卢士英[1]2004年在《大腹园蛛组织蛋白酶B相关cDNA Avg1克隆及表达研究》文中研究说明从构建的大腹园蛛主壶腹腺cDNA文库中筛先到Avgl(基因登录号为AY302573)完整cDNA克隆，为一新的CB相关基因。CB为溶酶体内一种重要的半胱氨酸内切蛋白水解酶，具有广谱的蛋白酶活性，参与机体多种肿瘤细胞浸润转移等多种生理和病理过程，因此越来越受到人们的广泛关注。 本实验根据AvglcDNA序列特点，设计合成引物(AvgS,AvgX)，提取大腹园蛛主壶腹腺总RNA并以此为模板，RT-PCR方法扩增AvglcDNA去除信号肽的部分序列(Avg)，将目的片段Avg与原核表达载体pET-28a(+)，pET-20b(+)分别用EcoR Ⅰ，Nco Ⅰ酶切处理，回收纯化后，连接构建两个重组载体，转化克隆宿主菌E．coli DH5a中，经酶切及PCR鉴定为阳性克隆后进一步测序鉴定，结果碱基、预测氨基酸序列均与Avgl(去除信号肽)100％一致，并具有正确的读码框，获得的重组质粒Avg-28a、Avg-20b可以用于下步表达。 大量提取重组质粒Avg-28a、Avg-20b，将其转化到表达宿主菌E．coli BL21(DE3)中，鉴定为阳性克隆后，用IPTG 37℃诱导表达，SDS-PAGE电泳分析，Avg-28a-DE3在近36kDa处出现了明显的表达带，其大小与预计分子量(35459.13Da)相当，经薄层扫描表达外源蛋白量占全菌体蛋白总量的39.6％，且表达形式主要为包涵体，将表达的包涵体蛋白进行变性、复性处理后测定蛋白酶活性，未见明显的酶活性；而Avg-20b-DE3未出现明显的表达带，用RT-PCR方法检测到了Avg mRNA的转录。将Avg-20b-DE3诱导，超声波破菌后上清液测定蛋白酶活性，显示了明显的酶活性。 制备包涵体蛋白，电洗脱纯化后，常规方法免疫吉戎獭兔，结束后颈动脉采血，经ELISA检测，呈明显的阳性反应。Western blot在36kDa处显示了特异蛋白结合带，Avg原核表达蛋白能够有效地刺激机体产生抗体，具有良好的免疫原性，为CB的进一步应用研究奠定了基础。
任洪林, 柳增善, 卢士英, 潘风光[2]2004年在《大腹园蛛Avg1 cDNA的克隆和序列分析》文中研究表明大腹园蛛组织蛋白酶B相关cDNA Avg1克隆及表达研究
卢士英, 任洪林, 潘风光, 孟宪梅, 柳增善[3]2007年在《大腹园蛛Avg 1的原核表达及生物学活性》文中指出[目的]研究大腹园蛛组织蛋白酶B相关基因Avg 1(基因登录号:AY302573)编码蛋白的生物学特性.[方法]设计合成引物(AvgS,AvgX),扩增Avg 1,去除信号肽部分基因Avg,将其与原核表达载体pET-28a(+),pET-20b连接,转化到E.coliBL21(DE3)中.[结果]鉴定为阳性克隆后,用IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳显示Avg-28a-DE3在近35.7ku处出现明显的表达带,其大小与预计分子质量(35.2ku)相当;经薄层扫描分析显示,表达蛋白量占菌体蛋白总量的39.6%,且表达形式主要为包涵体,而Avg-20b-DE3表达产物未见表达带,但RT-PCR方法检测到了Avg mRNA的转录;将表达的包涵体蛋白进行变性及复性处理,与诱导的Avg-20b-DE3表达菌经超声波碎菌处理上清液一同进行蛋白酶活性测定,呈复性的包涵体蛋白不具有酶活性,而Avg-20b-DE3的碎菌上清液显示明显的蛋白酶活性.表达的包涵体蛋白经电洗脱纯化后,常规方法免疫吉绒獭兔,抗血清经ELISA法检测,呈明显阳性反应,经Western blot检测在35.7ku处出现特异结合带.[结论]Avg 1原核表达蛋白具有良好的免疫原性.
任洪林[4]2002年在《大腹园蛛主壶腹腺cDNA文库构建和丝蛋白基因筛选》文中指出本研究在国内外首次构建了大腹园蛛(Araneus ventricosus)主壶腹腺(Major ampullate gland)cDNA文库，并以鸟枪法从中筛选出两个蛛丝蛋白和一个非丝蛋白cDNA新基因。首先剥离大腹园蛛主壶腹腺，提取总RNA和分离纯化mRNA，反转录合成cDNA，凝胶层析除去小于400bp片段，并在双链cDNA两端引入EcoRⅠ的衔接头，对其进行磷酸化处理。同时以EcoRⅠ酶切消化pUC18质粒DNA，CIAP对载体5′端去磷酸化处理。将cDNA与载体连接，并导入DH5α感受态细胞中，构建成cDNA文库。以海选的方式从中筛选具有典型丝蛋白基因重复序列特点的大腹园蛛蛛丝蛋白基因。利用BLAST软件在NCBI已知序列数据库中检索分析同源性。试验结果，该文库容量为4.9×10~6。从文库中筛选到AvF1和AvF2蛛丝蛋白新基因，具有典型重复序列多，G／C含量高，密码子第叁个碱基偏爱使用A／T及编码蛋白中含有大量Gly和Ala残基等特点。AvF1序列1744bp，编码区1572bp，编码氨基酸524个，分子量为42489.55dal。其典型重复结构是(GGP)_nGGX。与现有已知的蛛丝蛋白基因中叁带金蛛(Argiope trifasciata)鞭毛样丝基因(AtfF)有最高的同源性69.3％。AvF2序列1408bp，编码区为1288bp，编码氨基酸429个，分子量为34070.35dal。其典型重复结构为(GA)_nA_m(GA)_N。与现有已知的蛛丝蛋白基因中十字园蛛(Araneus diadematus)丝蛋白基因ADF1有最高的同源性69.3％。还筛选到非丝蛋白基因Avg1，序列长1253bp，编码区1002bp，编码334个氨基酸，分子量为36953.00dal。NCBI检索未见同源性高的基因序列，但发现含有典型的肽酶结构域，编码蛋白与组织蛋白酶B结构域部分一致性高达90％，其具体功能有待于进一步验证。大腹园蛛主壶腹腺cDNA文库的构建和两个蛛丝蛋白新基因的克隆，为提供大腹园蛛蛛丝蛋白基因背景和进一步研究蛛丝蛋白奠定了基础。
陈磊[5]2008年在《猪肉嫩度性状评价体系研究及嫩度相关新基因的克隆、时空表达谱分析》文中提出本研究采集18头六月龄DLY商品猪的背最长肌样品,通过24、72、144小时叁种不同时间嫩化处理得到54份嫩度性状表现有差异的样品。利用Warner-Bratzler剪切力测定、质构剖面分析(TPA)和感官评定,分析了各样品的质构性状,并分析了仪器测定与感官测定数据间的线性关系。Warner-Bratzler剪切力测定中得到的最大剪切力、W-B硬度和平均剪切力与感官硬度、弹性、多汁性间均存在显着或极显着(P＜0.05或P＜0.01)的相关性,其中最强的相关关系表现在最大剪切力与感官硬度间(r=0.69385,P＜.0001);TPA分析数据与感官测定指标间的相关程度较弱,最强的相关关系表现在感官硬度与TPA硬度间(r=0.46075,P=0.0047)。进一步采用主成分-逐步回归法,以仪器测定指标为自变量,感官评定指标为依变量进行回归分析,分别得到具有统计意义的感官硬度、感官弹性和多汁性的预测方程,其中对感官硬度的预测效果较好,方程决定系数达到0.6146;而对感官弹性和多汁性的预测效果较差,方程决定系数为0.3977和0.4234。采用RT-PCR结合克隆测序的方法,从猪肌肉组织总RNA中克隆出了猪组织蛋白酶B(CTSB)基因的cDNA序列,并推导出其编码的氨基酸序列。猪CTSB基因开放阅读框(ORF)全长1008bp,编码335个氨基酸。同源性分析结果表明,猪与人、小家鼠、牛的CTSB基因cDNA编码区(CDS)同源性分别为85%、81%、90%,推测的氨基酸序列同源性分别为81%、79%、91%。利用同源性结合序列特征预测表明该蛋白具有信号肽和前肽序列。蛋白质结构同源建模分析表明,该蛋白具有木瓜蛋白酶家族的典型空间结构,包括1个底物结合凹槽和3个相互靠近的活性位点。利用直接测序的方法,分别在第六和第七外显子内发现两处未造成编码氨基酸改变的T-C同义突变位点,另外还采用PCR-SSCP方法,在237头个体中分析了CTSB基因第6内含子内的SSCP位点多态性,检测到3个等位基因6种基因型。FF基因型个体的各项嫩度指标最高,其最大剪切力与硬度值分别为6.79 kg和24.06 kg.s,极显着地高于EE和EF基因型个体(P＜0.01),平均剪切力为5.23 kg,显着地高于EF基因型个体(P＜0.05)。另外发现CTSB基因的一种转录变异体CTSB2,在5'非编码区内比野生型CTSB mRNA多出一段140 bp的插入序列,推测可能是由外显子可变剪切造成的。Real-Time PCR结果表明CTSB基因mRNA表达量受到组织、发育阶段和品种因素影响。表达量最高的组织为肾脏和肝脏,而在心肌和骨骼肌中低丰度表达,并且在叁处不同部位的骨骼肌间无显着表达量差异。CTSB基因mRNA表达量在0～5月龄长白猪和梅山猪背最长肌中表现出先升高后降低的变化趋势,梅山猪峰值出现较早,并在4月龄后再次出现急剧上升趋势。而在藏猪背最长肌中则表现出持续降低的变化趋势,且该基因表达量极显着地高于其他两个品种。同样采用RT-PCR结合克隆测序的方法,从猪肌肉组织总RNA中克隆出了猪肉嫩度性状候选基因—半胱氨酸蛋白酶抑制素B(Cystatin B,CTSB)基因序列,并推导出其编码的氨基酸序列。猪Cystatin B基因ORF全长297bp,编码98个氨基酸。同源性分析结果表明,猪与人、鼠、牛的Cystatin B基因cDNA编码区(CDS)同源性分别为81%、85%、89%,推测的氨基酸序列同源性为83%、76%、85%。蛋白质结构同源建模分析表明,该蛋白与人、鼠Cystatin B类似,具有stefin类蛋白酶抑制剂的典型空间结构,包括5条平行的β-sheet和负责与被抑制酶结合的楔形边缘。另外还采用PCR-RFLP方法,分析了237头个体CSTB基因第二内含子内PvuⅡ酶切位点的多态性,检测到了AA、AB和BB叁种基因型,关联性分析表明AA基因型个体的各项嫩度指标均极显着低于另两种基因型的个体(P＜0.01),最大剪切力为5.76kg、硬度值为20.15kg.s、平均剪切力为3.66kg。Real-Time PCR试验结果表明CSTB基因mRNA表达量受到组织、发育阶段和品种因素影响.表达量最高的组织为肾脏和肠系膜淋巴结,而在心肌和骨骼肌中低丰度表达,股四头肌组织表达量极显着高于眼肌。CSTB基因mRNA表达量在0～5月龄梅山和2～12月龄藏猪表现出生后初期较高,随后逐渐降低的表达模式:而外种猪长白猪的表达模式则为出生后表达量急剧升高,2月龄达到峰值,随后逐渐降低。CSTB和CTSB两基因的mRNA表达量表现出较高的正相关,但相关程度受到品种因素影响。
李明才[6]2006年在《人IL-28和IL-29基因的克隆与表达》文中研究指明白细胞介素(IL)-29、IL-28A和IL-28B是2003年初发现的一个新型的细胞因子家族，由于其结构和功能与干扰素(IFN)有一定的相似性，所以它们也分别被称为IFN-λ1、IFN-λ2和IFN-λ3。它们是由一些病毒或双链RNA(dsRNA)活化多种细胞如外周血单个核细胞和树突状细胞等产生的细胞因子。其信号转导机制类似于Ⅰ型干扰素，两者都是通过诱导受体异二聚体化，活化Jak-STAT信号通路，进而发挥其抗病毒感染、抑制细胞增殖和免疫调节等生物学作用。所不同的是IL-28和IL-29是通过诱导其独特的Ⅰ型细胞因子受体CRF2-12(或称IFNLR1、IL-28Rα、LICR2)和CRF2-4(或称IL-10Rβ、IL-10R2)异二聚体化进行信息传递。IL-28和IL-29与Ⅰ型IFN有相似的功能，而且能选择性地作用不同类型的靶细胞，它们可作为IFN的替代品，用于肿瘤和病毒性疾病等的治疗。最近的研究表明，IL-28和IL-29还能诱导CD4~+CD25~+Treg调节性细胞的增殖及耐受性树突状细胞的产生，在肿瘤、器官移植、自身免疫性疾病及变态反应性疾病等的防治方面具有潜在的应用价值。 目前，国内还没有重组基因工程IL-28和IL-29上市，而且其功能研究在国内外都尚处于起步阶段。本研究拟克隆人IL-28和IL-29基因，通过真核和原核表达系统表达IL-28和IL-29蛋白，奠定基因工程研制重组人IL-28和IL-29的基础。主要研究结果如下： 一、根据GenBank中人IL-29、IL-28A和IL-28B基因序列设计特异性引物，用逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)技术，从聚肌胞(poly I：C)刺激的人外周血单个核细胞中克隆出IL-29、IL-28A和IL-28B基因的全长编码区，并将之克隆入pcDNA3.1／V5-His-TOPO载体，分别构建其基因的真核表达载体pcDNA3.1／V5-His-TOPO-IL-28／IL-29，转化入大肠杆菌TOP10中，经菌落PCR、酶切鉴定及序列测定与分析，它们与GenBank中的序列完全一致。同时，发现了一个新的基因序列，它与IL-28B有5个碱基不同，把它暂时命名为IL-28C。用计算机技术和分子生物学软件对IL-29、IL-28A和IL-28B的二级结构特征和B细胞抗原表位进行了分析和预测，发现它们的结构与抗原表位具有很大的相似性，预示着它们具有相似的生物学功能。为IL-29、IL-28A和IL-28B基因的表达研究奠定了基础。 二、为了研究IL-29、IL-28A和IL-28B的功能，本研究将含有IL-29、IL-28A和IL-28B全长cDNA片段的真核表达质粒，用Lipofectamine~(TM)2000脂质体介导转染人肺腺癌A549细胞，经抗生素G418筛选后，通过RT-PCR和Western-blot鉴定IL-29、IL-28A和IL-28B
李政[7]2014年在《蜡梅扩张蛋白基因CpEXP1的表达分析及其功能验证》文中认为蜡梅(Chimonanthus praecox (Linn.) Link),蜡梅科(Calycanthaceae)蜡梅属(Chimonanthus Lind1.)木本植物,原产于我国。其冬季开花色泽金黄并带有香味,是名贵的木本切花。但在蜡梅切枝采收以及贮藏运输过程中容易落蕾落花,尤其是中蕾期花蕾的脱落直接影响了蜡梅作为鲜切花的开发应用。以往关于蜡梅切花保鲜的研究基本停留在生理生化水平,而且缺少对落蕾问题的专门研究。近些年研究发现,扩张蛋白与器官脱落关系密切。2009年,我们在蜡梅的研究中分离得到CpEXP1基因(GeneBank accession no. JN700522),序列分析及同源性比较发现该基因属于α-扩张蛋白基因。但该基因的功能尚未明确。如果该基因的表达与蜡梅花蕾脱落存在相关性,我们就可以考虑通过调控该基因的表达来进一步深入探索蜡梅花蕾脱落的机理,为寻找抑制蜡梅花蕾脱落的措施提供新思路。本研究以素心蜡梅(Ch. praecox var. concolor Makino)为材料,在克隆CpEXP1基因的基础上进行了原核表达和重组蛋白活性分析；并对不同组织、不同开花阶段中CpEXP1基因的表达进行了研究；在花蕾脱落力分级的基础上对蜡梅花梗离层形成解剖结构、CpEXP1基因的表达以及扩张蛋白活性的相关性进行了分析；通过构建植物表达载体并转化拟南芥,对该基因的其它功能进行了鉴定。最后,对CpEXP1基因启动子进行了克隆和功能分析。主要结果如下：(1)原核表达及其产物活性分析成功构建了原核表达载体pET32a(+)-CpEXP1,将其导入大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达获得了CpEXP1重组蛋白。利用MagneHisTM蛋白纯化回收试剂盒获得了纯化的重组蛋白。活性测定表明,CpEXP1重组蛋白具有体外活性,能够促进大豆幼苗下胚轴的伸长。将提取的重组蛋白添加到不同培养阶段的麻点百合培养基中,发现重组蛋白对麻点百合愈伤组织的分化无显着影响,但对增殖以及生根有明显促进作用,并且随着重组蛋白浓度的增加,增殖率以及生根率显着提高,组培苗长势也显着增强。(2)蜡梅开花阶段划分与脱落力分级素心蜡梅花蕾着生以1级分枝为主,其中短于20cm的中等枝以及短枝占80.0%,花蕾着生量占82.4%,构成了蜡梅切枝的主要观赏枝组；以花蕾发育过程中花径、雌雄蕊形态以及香味等作为依据,将素心蜡梅的开花过程划分为小蕾期、中蕾期、大蕾期、初开期、盛开期、初萎期和萎蔫期7个阶段；采用单因子实验对蕾径、茎粗以及断面直径与脱落力的关系进行了研究,发现茎粗与花蕾脱落力关系最为密切,相关性R2为0.1216,依次是蕾径和断面直径,相关性R2分别为0.0409、0.0369；以脱落力为依据,将蜡梅中蕾期花蕾分为4组,即Ⅰ：ON<脱落力<1.4N,Ⅱ：1.4≤脱落力<2.8N,Ⅲ：2.8≤脱落力<4.2N,Ⅳ：脱落力≥4.2N。(3)CpEXP1基因在蜡梅中的表达及其与扩张蛋白活性、离层形成相关性分析采用实时荧光定量PCR技术对蜡梅不同组织、不同开花阶段以及不同脱落力花梗中CpEXP1基因的表达进行了分析。结果表明,cpEXP1基因的表达量存在明显的时空特异性。其中在花器官的表达量明显高于营养器官。11个组织中CpEXP1基因的表达由高到低依次是雄蕊、内花被片、雌蕊、全花、中花被片、外花被片、成熟叶片、根、茎、子叶、幼叶；在花发育不同阶段分析中,萎蔫期花蕾中未提取到RNA,其余6个阶段中CpEXP1基因的表达也存在差异。表达量由高到低依次是：初开期、盛开期、大蕾期、中蕾期、初萎期、小蕾期；在不同脱落力下的花梗分析中,自然脱落花梗中CpEXP1基因的表达量最高,依次是：A(0N<脱落力<1.4N)、D(脱落力≥4.2N)、(2.8≤脱落力<4.2N)、B(1.4≤脱落力<2.8N)。通过对不同脱落力下的花梗中扩张蛋白活性的测定,发现扩张蛋白的活性与CpEXP1基因的表达存在正相关。采用查狄伦测力计以及蛋白体外重组法对瓶插蜡梅花梗脱落力和蛋白活性进行了研究,同时采用石蜡切片法对花梗离层的形成进行了观察。结果表明：1)脱落力与落蕾量呈负相关,与花梗离层发育正相关,脱落力可以作为离层发育阶段的划分依据；2)在脱落过程中,CpEXP1基因的表达及其产物主要在蜡梅花蕾离层发育后期起作用。在瓶插前期,扩张蛋白活性和cpEXP1基因的表达量都稳定在相对较低的水平,脱落力下降和离层的发育也相对缓慢。到了后期,该基因的表达和蛋白活性迅速增强,此时脱落力显着下降,离区细胞严重解体并导致离区断裂。(4)cpEXP1基因植物表达载体构建及在拟南芥中的表达根据NCBI登录的核苷酸序列,克隆了蜡梅CpEXP1基因的cDNA编码框全长,并构建了该基因的植物表达载体CpEXP1-2301G.通过花序浸润法转化拟南芥,获得转基因拟南芥T2代。和野生型相比,转基因拟南芥的花序和叶片长度、叶形指数、叶表绒毛密度均较野生型增加,而叶宽变化不明显。转基因植株叶片边缘反卷、畸形,叶片枯萎期、花期以及果实成熟期也均较野生型提前。果柄脱落力测定发现,转基因植株成熟果荚果柄处脱落力较野生型明显降低。表明CpEXP1基因的表达与形态建成、生长发育周期以及脱落密切相关。(5)蜡梅CpEXP1基因启动子的克隆、生物信息学及表达分析利用hiTAIL-PCR法分离得到了长度为2521bp的CpEXP1基因启动子区序列CpEXP1-pro.该启动子除具有启动子基本元件外,还含有多种光应答元件、高温及低温胁迫响应元件、水杨酸相应元件以及与种子和胚乳特异表达相关的元件。成功构建了植物表达载体PB1121-CpEXP1-pro,采用农杆菌介导法将其转入烟草进行瞬时表达,检测到该启动子能够驱动GUS基因的表达。将CpEXP1-pro启动子导入拟南芥中。GUS染色发现,在种子萌芽期和开花结实期该启动子活性最强,子叶期以及真叶幼苗期未检测到GUS活性；叶片染色发现该启动子随着叶片成熟衰老表达活性逐渐增强,尤其在老叶叶柄处活性最强；在果荚发育前期,GUS活性最强,随后逐渐降低。当果荚成熟时仅在果柄处检测到活性。表明CpEXP1-pro启动子的启动具有时空特异性,推测该启动子与种子萌发、果实膨大、叶片以及果实脱落密切相关。CpEXP1基因在蜡梅中的定量分析结果、转化拟南芥的表达以及启动子的功能分析表明,CpEXP1基因的表达具有时空特异性,该基因的表达与种子萌芽、形态建成、生长发育周期以及脱落有密切关系。
卢士英[8]2007年在《海产品中大田软海绵酸快速检测方法研究》文中认为食物中毒性海洋贝(藻)毒素由海洋中的某些有毒藻类产生后常通过食物链蓄积于海洋贝类、蛤类和螺类等体内,进而引起海产品食物中毒,国内外由于误食有毒海产品而引发中毒的事件时有发生,严重影响了人们的身体健康和对海产品的开发利用。贝毒素的种类很多,对不同毒素世界各国都建立了严格的检验制度,并建立了相应的检测方法和手段。我国对腹泻性贝毒的主要的致病因子—大田软海绵酸(Okadaic Acid,OA)的研究起步较晚,特别是检测方法的研究还尚属空白。为此,本研究将OA与载体蛋白偶联后免疫Balb/c小鼠,通过细胞融合技术建立杂交瘤细胞,并利用小鼠腹水方法大量生产单克隆抗体,对其特性进行充分研究后建立了直接和间接竞争抑制ELISA方法、此法操作简单,灵敏快速,同时利用高效液相色谱串联质谱法建立了海产品中OA的化学仪器检测方法。本文建立的两类检测方法对同一样品的检测具有较好的相关性,能够满足我国进出口海产品中OA限量检测需要。另外,探讨单链抗体在海洋生物毒素检测中的应用,以鼠源单克隆抗体可变区引物扩增并克隆了抗OA单链抗体基因,与抗石房蛤毒素(Saxitoxin,STX)单链抗体基因(本课题组制备)进行了串联表达,表达的融合蛋白具有良好的反应原性。为利用融合单链抗体建立可同时筛检3种海洋生物毒素的快速检测方法(国家自然基金资助项目,编号:30671762)的研究奠定基础。
霍方珍[9]2007年在《抗盐酸克伦特罗单链抗体的高效表达及免疫学活性研究》文中研究说明根据单克隆抗体可变区的保守序列设计引物,经PCR从分泌抗盐酸克伦特罗单克隆抗体杂交瘤细胞株中克隆得到了抗盐酸克伦特罗的单链抗体基因片段。将CL ScFv与pMD18-T连接,送上海生工测序。在NCBI网站Blast数据库中分析测序结果。经expasy网站GRO4预测所得序列的二级结构和理化性质。构建目的片段的原核表达基因工程菌CL ScFv-pET-22b-DE3和真核表达基因工程菌CL ScFv-pPIC9-GS115,分别利用IPTG和甲醇诱导表达目的蛋白。通过偶氮化法将CL与BSA偶联构建检测抗原。以Protein-L作为二抗,通过间接ELISA法检测表达的目的蛋白具有较高的免疫学活性。
郭微[10]2012年在《磁性粒子表面修饰及其在功能性小分子作用组学研究中的应用》文中指出本文介绍了以磁性粒子为载体,通过其表面的化学基团分别连接天然产物石杉碱甲（HupA）和二腺苷四磷酸（Ap4A）,经过磁分离,分别从噬菌体cDNA展示库和哺乳动物的脑组织裂解液里筛选HupA的靶点,以及从原核生物细胞裂解液和真核生物组织裂解液里筛选Ap4A的靶点的研究。通过毛细管电泳技术分析了筛选出的特异性噬菌体与HupA的结合,又通过表面等离子共振技术验证了经体外克隆表达的筛选到的特异性噬菌体基因所在蛋白与HupA的结合。本论文首先采用化学共沉淀的方法,以用乳酸聚合而成的醇酸聚合物为高分子模板,制备出表面带有羧基的磁性粒子。通过羧基与其它化学基团的反应,可以有效地连接各种生物活性分子或药物，且连接后的磁性粒子可以稳定存在于水溶液中并具有顺磁性，因而在生物医学分离等领域具有潜在的应用价值。功能性小分子,特别是天然产物,是现代医药的主要来源,在帮助人类战胜病魔的过程中,发挥着举足轻重的作用。根据天然产物的来源我们往往可以判断出它们的功能,而且在一些疾病模型上也部分验证了其治疗作用,但大多天然产物没有明确的分子靶点，有些作用机制尚不清楚，这就为寻找和合成天然产物的类似物或替代品或更优产品,以及进一步揭示疾病的病因等造成一定的困难。因而结合已有的药物靶点筛选技术,建立更行之有效的天然产物靶点筛选方法以找到其可能的未知作用靶点,成为加速现代医药进程的关键步骤。本论文首先将我国传统中草药蛇足石杉的有效成分Hup A连接在磁性粒子的表面,分别从噬菌体cDNA展示库和哺乳动物脑组织裂解液中进行靶点筛选。通过几轮磁生物淘洗,亲和筛选出二种重复出现的对Hup A特异性结合的噬菌体。通过PCR、基因测序和序列比对,在基因库中找到特异性噬菌体展示基因所在的蛋白,并通过毛细管电泳技术检测了两种特异性噬菌体以及一种非特异性噬菌体与Hup A的体外结合,结果表明筛选出的两种特异性噬菌体和Hup A之间具有一定的结合,而非特异性噬菌体与Hup A基本没有结合,从而排除了筛选到的噬菌体是磁性粒子非特异性吸附的结果的可能性。再通过原核表达的方法,对其中一种特异性噬菌体展示基因所在的功能性蛋白-线粒体NADH脱氢酶subunit1进行了体外表达及纯化,并通过表面等离子共振技术检测了纯化后的蛋白与Hup A之间的结合,得到了二者之间的结合常数,说明二者之间确实存在一定的相互作用。通过真核组织裂解液的筛选,又一功能蛋白mitochondria ATP synthase被重复筛选出来。所有这些结果,再结合他人关于Hup A功能的研究,在很大程度上说明Hup A很可能通过对神经细胞线粒体功能的调节来治疗阿尔茨海默症(AD),而线粒体的某些功能蛋白,比如NADH脱氢酶subunit1和ATP synthase则有可能成为Hup A的新的作用靶点。具体地说,通过与这些酶相互作用,Hup A很可能作为他们的激动剂改善其活性,从而促进氧化呼吸链的电子传递,增加ATP的产生和能量的新陈代谢,来满足AD以及其它神经退行性疾病病人的受损神经元对于能量的需求。除了Hup A以外,我们还在体外化学合成了带有生物素的Ap4A,并将其连接到表面包被有链霉亲和素的磁性粒子上。同样通过磁生物淘洗,分别从大肠杆菌细胞和哺乳动物组织裂解液里筛选Ap4A的结合蛋白。对于原核筛选来说,一个特异性的蛋白条带在六次筛选过程中均被重复筛选到；而对于真核筛选来说,4个特异性的蛋白条带被重复筛选到。经质谱鉴定,Ap4A的已知靶点GroEL被筛选出来。这不仅表明磁生物淘洗方法在功能性小分子靶点筛选中的可行性,而且加大了其它被筛选出的蛋白,特别是IMP dehydrogenase和部分真核热休克家族蛋白(Hsp)成为Ap4A未知靶点的可能性。可以说本部分实验是磁性粒子在天然产物靶点筛选中的又一个尝试性的应用,也是对将此方法应用在Hup A靶点筛选上的延伸和验证。两部分实验充分证明,通过与噬菌体展示技术和质谱基础上的蛋白质组学技术相结合,以磁性粒子为基质的亲和淘洗色谱将可能成为鉴定功能性小分子,特别是天然产物的未知靶点的一种新的有效的方法,为进一步研究功能性小分子的分子作用机制,体外合成天然产物的类似物以及揭示某些疾病的病因和病理学特征等提供一定的理论依据和基础。
参考文献：
[1]. 大腹园蛛组织蛋白酶B相关cDNA Avg1克隆及表达研究[D]. 卢士英. 东北林业大学. 2004
[2]. 大腹园蛛Avg1 cDNA的克隆和序列分析[J]. 任洪林, 柳增善, 卢士英, 潘风光. 中国生物化学与分子生物学报. 2004
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