCT扫描仪、3.0T Verio MR仪扫描,得到各横断面图像,按照RECIST1.1标准对各图像进行测量,包括CT平扫肺窗、CT增强纵隔窗(动脉期)、MRI轴位T1-VIBE、T2-BLADE和DWIb0、DWIb300、DWIb800肺癌的最大长径。所得长径采用组内相关系数进行一致性分析,使用Bland-Altman图评估测值点分布情况,配对样本t检验或非参数秩和检验比较CT、MRI所得肺癌长径的差异性,P<0.05认为有统计学意义。结果:33例周围型肺癌和20例中央型肺癌,无论是平扫肺窗还是增强纵隔窗,CT所得肺癌的长径与MRI常规序列(T1-VIBE、T2-BLADE、DWIb0、DWIb300、DWIb800)所得长径的一致性均较好(ICC>0.75)。对于周围型肺癌,CT平扫肺窗或增强纵隔窗所得肿瘤长径与MRI各序列(T1-VIBE、T2-BLADE、DWIb0、DWIb300、DWIb800)所得长径均没有统计学差异。而对于中央型肺癌,CT增强纵隔窗所得肿瘤长径与MRI各序列(T1-VIBE、T2-BLADE、DWIb0、DWIb300、DWIb800)所得长径均有差异,而T1-VIBE、T2-BLADE序列所得肿瘤长径与DWI(b=0、300 s/mm2、800 s/mm2)序列所得肿瘤长径无统计学差异。结论:对于周围型肺癌,CT与MRI常规序列(T1WI、T2WI、DWI)在形态学测量上有较好的一致性,可以互相取代;而中央型肺癌CT增强与MRI常规序列(T1WI、T2WI、DWI)存在差异,在交替使用评估肺癌疗效时需引起重视;DWI肺癌长径测量与T1WI、T2WI一致性较好,提示DWI不仅能提供功能学信息还能提供较为可靠的形态学信息。第叁部分非小细胞型肺癌CT灌注参数与表观扩散系数相关性的研究目的:探讨非小细胞型肺癌CT灌注参数与ADC值的相关性,为CTP与DWI在疗效评估方面是否可以作为技术的补充提供依据。方法:自2012年2月~2014年8月间在本院行CTP与DWI检查的肺恶性肿瘤患者共纳入23例(23个病灶)。CTP扫描采用64排CT扫描仪,对比剂注入6秒后开始扫描,扫描时间45s。重建层厚4×7.2mm,矩阵512×512,z轴覆盖范围2.88cm。采用高压注射器经肘静脉团注优维显(370mg I/ml)50ml,注射速率一般为5.0~6.0ml/s。通过工作站(MMWP,Siemens)自动生成MIP及一系列灌注伪彩图,包括血流量(BF)图、血容量(BV)图、Patlak血容量(PBV)图、起始时间(TTS)图、达峰时间(TTP)图、表面通透性(PMB)图、平均通过时间(MTT)图等。找到肿瘤所在层面,画取病灶固定面积法ROI和最大面积勾勒法ROI。DWI采用Siemens 3.0T Verio MR仪,采用横轴位单次激发自旋平面回波扩散加权成像,b值选择分为叁个b值(b=0、300s/mm2、800s/mm2),层厚5 mm,层间距6 mm。在后处理工作站(Syngo VE40A,Siemens)生成b=0、300s/mm2时的ADC图,b=0、800s/mm2时的ADC图以及b=300s/mm2、800s/mm2时的ADC图,ROI选择同上。对两种ROI所得的灌注参数、ADC值采用配对样本t检验或配对样本的非参数秩和检验,利用Pearson相关性分析同一ROI下CT灌注指标与不同b值所得的ADC值间的相关性,r≥0.7表示高度相关,0.4≤r<0.7表示相关性一般,r<0.4表示相关性较差。P<0.05认为有统计学意义。结果:在本研究纳入的所有灌注参数指标中,只有BF、BV与MTT会因ROI的不同而产生差异,而BV(P)、TTS、TTP以及PMB(P)与ROI的形态无关。无论是何种b值所得的ADC值,两种ROI所得的ADC值均有统计学差异,此外,同一ROI下,不同b值所得的ADC值也有差异。所有灌注参数中只有ROIf下,PMB(P)与ADC(b=0、800s/mm2)及ADC(b=300s/mm2、800s/mm2)相关性一般,呈正的直线关系(r=0.433,P=0.039;r=0.537,P=0.008),其余灌注参数与ADC值均无相关性。结论:肺癌所得CTP参数与ADC值的相关性较差,两者不能互相替代。在肺癌的相关应用中,CTP与DWI应作为技术互补,充分发挥各自的价值。第四部分磁共振扩散加权成像联合CT灌注成像对非小细胞型肺癌放化疗疗效的预测价值目的:以2年无进展生存率(PFS)和总体生存率(OS)为标准,评估CTP和DWI各参数在NSCLC放化疗疗效预测的临床价值。方法:自2012年2月~2014年8月间在本院行CTP与DWI检查的经病理确诊的非小细胞型肺癌(NSCLC)患者共23例(23个病灶)。治疗前进行CTP和DWI扫描。CTP扫描采用64排CT扫描仪,对比剂注入后6秒开始扫描,扫描时间45s。重建层厚4×7.2mm,矩阵512×512,z轴覆盖范围2.88cm。采用高压注射器经肘静脉团注优维显(370mg I/ml)50ml,注射速率一般为5.0~6.0ml/s。通过工作站(MMWP,Siemens)自动生成MIP及一系列灌注伪彩图,包括血流量(BF)图、血容量(BV)图、Patlak血容量(PBV)图、起始时间(TTS)图、达峰时间(TTP)图、表面通透性(PMB)图、平均通过时间(MTT)图等。找到肿瘤所在层面,画取病灶固定面积法ROI和最大面积勾勒法ROI。DWI采用Siemens 3.0T Verio MR仪,采用横轴位单次激发自旋平面回波扩散加权成像,b值选择分为叁个b值(b=0、300s/mm2、800s/mm2),层厚5 mm,层间距6 mm。在后处理工作站(Syngo VE40A,Siemens)生成b=0、300s/mm2时的ADC图,b=0、800s/mm2时的ADC图以及b=300s/mm2、800s/mm2时的ADC图,ROI选择同上。标准方案进行同步放化疗,疗效评估按照RECIST 1.1标准,计算总生存时间(OS)和无进展生存时间(PFS)。使用Kaplan–Meier分析并绘制PFS和OS生存曲线,使用log-rank检验比较不同因素生存曲线的差异,并确定最佳阈值。使用单变量Cox回归分析2年PFS和OS生存率的各种预测因子,再使用多变量Cox回归模型找出独立预测因子。检验水准为0.05。结果:临床分期:IIB4例(17.4%),IIIA期6例(26.1%),IIIB期9例(39.1%),IV期4例(17.4%)。2年PFS和OS生存率分别为30.4%(7/23)、39.1%(9/23)。临床分期与PFS和OS生存率无显着相关(P值分别为0.223和0.112)。多变量回归分析显示对PFS和OS有独立预测价值的CTP参数为:BFm(P=0.002,HR=3.98),PMB(P)m(P=0.001,HR=4.12)。多变量回归分析显示对PFS有独立预测价值的ADC值为:ADC2m(P=0.001,HR=4.53),对OS有独立预测价值的ADC值为:ADC2m(P=0.005,HR=3.99),ADC3m(P=0.027,HR=2.44)。建立预测评分模型:凡符合BFm≥46.10 ml/100ml/min、PMB(P)m≥30.95 ml/100ml/min或ADC2m≤1.52×10-3mm2/s记为0分,否则记为1分,每个病例最高为3分,最低为0分。总共分为3组:0/1分组、2分组、3分组的中位PFS分别为26、17、11月,中位OS分别为29、21、12月,2年PFS生存率分别为71.4%、18.2%、0.0%,2年OS生存率分别为85.7%、27.8%、0.0%。不同分组存在统计学差异(P<0.001)。结论:临床分期对预测NSCLC放化疗疗效价值有限。CTP参数BF、PMB(P)和ADC值(b=0,800 s/mm2)对PFS和OS有独立预测价值,以之为基础的评分预测模型有更高的疗效预测价值。
蔡春玉[8]2012年在《RGD环肽修饰的多西紫杉醇靶向聚合物胶束抗人非小细胞肺癌作用研究》文中提出恶性肿瘤高居人类致死原因的第一位,据世界卫生组织(WHO)统计,死亡人数每年平均710万人,而新发恶性肿瘤病例高达870万,而且这一趋势仍然不断上升。其中肺癌是城市人口中最主要的致死原因,发病率和死亡率呈逐年上升的趋势。临床上非小细胞肺癌占肺癌患者的87%,因早期缺乏症状,70%肺癌患者发现时已经晚期,失去了手术机会,因此化疗是重要治疗手段之一,5年生存率不到15%。多西紫杉醇是从欧洲水杉中的半合成物中提取出来,是非小细胞肺癌中常用的化学治疗制剂。多西紫杉醇在分子水平上通过与细胞微管蛋白结合,诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞发挥抗肿瘤作用。但是该药存在着很多缺陷,尤其是可以引起致命的毒性和严重的副作用,如中性粒细胞减少症、过敏反应、脱发、体液潴留、神经病变等。多西紫杉醇水溶性差,需要Tween80作为溶媒进行助溶,该溶媒可以引起溶血和过敏反应。为了改善多西紫杉醇的肿瘤特异性治疗作用并减少其对正常组织的毒性,诸如纳米粒、脂质体、胶束或树状大分子等纳米药物载体系统被广泛应用。聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺聚合物(polyethylene glycol-distearoylphosphatidyl ethanolamine conjugate, PEG-DSPE)是一种用于递送药物的纳米载体,属两亲性的聚合物胶束,具有蛋白和细胞低吸收性,无免疫原性和毒性,用于多西紫杉醇的纳米载体具有以下优点:有效改善多西紫杉醇的低溶性,避免Tween80引起的副反应;可以逃避机体内网状内皮系统非选择性清除作用;延长机体内的半衰期并通过渗透滞留增强效应(enhanced permeability and retention effect,EPR effect)选择性积累于实体肿瘤中;高稳定性适于过滤除菌并用静脉注射的方式给药。目前,多种配体或抗体修饰的新型靶向聚合物胶束被研发出来用于增强多西紫杉醇肿瘤靶向作用和效率,这些特异的“靶头”可与肿瘤细胞或肿瘤血管内皮细胞表面高表达的受体或抗原选择性高效结合,增强药物的选择性吸收和有效提高活性。整合素家族是表达于细胞表面参与细胞粘附的一组糖蛋白受体,在激活的内皮细胞、肿瘤血管内皮细胞和恶性肿瘤细胞表面呈高表达状态,包括α5β1,αvβ3,α4β1等,通过粘附作用与细胞外基质结合。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽(Arg-Gly-Asp peptide,RGD)是整合素的特异性配体,可以识别细胞表面各种类型的整合素并特异结合,被广泛用于修饰溶瘤细胞作用的病毒载体、药物递送载体、以及肿瘤治疗分子靶向药物、探针、放射性示踪剂上。由于RGD这种特异靶向整合素受体的特性,RGD修饰的药物递送系统成为目前最具开发前景的抗肿瘤靶向治疗途径。基于以上机制,本实验制备了用DSPE-PEG包被的聚合物胶束,并用RGD环肽进行表面修饰,制成具有肿瘤主动靶向作用的RGD环肽修饰的多西紫杉醇靶向聚合物胶束DT-RGD。因为双亲性聚合物胶束PEG-DSPE具有良好生物相容性和生物降解性,由其制备的DT-RGD聚合物胶束可以通过EPR效应,有效延长在机体内的循环时间,并被动靶向富集于肿瘤周围,通过被动靶向效应有效改善DT-RGD的抗肿瘤效率。RGD环肽修饰的靶向聚合物胶束DT-RGD,可以被非小细胞肺癌A549细胞表面的整合素主动识别,通过主动靶向作用,增加多西紫杉醇的吸收和有效增强细胞毒性作用。本文采用体内体外实验系统评价DT-RGD的抗非小细胞肺癌A549的作用及其可能的机制。本研究主要方法和结果:1.成膜水化法制备RGD环肽修饰的多西紫杉醇靶向聚合物胶束(DT-RGD)用环肽RGD (cRGD)与DSPE-PEG-NHS按比例混合,反应产物清水透析以去除杂质,过滤并冻干制成cRGD-PEG-DSPE。多西紫杉醇,PEG-DSPE,cRGD-PEG-DSPE按适当比例共同溶解于乙腈并于旋转蒸发仪上负压旋转蒸发,球形瓶上形成的薄膜在60℃用生理盐水进行水化,形成的聚合物胶束用0.22 μm微孔滤膜过滤去除多西紫杉醇沉淀,过滤并冻干制成DT-RGD。2. DSPE-PEG-cRGD核磁共振谱(1HNMR)分析和显微透射镜法红外检测在核磁共振谱(1H NMR)和显微镜透射镜法红外检测中能观察到cRGD和DSPE-PEG-NHS中的-NHS活性基团结合的特异性改变。δ =7.144ppm是连接聚合物胶束中的PEG和cRGD的化学位移峰,表明DSPE-PEG-NHS与cRGD发生反应形成了靶向聚合物胶束DSPE-PEG-RGD。DSPE-PEG-RGD的红外图谱反映出:3340.9cm-1处的峰是RGD特征伸缩振动峰,证明聚合物胶束中RGD肽的存在,可以证明发生了聚合反应。3.动态光散射法测定DT-RGD的粒径和zeta表征制得的聚合物胶束进行动态光散射和zeta电位分析,采用激光散射粒度分析仪Malvern Zetaszer Nano ZS (Malvern Instrument Ltd, Malvern, UK)进行粒径和多分散度测定及zeta电位。RGD环肽修饰的多西紫杉醇靶向聚合物胶束(DT-RGD)的平均粒径23.0±2.1nm,比多西紫杉醇非靶向聚合物胶束(DT-DSPE) 17.6±1.7nm略大,这可能是因为RGD环肽表面修饰的胶束,使胶束拉伸所致,zeta电位分别为-30至-35mV,说明胶束能够保持分散稳定特性。4.高效液相色谱法(HPLC)和高速离心法测定DT-RGD的载药量和包封率胶束中的多西紫杉醇总量和包封率用HPLC法进行测定,0.5mL载药胶束用叁倍体积的乙腈溶解以破坏胶束结构,其中的多西紫杉醇含量用HPLC进行测定。0.5mL载药胶束高速离心,测定上清液中多西紫杉醇含量,载药量和包封率按照公式进行计算。测得的DT-RGD的载药量和包封率分别为97. 37505%, 8.423172%。5.透射电子显微镜观察DT-RGD各取制备的空白和载药纳米胶束冻干粉分别用去离子水稀释,滴加在镀碳膜的铜网上,2%磷酸钨染液负染色,透射电镜Hitachi H-7650, 80 kV条件下,观察纳米粒的形态和大小。可见电镜下纳米粒呈均匀圆形颗粒。6.体外药物释放实验评价DT-RGD的药物释放特点DT-RGD中的多西紫杉醇体外释放实验用1mL的DT-RGD装入透析袋(MWCO 10KD)并浸入含有0. 1%的Tween80的40mL PBS中,恒温振荡。在既定时间点从PBS中取0.5mL样品,并补充相同体积的新鲜PBS。每个样品离心后,上清液中的多西紫杉醇浓度用HPLC进行测定。DT-RGD中多西紫杉醇呈缓慢持续释放特性,释放时间超过24h。7. MTT法测定DT-RGD的细胞毒性作用A549细胞用含10%FBS的RPMI1640培养液200μ L种入96孔板,培养24h贴壁生长后,换含药新鲜培养液后继续培养48h,加入1 mg/mL的MTT后再继续培养4h,小心吸取上清,加入DMSO溶解甲臜,分光光度仪570nm波长下测定吸收率,以对照组细胞吸收率为标准进行比较来测定细胞生存率,重复叁次计算平均值。MTT法测定的肿瘤细胞半抑制浓度分别为7.54±0.17μg/mL,5.2314±0.13μg/mL,4.4209±0.15μg/mL。DT-DSPE组和DT-RGD组显示了明显增强的细胞毒性作用,与单纯DT组有显着差异(p<0.01)。8. A549肺癌细胞爬片苏木素-伊红(HE)染色观察A549细胞在12孔板中培养48小时,细胞贴壁生长后,分四组A:Control (加相同体积的培养液);B:单纯DT; C:DT-DSPE; D:DT-RGD,分别加入5μM相应药物,培养48小时后用PBS洗两次,用苏木素-伊红染色,固定后在光学显微镜下观察细胞并照相。与对照组和单纯DT、DT-DSPE组相比,DT-RGD组核固缩、核分裂更明显,细胞间距离更大。9.荧光显微镜观察A549肺癌细胞凋亡用AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒处理A549细胞,荧光显微镜下观察细胞凋亡。适量A549肺癌细胞种入12孔板并培养48h,待贴壁生长后,分四组A:Control (加相同体积的培养液);B:单纯DT; C:DT-DSPE; D:DT-RGD。加入相应剂量的药物,作用48h后,用异硫氰酸荧光素(FITC) 20μL和碘化丙啶(PI) 20μL进行染色,在荧光显微镜下进行观察。DT-RGD组可以观察到更多的晚期凋亡为主的改变。10.流式细胞术检测DT-RGD诱导细胞凋亡的作用和细胞周期阻滞作用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒用来检测5μMDT-RGD,DT-DSPE和单纯DT的诱导细胞凋亡作用,A549细胞药物作用48h后,收集细胞,用各含5μLFITC和PI的500μL细胞结合液悬浮细胞,室温赋予30min后,流式细胞仪488nm波长下进行检测。DT-RGD组较其它组诱导晚期凋亡作用更为显着(p<0.01)。药物诱导作用同上,收集细胞,收集细胞用70%乙醇4℃固定12h后,再用100μL Rnase液(100μg/mL)悬浮,37℃,作用30min,再用400μL的PI在4℃下避光孵育30min,流式细胞仪488nm波长下进行检测,各期细胞所占比例用Modfit软件计算。DT-RGD主要引起G2/M期细胞阻滞,与对照组显着差异(p<0.01),与其它两组有差异(p<0.05)。11.荧光定量RT-PCR法检测对A549细胞的Bcl-2、NFkBp65、VEGF、MMP-9的mRNA表达A549肺癌细胞用相应药物作用后,收集细胞,用Trizol试剂盒提取总RNA,并测定纯度,逆转录合成cDNA,用相应引物经PCR扩增,产物进行Line-gene荧光定量PCR检测系统测定。DT-RGD组与其他叁组比较显着下调上述指标的表达(p<0.01)。12.体外损伤愈合实验和Transwell法评价DT-RGD抗A549肺癌细胞侵袭能力损伤愈合实验用来评价药物抗A549肺癌细胞侵袭和转移的能力,适量A549肺癌细胞种入12孔板中,在形成单层细胞后,用Tip头尖端划出一个“一”字人为损伤,然后用含药培养液进行培养,比较四组A549肺癌细胞时间依赖性损伤愈合效果,并用光学显微镜每12h观察,愈合面积变化和细胞数用Image软件测定。DT-RGD组与其他叁组比较显着抑制A549肺癌细胞损伤愈合恢复能力(p<0.01 )。对数生长期A549肺癌细胞加入Transwell小室的上室,体积200μL,下室加入含10%FBS的RPMI1640培养液,各组加入相应含药培养基37℃C作用12h,上室中的细胞从上室侵入下室并附着在膜上,用甲醛固定并苏木素染色,随机选取5个视野,在400×光学显微镜下记录细胞数。DT-RGD组与其他叁组比较显着抑制A549肺癌细胞穿膜能力(p<0.01 )。13.非小细胞肺癌移植瘤模型评价DT-RGD抗肿瘤效率及毒性5-6周雄性裸鼠被随机分成四组,当体重达到16-18g左右时,用5×106 A549肺癌细胞在右侧胸前皮下注射,当非小细胞肺癌移植瘤体积达到80～100mm3,通过尾静脉注射20mg/kg相应药物,间隔叁天给药,共叁次,肿瘤体积和体重每叁天测定一次。DT-RGD组产生类似于DT-DSPE组的毒副作用,与对照和单纯DT相比毒副作用显着降低(p<0.01), DT-RGD组同其他组相比具有显着的抑瘤作用(p<0.01)。研究结论:1.成功构建RGD环肽修饰的多西紫杉醇靶向聚合物胶束DT-RGD;2. DT-RGD通过下调A549肺癌细胞的Bcl-2和NFkB的mRNA表达来诱导A549肺癌细胞凋亡,抑制A549肺癌细胞的增殖。3. DT-RGD可以显着抑制A549肺癌细胞的VEGF、MMP-9的mRNA表达,有效抑制细胞的侵袭和转移能力。4.在A549肺癌移植瘤模型中,DT-RGD通过主动和被动靶向作用,可以显着抑制肿瘤的生长,毒副作用明显降低。
邹见刚[9]2017年在《血清肿瘤标记物联合动态检测在肺癌早期诊断和监控治疗的临床价值》文中研究指明目的:评估血清肿瘤分子标记物糖类抗原(carbohydrate antigen,CA50)、癌胚抗原(carcino embryonic antigen,CEA)、鳞状细胞癌相关抗原(squamous cell carcinoma antigen,Scc-Ag)、细胞角蛋白19片段抗原21-1(cytokeratin19 fragment antigen21-1,CYFRA21-1)、人多效蛋白(pleiotrophin,PTN)、神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)联合动态检测在肺癌早期诊断和监控治疗中的临床应用价值。方法:采集201例肺癌初诊患者治疗前后、50例肺部良性病变患者及50例健康体检者血清为研究对象,采用电化学发光法和酶联免疫法检测其血清肿瘤分子标记物CA50、CEA、Scc-Ag、CYFRA21-1、PTN、NSE水平。统计学分析CA50、CEA、Scc-Ag、CYFRA21-1、PTN、NSE在叁组人群血清中的表达水平差异。评价肺癌患者各临床病理因素(患者性别、年龄、肿瘤发生部位、肿瘤直径、癌灶扩散转移及临床分期、病理组织学类型、复发、伴胸腔积液及治疗后)与血清肿瘤分子标记物水平有无相关性。分析比较血清肿瘤分子标记物单项及联合检测诊断肺癌的临床价值(敏感性、准确性、特异性、阳性预测值、阴性预测值、阳性拟然比、阴性拟然比之间的差异)。结果:(1)CA50、CEA、Scc-Ag、CYFRA21-1、PTN、NSE在肺癌患者血清中的表达水平明显高于肺部良性病变组及正常对照组(P<0.01),而良性病变组和正常对照组血清CA50、CEA、Scc-Ag、CYFRA21-1、PTN、NSE表达水平无明显差异(P>0.05);(2)肺癌患者血清CA50、CEA、Scc-Ag、CYFRA21-1、PTN、NSE水平与患者性别、年龄、肿瘤发生部位无明显相关性(均P>0.05),与肿瘤负荷、癌灶扩散转移及临床分期、病理组织学类型、复发、伴胸腔积液及治疗后具有明显相关性,肿瘤体积大、临床高分期、伴复发转移、合并胸腔积液、治疗前血清CA50、CEA、Scc-Ag、CYFRA21-1、PTN、NSE水平明显高于肿瘤体积小、临床低分期、无复发转移、无胸腔积液及治疗后,差异有统计学意义(均P<0.01);(3)肺腺癌患者血清CA50、CEA有高表达水平及高检出率,肺鳞癌患者血清Scc-Ag、CYFRA21-1有高表达水平及高检出率,小细胞肺癌患者血清PTN、NSE有高表达水平及高阳性检出率。CA50联合CEA检测肺腺癌、Scc-Ag联合CYFRA21-1检测鳞癌、PTN联合NSE小细胞癌,其阳性检出率比单项检测明显提高,差异有统计学意义(均P<0.01);(4)CA50、CEA、Scc-Ag、CYFRA21-1、PTN、NSE诊断肺癌的敏感性分别为46.27%(93/201)、49.75%(100/201)、50.75%(102/201)、44.28%(89/201)、50.25%(101/201)、48.76%(98/201),准确性分别为55.38%(139/251)、57.77%(145/251)、59.36%(149/251)、53.39%(134/251)、58.57%(147/251)、56.97%(143/251),血清CA50、CEA、Scc-Ag、CYFRA21-1、PTN、NSE六项肿瘤分子标记物联合检测诊断肺癌特异性虽有所降低86.00%(43/50),但可明显提高敏感性、准确性,分别为95.02%(191/201)、93.23%(234/251),明显高于各单项检测,差异有统计学意义(均P<0.01)。结论:联合检测血清肿瘤分子标记物CA50、CEA、Scc-Ag、CYFRA21-1、PTN、NSE可作为肺癌早期筛查的有效方法,有利于临床肺癌的早发现、早治疗,动态检测能监控疗效及预后随访。
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