张美玲[1]2014年在《河南省禽规模化养殖场鸡传染性支气管炎分子流行病学调查及其防控》文中认为鸡传染性支气管炎(IB, infectious bronchitis)是由鸡传染性支气管炎病毒(IBV, infectious bronchitis virus)引起的传染性疾病。IBV易变异、血清型众多及其组织嗜性多样的特点,常导致临床上防控IB的失败,造成严重的经济损失。鉴于此,为更好的在家禽生产中防控IB,本研究对河南地区IB进行了流行病学调查,并对典型案例进行病毒分离,采用制备自家疫苗的方式进行综合防控,现将结果报告如下：对河南省2012年-2013年两年的临床病例统计以及21个市区或直辖市家禽规模化养殖场共采集的335份疑似IB病料,进行分子流行病学调查。采用RT-PCR方法针对IBV保守的N基因进行流行病学调查。335份病料总阳性率为17.91%(95%CI14.0-22.40),其中2012年为18.09%(95%CI12.9-24.3),2013年为17.69%(95%CI11.9-24.8)。河南省大部分地市均有不同程度的IBV感染情况出现,在养殖密度相对较大的地区,阳性率普遍高于其他地区。2012年主要集中在7-9月份；2013年主要集中在1-6月份。2012-2013年IBV感染情况均集中在0-60日龄的雏鸡,感染率为30.15%(95%CI22.6-38.6),60-120日龄感染率为16.18%(95%CI8.4-27.1),120日龄以上的产蛋鸡总感染率6.11%(95%CI2.7-11.7)。为了从基因水平了解河南省IBV遗传变异情况,利用实验室保存的引物对阳性鸡胚尿囊液中IBV S1基因的扩增及序列测定,得到3个IBV S1的基因序列,分别为HN LH株、HN LY株和HN XYHL株,另外2个毒株cK/CH/HN/1205株和Jin-13株,为实验室保存的参考毒株。与国内外不同地区IBV S1基因进行核苷酸和氨基酸同源性比较分析,并构建遗传进化树。通过比较发现HN LY株与市场上H120、H52及W93等呼吸型疫苗株同源性在99.5%至99.6%之间,亲缘关系较近,可能是疫苗株变异引起的感染；Jin-13株与山东分离株SDA株亲缘关系较近,可能是两省均为养殖大省且在地理位置上紧密联系,相互之间存在着家禽及其产品的的频繁且广泛的交流所致；cK/CH/HN/1205株、HN LH株和HN XYHL株处于同一分支,与国内肾型代表分离株LX4亲缘关系较近,同源性在94.9%至97.2%之间,以上结果显示,在基因水平上,河南及其周边地区存在不同进化分支的IBV毒株,田间流行的IBV毒株呈现多态性变化。这其中HN LH株和HN XYHL株亲缘关系更近,同源性达到97.2%。了解河南省IBV流行毒株的特异性,为河南省鸡传染性支气管炎的防治提供了科学参考。根据以上研究结果,选取具有代表性的HN XYHL株制备油乳剂灭活疫苗,经质量检验合格后,对荥阳市种鸡场进行防疫,首次免疫时间8日龄,2周后进行二免。同时改善饲养环境、调整免疫程序,配合药物保健及控制继发感染等综合防控措施。同时以血凝试验和中和试验检测抗体结果,并结合鸡群的生产指标为该油乳剂灭活苗免疫效果进行评估的依据,最终较好防控了该病。流行毒株油乳剂灭活苗的应用很好的解决了目前IB难以防控的问题,为河南省地方流行毒株的预防控制提供科学依据。
陈德胜[2]2000年在《传染性支气管炎病毒中国地方流行毒株的分子流行病学研究》文中研究表明本文从全国范围内收集、分离IBV各地的流行毒株，建立IBV的系列诊断鉴定方法，建立了比较稳定的大片段单链RNA RT-PCR研究方法，对其中一些毒株进行了序列测定与分析。从IBV的基因和蛋白质分析研究出发，对我国目前IBV流行的时间和空间范围、毒株的致病特征、变异毒株和野毒株的流行现状以及我国IBV各地分离毒株之间的系统发生进化关系与亲缘关系进行研究，为对IBV的有效预防提供分子生物学和分子流行病学研究的理论依据。研究主要从以下几个方面展开：1．我国主要省市自治区IBV地方流行毒株的分离与鉴定：收集了上海、天津、河北、内蒙古、吉林、黑龙江、江苏、浙江、福建、江西、山东、河南、广东、广西、四川、甘肃、新疆、安徽、贵州、山西等20个省、市、自治区48个发病鸡群的病料并进行了分离病毒，完成了各病毒材料的基本流行病学背景调查工作。2．IBV几种诊断鉴定方法的建立：建立完善了IBV病毒鉴定的系列诊断方法。包括： （1）鸡胚矮小化实验：将各病毒材料分别接种9-10日龄SPF鸡胚，传6-10代，在接种后第7天观察鸡胚有无侏儒胚、羊膜增厚、肾脏尿酸盐沉积等特征性病变。 （2）Dot-ELISA鉴定：用混合IBV单克隆抗体在硝酸纤维素膜上进行斑点ELISA试验，直接从感染尿囊液中检测IBV粒子。 （3）核酸探针杂交：将IBV S1基因和N基因分别进行地高辛标记，制备出两种IBV核酸探针。采用核酸探针斑点杂交试验（Dot-blot）检测尿囊液中的IBV核酸。 上述试验结果表明各种方法的附和率比较高，其中鸡胚矮小化实验有一定的非特异性，Dot-ELISA和Dot-blot方法的灵敏度和特异性都很高。 3．IBV基因组RT-PCR方法的建立：建立了稳定的IBV单链RNA基因组RT-PCR方法，利用此法可以扩增出多株IBV基因组的不同基因，重复性较好。并且对其他RNA病毒的基因组扩增有借鉴价值。 4．完成了10个IBV地方分离毒株的全长u基因扩增工作，并完 成了其中7个病毒株的完整SI基因序列测定工作，获得了这7个毒 株的毒株的完整SI基因克隆质粒，6个毒株的完整SI基因序列被美 国国家生物信息中心州CBI）GenBank收录。 5．扩增出3个IBV地方分离毒株的N基因，完成了其中1个毒 株的N基因序列测定工作。 6．我国IBV地方流行毒株的病原生态学和分子流行病学的研究。 将我国的IBV地方分离毒株的基因与氨基酸序列与典型血清型标 准毒株的基因与氨基酸序列综合分析和评价，将IBV各地区流行毒株 分为3群，这3群毒株代表了ISV流行毒株的3种可能来源：第一，由 传统疫苗株变异造成毒力变化而引起新流行的毒株（工 群毒株）。此 群毒株与疫苗毒株的亲缘关系非常接近。其毒力增强的原因可能是一 些关键位点的变异。第二，自然界流行的野毒株（11群毒株），此群 毒株与其他血清型毒株的亲缘关系比较远，可能是我国特有的野毒株 或从国外传入的新的流行毒株。第三，与疫苗毒株有一定亲缘关系的 流行毒株 ＊ 群毒株），此群毒株与疫苗毒株有一定的亲缘关系但比 1群毒株要远一些，估计此群毒株可能是野毒株与疫苗毒株基因重组 或替换的结果。 分析结果还显示，我国IBV流行毒株的地理分布和时间分布不 均衡。亲缘关系很近的毒株在地理位置上却不一定相距很近，亲缘关 系较远的毒株地理位置却不一定相距很远，没有明显的地理和时间分 布的规律可循。 另外，各病毒株的组织嗜性和亲缘关系之间没有明显的联系。 既临床表现分别为呼吸型，肾型，腺胃型的IBV毒株在SI基因序列 和蛋白质氨基酸构成方面，未见明显的差异，同群毒株中各种组织嗜 性的毒株都有。这表明不同组织嗜性的毒株，其基因和蛋白质之间的 差异可能并不很大，决定病毒亲嗜性的氨基酸只要发生很小的变化就 可能引起致病表现型的变化。
韦正吉[3]2007年在《广西鸡传染性支气管炎病毒分子流行病学的研究》文中研究表明鸡传染性支气管炎(Infectious bronchitis，IB)是由冠状病毒科、冠状病毒属的传染性支气管炎病毒(IBV)引起的一种急性、高度接触性传染病。IBV主要侵害雏鸡的呼吸道、生殖系统及肾脏，引起产蛋鸡的产蛋量和蛋的品质下降，导致鸡的生产性能降低。由于病毒自身基因组易发生点突变、基因缺失、插入及重组，导致病毒不断产生变异，新的血清型和基因型不断出现。由于不同血清型IBV之间仅有部分或完全没有交叉保护作用，使得实际生产中免疫接种失败的现象不断发生。尽管广泛及频繁地使用疫苗免疫，但近年来广西许多鸡场仍发生IB，造成了较大的危害及经济损失。因此，了解和掌握目前养鸡生产上IBV流行毒株的分子变化的特征就成为一项有效防控IB的前提工作。从广西主要养鸡地区(包括南宁、玉林、柳州)疑患传染性支气管炎的发病鸡群中采集病料，应用鸡胚尿囊腔接种的方法进行病毒分离和培养，对有病变的鸡胚，取其尿囊液进行常规的细菌检查，阴性者通过血凝试验(HA)、致鸡胚矮小化试验、对新城疫病毒增殖干扰的试验及利用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术进行检测。结果共有20株分离物均具有IBV感染特征，无直接血凝性，毒株对NDV有明显的干扰作用，病毒传代物有明显的致鸡胚矮小化作用，用RT-PCR方法成功扩增到IBV S1基因高变区Ⅰ(HVRⅠ)。为了解广西IBV现场流行毒株的遗传变异情况，对广西1985～2007年间分离到的22株传染性支气管炎病毒(IBV)的S1 HVRⅠ基因进行序列测定，并与发表的其它IBV参考株及鸽子分离的冠状病毒株的基因序列进行比较和分析。系统进化关系显示这些毒株可分为5个基因群，其中有16个广西分离株属第Ⅰ群，它们与鸽子冠状病毒分离株的氨基酸序列同源性较高，与Masschusetts(Mass)型疫苗株的同源性较低。有15个分离株在33～34位和34～35之间分别有4个和3个氨基酸残基的插入，GX-NN6在33～34位和34～35位之间则均有4个氨基酸残基的插入；GX-YL1、GX-NN2与常用的Mass型疫苗株的亲缘关系最近，同属于第Ⅱ群；GX-G、GX-XD与日本同一时期分离的毒株JP Miyazaki 89亲缘关系最近，属于第Ⅲ群；GX-YL6、GX-NN7与欧洲毒株4／91亲缘关系较近，属于第Ⅴ群。本研究的结果表明广西存在着多种类型IBV毒株的流行，毒株S1基因HVRⅠ碱基的突变或插入比较普遍，可导致其氨基酸序列的变化，绝大部分毒株与目前常用的Mass.型疫苗株的亲缘关系较低。同一时期的分离株同源性较高，但缺乏明显的地域性差异。选取不同基因型的6株代表性毒株进行人工感染鸡的致病性试验，试验的结果表明，6株广西IBV代表性分离毒株均对鸡有较强的致病力，发病率为60％～100％；GX-NN4、GX-NN6和GX-YL5可分别引起鸡只30％、20％和60％的死亡。病理剖检显示毒株除引起严重呼吸道病变和肾病变外，还能引起消化系统及免疫系统众多组织器官的明显病变，病变出现的先后顺序为呼吸系统、泌尿系统、消化系统、免疫系统。研究结果表明，分离到的IBV流行毒株(GX-NN4、GX-NN6和GX-YL5)是造成鸡群临床发病的致病力强的毒株。研究的结果表明，IBV的感染广泛存在于广西商业鸡群中，近年来广西现场流行毒株的遗传变异较大，对鸡的致病力较强。研究的数据结果为在实际生产中选择疫苗免疫和新疫苗的研发奠定了基础。
叶焕春[4]2010年在《鸡传染性支气管炎病毒的分离鉴定及S1、N基因的序列分析》文中进行了进一步梳理鸡传染性支气管炎(Avian Infectious Bronchitis, IB)是由冠状病毒科、冠状病毒属的鸡传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus, IBV)引起的一种急性、高度接触性传染病。此病在世界各地均有发生,给全球养禽业造成了巨大的经济损失。IBV是单股RNA病毒,该病毒基因可由于点突变和重组而发生变异,因此IBV的血清型较多,已达30余种之多。不同血清型毒株之间仅有部分或无交叉保护作用,从而给本病的防治带来困难。我国目前虽然已广泛使用IB疫苗,但由于IBV的易变异型,IB仍然呈高度流行趋势,尤其是在已免疫鸡群中也常常爆发IB,造成严重的经济损失。因此,对IB的发生、流行和病原变异的分析和研究,将为该病的综合防控提供有用的参考依据。本研究对江苏地区疑似鸡传染性支气管炎的病料进行了实验室病毒分离和鉴定。结果表明,四株分离株均能引起胚体发育不良,个体小,头、爪合抱,呈蜷缩现象；其尿囊液不能凝集鸡红细胞,但经2%胰酶处理后能凝集鸡红细胞；在鸡胚内对NDV LaSota株有干扰作用；动物回归试验复制出的病例表现出的临床症状、病理变化与自然发病的病例相同。所以可初步断定所分离的四株病毒为鸡传染性支气管炎病毒。应用RT-PCR方法扩增出四株IBV分离株的S1基因和N基因,将其进行了克隆、序列测定及分析。构建了系统进化树,分析了四株IBV分离株与参考毒株之间的系统进化关系。四株IBV分离株S1基因的长度分别由1611、1611、1650、1641个核苷酸组成,分别编码537、537、550、547个氨基酸。四株分离株之间S1基因核苷酸序列同源性和氨基酸序列同源性分别为80.0%～97.4%、82.9%～95.9%。分离株JS3、JS4与其它参考毒株同源性较低,在72.9%～81.8%之间,基因序列内有大量的碱基突变、插入和缺失。系统进化树分析表明,分离株JS1、JS2与呼吸型毒株归属于一个分支,分离株JS3、JS4与国内分离的肾型毒株归于一个分支。四株分离株的S蛋白裂解位点均为RRFRR,与标准呼吸型毒株裂解位点一致。四株IBV分离株N基因的长度均为1230bp,编码409个氨基酸。四株分离株之间N基因核苷酸序列同源性和氨基酸序列同源性分别为86.7%～96.1%、88.0%～98.3%。N基因系统进化树也显示分离株JS1、JS2与JS3、JS4位于两个分支。N基因序列内没有碱基的插入与缺失,但是大量的点突变造成氨基酸的替代,氨基酸的替代也出现在N蛋白的三个保守碱性氨基酸区内。以上分析结果表明,本实验分离的IBV分离株存在较为广泛的基因突变、插入和缺失,同时,IBV毒株间的基因重组也可能是IBV变异株产生的另一主要原因。本实验中分离株JS1、JS2属于呼吸型毒株；分离株JS3、JS4属于肾型毒株。本研究将IBV N基因定向插入原核表达载体pET-32a,构建了原核表达质粒pET-N,并转化至表达菌BL21 (DE3),通过IPTG的诱导表达,将表达蛋白进行SDS-PAGE检测,重组质粒得到高效表达。Western blot分析显示,N基因表达产物能够与IBV多抗血清IgG反应,具有较好的抗原性。
张淑霞[5]2007年在《鸡传染性支气管炎病毒HN99株N、M基因的研究》文中进行了进一步梳理鸡传染性支气管炎(IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(IBV)引起的鸡的一种急性、高度接触性传染病。IBV主要侵害鸡的呼吸系统、泌尿生殖系统和消化系统。病鸡出现呼吸困难、产蛋下降、肾炎和腺胃炎等症状和病变。IBV的特点是变异频繁,血清型复杂,所致疾病的临床表现差异很大。常规的诊断方法存在一定的局限性,新的分子生物学诊断方法成为近年来研究的热点。以前,人们对IBV的研究主要集中在S1基因上;但进一步的研究发现,IBV的其他结构蛋白也有重要的生物学功能。近年来,我国鸡传染性支气管炎的流行呈上升趋势,尤其是肾型、腺胃型鸡传染性支气管炎已造成了巨大的经济损失。许多学者认为大量变异株的出现与不规范使用活疫苗有关,但目前有关我国IBV地方流行株的基因序列数据还不够充分,分子生物学方面的研究也还不够深入。为了探索IBV血清型复杂多变的原因及基因工程诊断试剂的研制,本研究对IBV HN99国内分离株的N基因进行了克隆、序列分析、原核表达及表达产物的免疫活性检测;对IBV HN99株的M基因进行了克隆、序列分析及真核表达,为我国IB的诊断及免疫提供科学依据。1.根据GenBank中已发表的鸡传染性支气管炎病毒(IBV)N基因序列,设计并合成一对特异性引物,用RT-PCR方法扩增IBV HN99株的N基因,并将其克隆入pMD18-T载体,转化感受态大肠杆菌Top10,提取pMD18-T-N重组质粒,进行酶切和PCR鉴定,并对阳性质粒进行测序,将测序结果与H52、Ark99、BJ等参考毒株进行序列分析。结果表明,N基因全长为1230 bp,编码一条409个氨基酸组成的多肽;其核苷酸与H52,Ark99和BJ等毒株的同源性为88.4%～90.7%,氨基酸同源性为91.7%～94.4%;HN99株与H52,Ark99和BJ等其他各毒株的亲缘关系较远,是一株新的IBV变异株。2.通过RT-PCR扩增HN99株和W株的M基因并测序,将这2个毒株的M基因与GenBank中毒株M基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行比较,并建立M基因系统发育树。结果表明:HN99株M基因全长为669 bp,编码222个氨基酸残基,HN99株存在碱基插入与缺失,而W株M基因全长为681 bp,编码226个氨基酸残基,W株有碱基插入;HN99株与GDS14、M41、Gray、H52、BJ等毒株的M基因核苷酸同源性及推导的氨基酸同源性分别为87.0%～90.3%和89.7%～94.2%,W株与HN99、M41、Gray、H52、BJ等毒株的M基因核苷酸同源性及其推定的氨基酸分别为88.2%～92.7%和91.1%～95.6%。遗传进化树显示W株与BJ亲缘关系近,HN99株与其他毒株亲缘关系均较远。3.鸡传染性支气管炎病毒HN99株膜蛋白(M)基因PCR产物经EcoRⅠ、HindⅢ双酶切,克隆入杆状病毒真核表达载体pF-MBP。将构建的重组表达质粒pF–MBP/M转化到DH10BAC-eGFP菌中,然后用脂质体转染法将重组质粒Bacmid-egfp-MBP/M转染Sf9细胞。盲传两代后,倒置显微镜下可见转染的Sf9细胞比正常细胞折光性增强,细胞核增大,细胞增大最后破裂;在荧光显微镜下观察可见细胞浆内有绿色的荧光。提取病变Sf9细胞的DNA,分别用M13引物、特异性引物进行PCR鉴定,从病变细胞中扩增出特异性片段,表明已经产生重组病毒。M基因的表达产物经SDS-PAGE和Western Blot检测结果显示,重组病毒蛋白条带大小约为68 ku,与预期结果一致。4.鸡传染性支气管炎病毒HN99株核蛋白(N)基因PCR产物经BamHⅠ、HindⅢ双酶切,分别克隆入大肠杆菌原核表达载体pMAL?-p2X、pMAL?-c2X、pET28a,构建重组表达载体,经IPTG诱导之后,选择表达量最大的pMAL?-p2X-N做进一步的蛋白纯化、鉴定及表达产物的免疫活性检测。将重组表达质粒pMAL-p2X-N,转化大肠杆菌TB1并进行诱导表达;通过pMAL?融合蛋白纯化系统对表达产物进行非变性纯化,将纯化的N蛋白按常规方法免疫新西兰大白兔,制备兔抗鸡传染性支气管炎病毒N蛋白的多克隆抗体,并用ELISA检测其生物活性。结果表明,重组质粒pMAL?-p2X-N经IPTG诱导,表达的重组核蛋白纯化后相对分子质量分别约为92 ku和82 ku,82 ku的蛋白可能是92 ku蛋白的裂解产物,与Western blot出现的两条蛋白带相一致;纯化的重组蛋白经麦芽糖标签裂解因子作用后,出现两条蛋白带,相对分子质量分别为45 ku和35 ku,说明融合蛋白中的标签已被切除,得到了纯度较高的N蛋白,与预期结果相符合;制备的多克隆抗体可与不同鸡传染性支气管炎病毒株发生反应,与亲本毒株的反应性高于与其他毒株的反应性。综上所述,IBV HN99株N、M基因核苷酸序列均发生了一定程度的变异,与其他参考株亲缘关系均较远,是一株新的IBV变异株。IBV HN99株N基因在原核系统中获得了成功表达,表达的可溶性N蛋白具有高度的生物活性,有望做为新的基因工程抗原用于鸡传染性支气管炎病毒的群特异性诊断;IBV HN99株M基因在带有绿色荧光蛋白标签的真核系统中获得了成功表达;IBV W株M基因存在碱基插入现象,序列发生了变异。本研究为IBV的研究补充了新的试验数据,为预防和控制IB提供了新的资料和科学依据。
吴此玲[6]2011年在《鸡传染性支气管炎病毒陕西分离株的鉴定与M、N基因的遗传变异分析》文中研究指明鸡传染性支气管炎(Infectious Bronchitis,IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus,IBV)引起的鸡的一种急性、高度接触传染性的呼吸道疾病,给世界养禽业造成了巨大的经济损失。IBV主要侵害鸡的呼吸系统、消化系统及泌尿生殖系统。IBV众多的血清型及其基因组的不断变异对IB的免疫防控造成了很大的困难,而且引起的疫苗免疫失败的现象越来越多。许多学者认为大量变异株的出现与活毒疫苗的应用有关,但目前我国IBV地方流行株的基因序列还不够完备,分子生物学方面有待更深入研究。因此,对地方分离株的分离鉴定及遗传变异的研究显得尤为重要。本研究从陕西分离到的两毒株进行了M、N基因的克隆及遗传变异分析。主要获得以下结果:1.从临床疑似鸡传染性支气管炎疾病的发病鸡群中先后分离到2株病毒,经过接种鸡胚、血凝试验、鸡胚矮小试验及动物回归试验,通过鉴定,2毒株均为鸡传染性支气管炎病毒,而且具有很强的嗜肾性和致病力。2.参照GenBank中收录的IBV M基因序列,设计合成一对特异性引物,用RT-PCR方法扩增IBV SX-H09株和SX-W09株的M基因,扩增产物克隆测序后,测序结果与H52、W118、Ark99等参考毒株进行序列分析。结果表明,SX-H09株M基因全长678 bp,编码225个氨基酸,而SX-W09株M基因全长670 bp,编码222个氨基酸,两毒株与参考毒株的核苷酸相似性和氨基酸相似性分别为86.5%～99.6%和84.5%～99.6%。两毒株都存在碱基的突变、插入和缺失。遗传进化树显示SX-H09株与DY07株亲缘关系较近,SX-W09株与其他毒株亲缘关系均较远。3.用RT-PCR方法扩增IBV SX-W09株的N基因并测序,与GenBank所收录IBV毒株的N基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行比较,建立N基因系统发育进化树。结果表明, SX-W09株N基因全长1230 bp,编码一条由409个氨基酸组成的多肽;其核苷酸与Ark99、H120、Gray等毒株的相似性为86.5%～89.9%,氨基酸相似性为89.0%～94.1%。SX-W09株存在碱基的突变。SX-W09株与Ark99、H120、Gray等其他参考毒株的亲缘关系均较远。4.将IBV SX-W09株N基因PCR产物经BamHⅠ和HindⅢ双酶切克隆至原核表达载体pET-32a(+),构建重组表达载体,转化BL21(DE3),经IPTG诱导后纯化蛋白,用纯化的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,用ELISA和Western blot检测制备的抗体。结果表明,成功构建原核表达载体,ELISA检测多克隆抗体效价为1:12800,Western blot检测具有良好的反应性,可以特异性识别IBV N蛋白。本研究分离鉴定了2株IBV陕西地方流行毒株,通过对毒株M、N基因核苷酸序列分析、遗传进化关系分析以及N蛋白在原核系统的高效表达,为IBV的防治提供参考。
程亚辉[7]2009年在《河南省7株支气管炎病毒的分离鉴定及分子生物学特性分析》文中指出鸡传染性支气管炎(InfeetiouSbronchitis,IB)是由冠状病毒科、冠状病毒属的传染性支气管炎病毒(IBV)引起的一种急性、高度接触性传染病。IBV主要侵害雏鸡的呼吸道、生殖系统及肾脏,引起产蛋鸡的产蛋量和蛋的品质下降,导致鸡的生产性能降低。由于病毒自身基因组易发生点突变、基因缺失、插入及重组,导致病毒不断产生变异,新的血清型和基因型不断出现。由于不同血清型IBV之间仅有部分或完全没有交叉保护作用,使得实际生产中免疫接种失败的现象不断发生。尽管广泛及频繁地使用疫苗免疫,但近年来河南许多鸡场仍发生IB,造成了较大的危害及经济损失。因此,了解和掌握目前河南省养鸡生产上IBV流行毒株的分子变化的特征就成为一项有效防控IB的前提工作。本试验从河南省的鹤壁,濮阳,商丘,新郑,洛阳,漯河,驻马店七个地区疑患传染性支气管炎的发病鸡群中采集病料,应用鸡胚尿囊腔接种的方法进行病毒分离和培养,对有病变的鸡胚,取其尿囊液进行常规的细菌检查,菌检阴性的通过血凝试验(HA)、致鸡胚矮小化试验、鸡胚蛋重比评价传染性支气管炎病毒致侏儒化试验,对新城疫病毒增殖干扰的试验及利用反转录-聚合酶链式反应(RT -PCR)技术进行检测。结果共有7株分离物均具有IBV感染特征,无直接血凝性,毒株对NDV有明显的干扰作用,病毒传代物有明显的致鸡胚矮小化作用,用RT-PCR方法成功扩增到IBVS1基因高变区。为了解河南省鸡场流行IB毒株的遗传变异情况,对河南省从07年6月份到08年12月分离到的鸡传染性支气管炎病毒S1基因高变区进行克隆、测序及序列比较和分析,系统进化关系显示这7株传染性支气管炎病毒属于同一个基因群,其S1高变区之间核苷酸序列的同源性为97. 0%(HN-LY与HN-ZMD)～99.8%(HN-LH与HN-PY),推导出氨基酸序列为93.5%(HN-ZMD与HN-LY)～100%(HN-PY与HN-HB)。表明在同一时期分离的毒株之间同源性较高,缺乏明显的地域性差异。对比NCBI已发表的序列,与其中氨基酸同源性较高的是吉林分离株(CK/CH/LJL/07V)和北京分离肾型毒株(A2),最高分别为99.3%和95.4%;与疫苗株H120、疫苗株H52、疫苗株Ma5、M41、USA的Beaudette株、USA的Conn/B13dpvcontact株之间氨基酸同源性为74.2%～78.8%;与澳大利亚T株、河南06年分离株HN99之间的氨基酸同源性为69.3%～72.9%,表明在河南省传染性支气管炎病毒存在变异。研究的结果表明,IBV的感染存在于河南省商业鸡群中,近年来河南鸡场流行毒株的遗传变异大,对鸡的致病力强。本实验研究的数据结果在实际生产中为河南地区IBV的免疫提供了参考,对本地开展IB防制工作具有重要的意义。
张小荣[8]2012年在《2009-2011年国内传染性支气管炎病毒分子流行病学研究及以马立克病毒为载体的基因工程疫苗研制》文中研究指明禽传染性支气管炎病毒(avian infectious bronchitis virus,IBV)属于冠状病毒科冠状病毒属中的γ-冠状病毒,由该病毒感染引起的疾病称为禽传染性支气管炎(avian infectious bronchitis,IB),是一种对鸡危害非常严重的急性、高度传染性的病毒性呼吸道疾病,可导致鸡的增重和饲料报酬降低,也能引起蛋鸡产蛋量和蛋的品质下降等,因此具有重要的经济意义,免疫预防是目前控制该病的最为有效的手段。IBV的重要特点之一就是血清型众多,不同血清型之间交叉保护性较低甚至完全不能保护,因此在生产中必须选用与流行毒株血清型一致的疫苗才能取得良好的免疫保护效果。不同血清型的IBV具有典型的地域性流行特征,而且由于病毒基因组的突变和毒株间的重组使得新的血清型不断出现,使免疫预防日益复杂化。本研究的目的旨在通过系统的流行病学监测了解近年来不同基因型IBV在我国的流行状况,通过生物信息学分析阐明不同IBV基因型间遗传演化的规律和发展趋势,并针对流行的优势基因型毒株研制新型疫苗。1、2009-2011年间国内IBV流行病学监测与流行株的遗传进化分析2009-2011年间,共从国内主要养鸡省份分离到IBV流行毒株54株,其中肉鸡源毒株52株,蛋鸡源毒株2株。在肉鸡源毒株中我们发现存在较高比例的IBV与H9亚型AIV的混合感染(25/52),发生混合感染的鸡群往往发病更为严重,且混合感染样品对接种的鸡胚表现出更强的致病性,该结果提示这两种病毒之间可能存在一定程度的致病协同作用。对所有分离毒株S1基因进行克隆和基因测序,共发现4种不同的S1基因长度,分别为1611bp、1617bp、1620bp和1626bp,说明S1基因中碱基的插入和缺失是一种非常普遍的现象。将54个分离株S1基因序列和近年来在国内及周边国家和地区流行的13个基因型共57个参考毒株的S1基因序列用Mega4.1软件进行遗传进化分析,结果显示54个分离株可以分为QX型(42株)、HN-08型(5株)、LSC/991型(2株)、TW-I型(2株)、Mass型(1株)、793/B型(1株)和CHⅢ型(1株)等7个基因型。在所有分离株中,QX型分离株数量最多,占总数的77.8%(42/54)。从进化树中还可以看出,QX型分离株又可以进一步细分为两个不同的基因亚群-Cluster Ⅰ(21株)和Cluster Ⅱ(21株),经典的QX型参考毒株QXIBV和LX4株均属于Cluster Ⅰ亚群,而Cluster Ⅱ亚群中的毒株均在2010年才开始出现。为了更加系统地描述同期内国内不同基因型IBV的分布情况,我们将已经在GenBank发表全长S1基因序列的所有同时期分离株共296株合并进行遗传进化分析,结果显示,350个同时期分离株可分为19个基因型,其中11个基因型均能根据现有文献报道找到同源的参考毒株,根据各基因型中包含的毒株数量多少依次为：QX型(219株)、HN-08型(26株)、LSC/99I型(22株)、LDT3/03型(12株)、TW-I型(12株)、CH Ⅲ型(11株)、Mass型(10株)、LDL/971型(3株)、CH VI型(3株)、TW-Ⅱ型(2株)和793/B型(1株),此外还有8个基因型未能归入已被正式命名的已知基因型,因此暂定名为未定型Ⅰ～未定型Ⅷ。从分型结果可以看出,我国流行的IBV基因型具有典型的地域性分布特征,大多数在周边国家和地区广泛流行的基因型在我国并未发现。为阐明国内不同基因型毒株之间的遗传演化关系,根据遗传进化和基因分型的结果,从不同基因型中选择代表性毒株,用RDP3.31软件对S1基因进行重组分析。结果显示当前国内流行的毒株中存在广泛的重组现象,不同基因型间的重组事件不仅导致同一基因型内部发生分化,出现了不同基因亚群,而且经过多次的同源重组后可能会导致新的基因型毒株的出现。综合不同基因型间发生的系列重组事件,可以推断：QX型、LSC/991型、793/B型、LDL/971型、TW-Ⅰ型和TW-Ⅱ型是目前在我国流行的所有基因型毒株的原型毒株,除此以外的新出现的基因型均是在这6个基因型的基础上经过一次或多次的同源重组而产生的变异株。2、Mass型H120活疫苗对当前流行的主要基因型代表毒株的免疫保护效力试验根据遗传进化分析的结果,从当前主要流行的三个IBV基因型中挑选出4个代表毒株：AH/2009/1(QX型Cluster Ⅰ亚群)、JS/2010/12(QX型Cluster Ⅱ亚群)、JS/2009/5(LSC/99I型)和JS/2010/6(HN08型),分别用Mass型IBV活疫苗(H120株)进行免疫保护效力试验,以评价现有疫苗对流行毒株的免疫保护状况。结果显示H120疫苗株对不同基因型的IBV毒株免疫保护效力存在较大差异,对同属于Mass基因型的M41强毒株能够提供完全保护，且能显著降低攻毒后气管和肾脏的排毒率；对于QX型毒株AH/2009/1和JS/2010/12,基本达到临床保护标准,但试验鸡气管和肾脏带毒的比例远远高于M41攻毒组,说明局部免疫保护效果不是非常理想；对于HN08型的JS/2010/6株和LSC/991型的JS/2009/5株保护效果均不理想,攻毒后鸡群表现出较为严重的临床症状和相当高的气管和肾脏排毒率。该结果提示我们,现有疫苗已经不能对当前流行的主要基因型毒株提供良好的免疫保护,急需研究开发与流行毒株基因型一致的新疫苗用于该病的防控。3、以马立克病毒为载体研制QX型IBV基因工程疫苗本研究以MDV CV1988/Rispens疫苗毒株为载体,以其IRS-US间隔区作为插入位点,选择网状内皮组织增生症病毒(REV)基因组长末端重复序列(LTR)作为启动子,构建含QX型IBV分离株CK/CH/JS/06Ⅱ S1基因及报告基因EGFP的转移载体pUP-LTR-EGFP-S1-DOWN。将MDV基因组DNA与转移载体共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),经同源重组获得重组病毒,通过多轮荧光筛选和纯化,最终获得的重组病毒命名为rMDV-EGFP-S1。进一步通过Cre重组酶介导的重组反应敲除EGFP报告基因,获得仅带有LTR启动子和S1基因的重组病毒,命名为rMDV-S1。通过PCR和间接免疫荧光试验(IFA)对重组病毒进行鉴定,结果表明S1基因完全按照预定方式正确插入到MDV基因组中并能够表达S1蛋白。将重组病毒在CEF上进行连续30代传代培养,经PCR和IFA试验鉴定,该重组病毒具有良好的遗传稳定性。重组病毒rMDV-S1。对QX型IBV强毒株CK/CH/JS/06Ⅱ的免疫攻毒保护效力试验结果显示,重组病毒按5×103PFU/羽的剂量免疫1日龄SPF鸡,免疫后4w攻毒,免疫组试验鸡发病率和死亡率分别为30%和5%,对照组则分别为100%和30%,经χ2检验差异显著(p<0.05)。排毒检测结果显示,免疫组气管排毒率在攻毒后部分时间点与对照组相比差异显著,攻毒后14d扑杀时肾脏排毒率差异极显著(p<0.01)。免疫组试验鸡攻毒后的增重未受明显影响,与对照组相比差异显著(p<0.05)。病理组织学检查结果显示与对照组相比免疫组试验鸡肾脏的病变程度相对较轻。所有结果均表明重组病毒对QX型强毒株的攻击能够提供良好的免疫保护。重组病毒对MDV强毒株RB1B的免疫攻毒保护试验结果显示,与亲本病毒CV1988/Rispens相比,对MDV本身的免疫保护效率未受明显影响,说明该重组病毒可以作为二联疫苗同时用于IB和MD两种疾病的免疫预防。
刘乔然[9]2008年在《中国2007年部分地区鸡传染性支气管炎病毒分子流行病学研究》文中研究表明本研究于2007年从我国部分省市免疫鸡群中分离到32株传染性支气管炎病毒(IBV),对其生物学特性进行了研究,同时对病毒S1基因序列进行了测定、分析和比较。以说明我国IBV毒株之间以及与参考毒株之间S1基因的遗传变异情况,同时构建系统进化树,分析我国IBV分离株与参考株之间的系统进化关系,从而阐明我国IBV的基因型,探讨我国鸡传染性支气管炎流行的背景和原因。现地濒死病鸡病变组织处理后,接种9-11日龄SPF鸡胚,收集72 h尿囊液,同时观察胚体病变。通过SPF鸡胚病变特征、血红细胞凝集特性、病毒粒子形态学特征等方面的研究,初步断定本研究分离的病毒为鸡传染性支气管炎病毒。由于S蛋白在病毒致病性、免疫抗体产生和组织嗜性等方面占有核心地位,S1基因的点突变、缺失和插入是造成IBV基因组变异的主要原因,所以本研究根据S1基因核苷酸序列进化关系将2007年32株IBV分离株与我国IBV分离株、我国常用疫苗株以及国外参考毒株分为3个基因型。其中第一个基因型为LX4-type,包含了2007年从我国不同地区免疫鸡群中分离的30株IBV,本实验所分离的绝大多数IBV毒株分布于该型,且亲缘关系较近;第二个基因型为CK/CH/LSC/99I-type,本研究中的分离株CK/CH/LDL/07III属于该基因型,其与该地区2004-2005年间IBV分离株的亲缘关系比较近;第三个基因型为Mass-type,包括本研究中的分离株CK/CH/LHLJ/07VII,我国常用IBV疫苗株H120,IBN和W93和国外IBV分离株(西班牙、美国、南朝鲜、日本等)。可见,2007年我国主要IBV分离株属于独立的基因型LX4-type,并且它们的亲缘关系较近,而与我国目前用于IB预防的主要弱毒疫苗和国外参考毒株属于不同的基因型。这可能是导致疫苗免疫失败,IB在鸡群中暴发的主要原因。因此迫切需要研制针对我国现地IBV流行毒株的疫苗。根据本研究2007年32株IBV分离株与我国IBV分离株、我国常用疫苗株以及国外参考毒株的S1基因推导氨基酸序列比对、分析,结果发现不同基因型/血清型IBV分别存在型特异性的氨基酸插入和缺失现象,其推导氨基酸的变异主要集中在72-79位、82-85位、127-130位。说明72-79位、82-85位、127-130位这三个区域氨基酸序列与IBV的基因型有关,可以作为IBV分型的标准。经S1基因系统进化树分析发现,本实验所分离的大多数IBV毒株(30/32)分布于同一基因型,因此对此基因型分离株CK/CH/LHLJ/07IV的致病性进行了研究,该病毒接种于42只和66只不同日龄的SPF雏鸡和商品肉鸡,死亡率为10.8﹪-30﹪。剖检发现以肾脏肿大、苍白、外观呈现典型的“花斑肾”,肾小管和输尿管扩张并且有尿酸盐沉积为主要病理变化。CK/CH/LHLJ/07IV的致病性试验结果表明历经十年来我国LX4型IBV分离株的致病力没有发生明显的变化,且仍以肾致病性为主。虽然Mass型疫苗一直在我国广泛使用,但Mass型IBV毒株CK/CH/LHLJ/07VII仍在免疫28/86和4/91的蛋鸡群中分离到。于是,本研究将CK/CH/LHLJ/07VII分离株和12株Mass型参考毒株的S1基因核苷酸与推导氨基酸序列进行了比较和同源性分析。结果表明,CK/CH/LHLJ/07VII与SD/97/01的S1基因核苷酸及推导氨基酸序列的同源性最高,分别为99%和97.1%。但通过S1基因核苷酸及推导氨基酸序列比对发现CK/CH/LHLJ/07VII S1基因核苷酸存在18个特异性位点的点突变和15个氨基酸的替换。这表明,在免疫鸡群中很难重新分离到疫苗株,由于我国长期使用弱毒疫苗,致使某些毒株在免疫压力下发生了点突变。但Mass型流行株在我国长期存在并流行,因此Mass型疫苗仍有应用的必要性。
程相朝[10]2003年在《新城疫病毒地方株分子流行病学调查及其疫病控制》文中研究表明针对近年来新城疫(Newcastle Disease Virus，ND)流行日益复杂，免疫失败屡屡发生的现状，为更好地作好本地区新城疫的防制工作，本文从以下6个方面进行了新城疫病毒地方株分子流行病学调查及所致疫病控制的应用研究。 1、新城疫病毒地方株的分离鉴定与生物学特性 对1998～2002年间洛阳地区15个代表性新城疫发病禽群中的NDV进行了分离鉴定和生物学特性的研究。结果表明，所分离的15株NDV均呈现良好的血凝活性和特异的血凝抑制活性，对鸡胚的致病作用可被新城疫阳性血清所抑制。通过MDT、ICPI和IVPI指数的测定证实，LD-6-01和LR-2-00株是弱毒株，其余均为强毒株。弱毒株的血凝素热稳定性好，属慢速血凝解脱型；强毒株的血凝素热稳定性差，属快速或中速血凝解脱型。所有毒株均可较好地凝集鸡和人(O型血)的红细胞，但对其它动物的红细胞凝集性差异较大。对HI抗体为6log_2的12日龄试验雏鸡攻毒表明，15个分离株中两个弱毒株可得到完全保护(100％)；13个强毒株中，LG-1-99、LR-1-98、LD-4-01和LD-3-00得到了基本保护(70—90％)，而其它9个分离株(LD-1-98、LD-2-99、LD-5-01、LD-7-02、LR-3-02、LW-1-02、LG-2-00、LA-1-99和LE-1-01)则基本上得不到保护(0～20％)。但所有得不到保护的试验鸡的发病死亡时间均明显向后推迟。 2、新城疫病毒地方株的分子流行病学调查 利用RT-PCR技术，对所分离到的15个新城疫代表性地方毒株的F基因主要功能区片断进行了克隆和序列分析，并根据其47～435位核苷酸序列构建了系统进化树，确定了其毒力强弱和基因型。结果显示，15个地方毒株依据核苷酸和推导的氨基酸同源性的不同可分为明显的三群，群内各毒株同源性较高，而群间差异较大，未发现有因分离禽品种不同而引起的明显株间差异。其中第一群包括9株，涉及到各时间段分离的毒株和各分离禽种，属典型的基因Ⅶ型强毒株，高度集中于进化树的基因Ⅶ型C亚群区；第二群包括4株，属传统的基因Ⅵ型强毒株，分散于进化树的基因Ⅵ型区；第三群包括2株，属古典基因Ⅱ型弱毒株，分散于进化树的基因Ⅱ型区。综合说明本地区目前流行的NDV以新型的基因Ⅶ型最为普遍，同时兼有传统的基因Ⅵ型和古老的基因Ⅱ型；并提示基因Ⅶ型各毒株来源相近，在本地区流行时间较短，株间差异不大。 3、新城疫病毒地方株不同基因型三价灭活油乳苗的研制 应用两株当地流行的新城疫病毒基因Ⅵ型和Ⅶ型代表株(LD-3-00和斯城改病毒地方株兮各流行病李们女践其改扁拉刊LD一7-02)，配以传统的La sota株(基因11型)成功地研制了不同基因型三价新城疫灭活油乳苗.经实验室检验及大田试验证明，该三价苗安全可靠，在接种后第42天时Hl抗体效价仍保持在7.51092，攻毒试验保护率达100%;在大田试验中，与新城疫弱毒疫苗联合应用，整体保护率可达99%以上，能有效地控制当地新城疫的暴发和流行。 4、NDV地方株三价灭活油乳苗与La sota株灭活油乳苗免疫效果比较 将研制的地方株三价灭活油乳苗与La Sota株单价灭活油乳苗进行了免疫效果的比较.结果显示，三价苗免疚组在接种后各个时期所产生的HI杭体效价与La Sota株灭活苗免疫组无明显差异(P>0.05)，至接种后第42天二者均具有7.31092。但在对具有相同HI杭体水平的试验鸡进行的不同毒株攻毒试验中，二者差异较大.对于F48E9标准强毒株的攻击，无论是La Sota株疫苗免疫鸡还是三价灭活苗免疫鸡，在Hl杭体效价为6109:以上时均能100%地被保护;而在La sota株疫苗免疫鸡HI效价为6109:左右时，对基因vn型野毒株的攻击，保护率却只有O%一20%;此时，三价疫苗免疫鸡则具有60%一70%的保护率;当HI效价达81092左右时，La Sota株疫苗免疚鸡对基因vII型野毒株的攻击也只有80%的保护率，而三价疚苗免疚鸡可100%地被保护;La sota株疫苗免疫鸡只有HI效价在9109:以上，方可100%地抵杭基因vn型野毒株的攻击.说明应用由地方分离株不同基因型野毒株配以传统的La Sota株所制备的三价灭活苗的免疫效果明显优于常规的单价La sota株灭活苗，是控制目前新形势下新城疫流行的有效措施. 5、NDVF基因DNA疫苗对地方株三价灭活油乳苗的免疫协同作用 为进一步探讨控制新城疫发生和流行的新途径，本文首次观察了F基因peDNA3真核表达质粒(DNA疫苗)对地方流行株三价灭活油乳苗的免疫协同作用.结果显示:在7日龄时应用三价灭活油乳苗和DNA疫苗联合免疫的鸡群，到56日龄整个观察期内，不但利用MTT法检测的T、B淋巴细胞增殖情况显示出联合免疫组鸡的胸腺T淋巴细胞对ConA、法氏囊B淋巴细胞对PMA的反应均明显强于单纯三价油乳苗免疚组(其中除在接种后第7天时两组鸡B淋巴细胞增殖的OD570值差异不显著外，其余各检测时间两组间均表现为差异显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)，特别是T淋巴细胞增殖情况在接种14天后均表现为差异极显著，p<0 .01.);而且联合免疫组的HI杭体效价也持续性高于单纯三价油乳苗免疫鸡群，并在免疚接种后35一49天时差异显著(p<0 .05).在56日龄(免疫接种后第49天)时进行的LD一7一02野毒株攻毒保护试验中，
参考文献：
[1]. 河南省禽规模化养殖场鸡传染性支气管炎分子流行病学调查及其防控[D]. 张美玲. 河南农业大学. 2014
[2]. 传染性支气管炎病毒中国地方流行毒株的分子流行病学研究[D]. 陈德胜. 南京农业大学. 2000
[3]. 广西鸡传染性支气管炎病毒分子流行病学的研究[D]. 韦正吉. 广西大学. 2007
[4]. 鸡传染性支气管炎病毒的分离鉴定及S1、N基因的序列分析[D]. 叶焕春. 南京农业大学. 2010
[5]. 鸡传染性支气管炎病毒HN99株N、M基因的研究[D]. 张淑霞. 西北农林科技大学. 2007
[6]. 鸡传染性支气管炎病毒陕西分离株的鉴定与M、N基因的遗传变异分析[D]. 吴此玲. 西北农林科技大学. 2011
[7]. 河南省7株支气管炎病毒的分离鉴定及分子生物学特性分析[D]. 程亚辉. 河南农业大学. 2009
[8]. 2009-2011年国内传染性支气管炎病毒分子流行病学研究及以马立克病毒为载体的基因工程疫苗研制[D]. 张小荣. 扬州大学. 2012
[9]. 中国2007年部分地区鸡传染性支气管炎病毒分子流行病学研究[D]. 刘乔然. 中国农业科学院. 2008
[10]. 新城疫病毒地方株分子流行病学调查及其疫病控制[D]. 程相朝. 南京农业大学. 2003
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