王沂芹, 袁发焕[1]2002年在《大鼠金属蛋白酶组织抑制物-1反义基因TA载体构建及其在肾小球系膜细胞表达的实验研究》文中认为目的 :构建能在真核细胞表达的含大鼠金属蛋白酶组织抑制物 1(tissueinhibitorofmetalloproteinase 1,TIMP 1)反义基因片段的TA克隆载体 ,并在体外培养的肾小球系膜细胞表达 ,为进一步研究TIMP 1反义基因片段抑制肾组织纤维化的作用奠定基础。 方法 :用RT PCR法扩增大鼠TIMP 1cDNA片段 (313bp) ,并将其反向克隆到真核表达载体pCR 3.1中 ,用脂质体将大鼠TIMP 1反义基因片段导入培养的大鼠肾小球系膜细胞 ,半定量RT PCR法检测系膜细胞TIMP 1表达的变化。 结果 :①用限制性内切酶鉴定TIMP 1cDNA片段插入方向 ,测序结果证实扩增片段为目的片段 ;②导入TIMP 1反义基因后 ,肾小球系膜细胞内TIMP 1表达明显减少。 结论 :①成功地构建了含大鼠TIMP 1反义基因片段的TA克隆载体 ;②该载体能在体外培养的系膜细胞中表达 ;③TIMP 1反义基因片段能有效地阻抑培养的大鼠系膜细胞中TIMP 1的表达。
王沂芹[2]2001年在《大鼠TIMP-1反义基因TA载体构建及其在肾小球系膜细胞表达的实验研究》文中进行了进一步梳理目的：构建能在真核细胞表达的含大鼠TIMP-1（tissue inhibitor ofmetalloproteinase-1）反义基因片段的TA克隆载体，并在体外培养的大鼠肾小球系膜细胞表达，为在体内进一步研究TIMP-1反义基因片段抑制大鼠肾组织纤维化的作用奠定基础。 方法：用RT-PCR法扩增大鼠TIMP-1cDNA片段（313bp），并将其反向克隆到真核表达载体pCR3.1中，用脂质体将大鼠TIMP-1反义基因片段导入培养的大鼠系膜细胞，半定量RT-PCR法检测系膜细胞TIMP-1表达的变化。 结果：1．用我们设计的一对引物，RT-PCR法特异地扩增出大鼠TIMP-1cDNA片段（313bp）并与真核表达载体pCR3.1相连。限制性内切酶鉴定TIMP-1cDNA片段反向插入载体，测序结果亦证实扩增片段确为目的片段。 2．原代培养方法培养大鼠肾小球系膜细胞，免疫细胞化学染色结果示所培养细胞actin、vimentin、desmin染色均阳性，而Ⅷ因子染色阴性，证明我们所培养的细胞确为系膜细胞。 3．分别提取转导入空载体及反义TIMP-1载体的系膜细胞的DNA，用载体序列上游及下游特异引物PCR法扩增，空载体组得到196bp的产物，反义TIMP-1载体组得到509bp的产物。 4．半定量RT-PCR法计算各组培养的大鼠系膜细胞TIMP-1mRNA的表达量，发现：①在无rat IL-6刺激下，空白对照组和空载体组TIMP-1表达量无显着差异；这两组经rat IL-6刺激后，TIMP-1表达量均有显着增高，两组增高程度无显着差异；②TIMP-1反义基因载体组在用rat IL-6刺激后，TIMPJ的表达量虽有所增加，但增加幅度显着低于经 rat IL－6刺激的空白组和空载体组。 结论：1．成功地构建了含大鼠TIMP反义基因片段的TA克隆载体。 2．该载体能在体外培养的系膜细胞中表达。 3．TIMP反义基因片段能有效地阻抑培养的大鼠系膜细胞中TIMP的表达。
参考文献：
[1]. 大鼠金属蛋白酶组织抑制物-1反义基因TA载体构建及其在肾小球系膜细胞表达的实验研究[J]. 王沂芹, 袁发焕. 肾脏病与透析肾移植杂志. 2002
[2]. 大鼠TIMP-1反义基因TA载体构建及其在肾小球系膜细胞表达的实验研究[D]. 王沂芹. 第叁军医大学. 2001
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