【关键词】环介导等温扩增 食源性致病菌 快速检测
【中图分类号】RA 【文献标识码】A 【文章编号】1672-5085（2013）42-0049-02
2000年日本学者Notomi在杂志上公开了一种新的适用于基因诊断的恒温核酸扩增技术，即环介导等温扩增技术，简称LAMP。LAMP技术是在65℃恒温下进行核酸快速扩增，利用两条特异性内引物和两条特异性外引物识别靶基因上的六个区域，其DNA聚合酶具有链置换活性，几十分钟即可完成核酸扩增。该技术要求的设备简单、操作方便、肉眼即可判断结果，且所需时间短、特异性好、灵敏度高，适合基层普及推广，因此受到了世卫组织WHO、各国学者和相关政府部门的关注，国外LAMP技术已广泛应用各种病毒、细菌、寄生虫等引起的疾病检测、食品化妆品安全检查及进出口快速诊断中。
1 LAMP技术的特点
LAMP反应不需要预先进行双链 DNA 的变性，恒温下即能实现扩增反应，没有因温度循环造成的时间损失。LAMP扩增反应1 h内即可完成。环引物的添加使得时间更缩短到原来的1/2，20 ～30 min 即有扩增产物可被检测。这对于快速诊断十分重要。 与传统PCR 相比，LAMP 能从低拷贝数样品中扩增出目的基因，检测率比传统PCR高出 1～2 个数量级，LAMP法和实时PCR敏感性相同，适用于低拷贝数样品的检测。LAMP法中靶序列的 6 个区域与4条特异性引物均需匹配，否则核酸不能扩增，故特异性极高。LAMP法扩增结果可用肉眼观察浊度或添加荧光染料观察颜色变化来判定，不需要对产物进行电泳，使结果可视化，操作更简单。
2 LAMP技术在我国食源性致病菌检测中的应用
病原微生物引起的食源性疾病是影响食品安全的主要因素之一,常规食品微生物检测方法包括反复增菌、菌落分离及多种生化和血清学鉴别实验，检测周期长。PCR技术检测成本高，难以应用于现场应急处置及基层普及推广。LAMP技术以其特异性强、灵敏度高、速度快、成本低等已被用于食品致病菌检测的研究。LAMP 将成为可以替代 PCR 的核酸扩增的新技术。
2.1在阪崎肠杆菌检测中的应用
阪崎肠杆菌是乳制品中近几年新发现的一种致病菌。由其引发的婴儿、早产儿脑膜炎、败血症及坏死性结肠炎散发和暴发的病例已在全球相继出现。在某些情况下，由阪崎肠杆菌引发疾病而导致的死亡率可达40%～80%。我国《奶粉中阪崎肠杆菌检测方法》行业标准建立了阪崎肠杆菌的改进的传统检测方法、普通PCR方法和荧光PCR方法。目前，环介导等温扩增法检测液体乳中阪崎肠杆菌的研究不多，一直以来专家学者希望研究一种能快速检测阪崎肠杆菌的方法。董鑫悦等[1]建立的检测乳中阪崎肠杆菌的 LAMP 方法，操作简便，不需要复杂的仪器，反应过程只需水浴锅即可，以阪崎肠杆菌的 OmpA序列为靶基因，设计特异性引物。优化并建立 LAMP 检测乳中阪崎肠杆菌的方法。结果表明，LAMP 检测阪崎肠杆菌纯培养物的灵敏度为 37 cfu / mL，其灵敏度是 PCR 方法的 10 倍。人工污染阪崎肠杆菌灭菌乳的检测限为43cfu / mL。对 23 株致病菌进行特异性实验，特异性良好。LAMP 引物的设计是针对 6 个区域设计的，特异性强; 由于添加了环引物，使得LAMP 反应时间大大减少。并且对于样品处理方法进行了选择优化，缩短了模板制备的时间，使得整个实验过程能在 2h 内完成。
2.2在志贺氏菌检测中的应用
由志贺氏菌引起的细菌性痢疾是发展中国家的常见病、多发病，严重危害着人们的健康，尤其是儿童的生长发育，也是发达国家腹泻病的主要病原。目前，食品中志贺氏菌检验标准方法为传统的分离培养法，所需时间长，不适于突发食品安全事件的快速检验。马晓燕等[2] 以志贺氏茵侵袭性质粒抗原H基因(ipaH)作为靶序列，设计引物,优化Mg2+浓度、Bst酶浓度等反应条件，建立LAMP反应体系。
期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆确定了环介导等温扩增技术检测志贺氏茵的适宜反应条件，马晓燕等[2] 确定Mg2+浓度在0.1～0.5mmol／L时均反应，随Mg2+浓度的增加反应条带的亮度逐渐增加，综合反应结果，选择0.3mmol／L为Mg2+的最适添加浓度；0.3～0.7ul的Bst酶均可支持反应的进行，随Bst酶添加量的增加反应条带的亮度逐渐增加，综合反应结果，反应中Bst酶适宜添加量为0.5ul；选择3ul为最适dNTPs添加量；反应温度对试验的影响不是很明显，60～65℃下都能反应；随着反应时间的增加条带越来越明亮，最短反应所需时间为20min。检测志贺氏茵的灵敏度为62 cfu／ml。可在2h内完成对志贺氏菌的检测，且仪器要求简单，为食品中志贺氏菌快速检测构建了一个技术平台。
2.3 在单核细胞增生李斯特氏菌检测中的应用
单核细胞增生性李斯特氏菌分布于自然界和人、动物粪便，可通过食物中毒引起全身和局部感染，从而导致骨髓炎、产褥感染等疾病，因此，单核细胞增生性李斯特菌引起的食物中毒越来越受到人们的关注。单核细胞增生性李斯特氏菌检测已列入食品安全风险监测项目。李秀敏等[3] 以hlyA基因作为靶基因设计引物，确定了环介导等温扩增技术检测单核细胞增生性李斯特氏菌的最适反应条件。最适Mg2+浓度为5mmol／L；1.0ul的Bst酶为最适添加量；最短反应所需时间为20min；59～65℃下都能反应，63℃时条带最亮。该方法检测单核细胞增生性李斯特氏茵的灵敏度为4.2CFU／ml。
2.4在椰毒假单胞菌检测中的应用
椰毒假单胞菌存在于发酵的玉米、糯玉米、黄米、高梁米、变质银耳以及周围环境中，它是酵米面及变质银耳中毒的病原菌。发酵玉米面制品、变质鲜银耳及其它变质淀粉类制品是引起中毒的主要原因，该菌引起的食物中毒在国内外早有报道。由于缺乏特效的解毒措施，因此急需建立一种快速、灵敏、特异的检测方法。马晓燕等[4] 根据公布的椰毒假单胞菌 16S～23S rRNA基因序列设计引物，建立了 LAMP 反应体系，椰毒假单胞菌的检出限为 5.4CFU/mL，是 PCR 方法检测灵敏度的 1000 倍，人工污染银耳样品中的椰毒假单胞菌的检出限为 76CFU/g，样品中椰毒假单胞菌的检测过程( 包括 DNA 提取、LAMP 和电泳) 可在 2h 内完成，因此 LAMP技术检测食品中的椰毒假单胞菌，具有很好的应用前景。所需设备简单，检测快速，费用低等特点，适合基层实验室推广使用，
2.5在产气荚膜梭菌检测中的应用
产气荚膜梭菌广泛分布于人畜粪便、土壤、污水等外环境中。产气荚膜梭菌产生的肠毒素是引起食物中毒的主要因素。中毒食品多为生畜肉、禽肉、鱼及其它蛋白性食品。目前产气荚膜梭菌引起的食物中毒的研究多集中在其产生的肠毒素的检测上。而刘哲等[5] 建立的环介导等温扩增技术快速检测产气荚膜梭菌的方法是以产气荚膜梭菌（ATCC13124）的α毒素全基因序列为保守序列，设计内、外、环引物，肉眼观察白色沉淀并判断检测结果。 结果显示LAMP 检测产气荚膜梭菌的灵敏度为 2.92×102CFU/mL，人工污染产气荚膜梭菌的全脂乳的检测限为 15.7 CFU/mL，耗时仅 1 h。该方法灵敏度是 PCR 的1000倍。刘哲等[5]对Mg2+浓度、dNTPs 浓度、 反应温度、反应时间、引物浓度、酶浓度等条件进行了优化，确定反应体系中最适Mg2 +浓度为1.0 mmol/L， 最适dNTPs 浓度为 0.4 mmol/L，最适外引物、内引物和环引物的浓度比为1∶6∶3，在 62 ℃水浴锅中的最短反应时间为20 min。该方法适合基层医疗单位和食品检测部门的推广和应用。
3 LAMP产品的开发
为了使LAMP技术更适合临床和基层检测，研究人员对LAMP扩增反应体系不断优化，改进和发展，探讨最佳反应条件，在检测模板拓展、反应速度、产物鉴定方法等方面进行了更深入的研究，使得LAMP技术的优点更加突出，缺点得到了很大的改善，已经被用来研究开发了多种检测产品，现在国外开发的LAMP检测产品试剂盒主要集中在病毒和转基因食品检测领域。LAMP技术在我国食品微生物检验领域的运用已趋成熟，已有开发成功并申请了专利的检测试剂盒 [6-8]。
LAMP方法灵敏度高，一旦开盖容易形成气溶胶污染，假阳性问题比较严重，因此在进行试剂盒的研发过程中采用实时浑浊仪，不要把反应后的PCR管打开。LAMP产品在临床诊断中是不需要特殊仪器的，但临床使用的成品试剂盒有赖于和国内拥有毒株的老师合作开发针对中国国情的疾病LAMP引物，引物设计要求比较高，有些疾病的基因可能不适合LAMP方法。在研发过程中涉及引物的选择，引物浓度的调整，及反应温度和时间的优化。
参考文献
[1］董鑫悦，满朝新，卢雁，等．环介导等温扩增法快速检测乳中阪崎肠杆菌［J］.食品工业科技，2013，34( 5) :318－320，357．
[2］马晓燕，张会彦，宋明明，等．环介导等温扩增技术快速检测志贺氏菌的研究［J］.安徽农业科学，2011，39(14) :8191－8193，8240．
[3］李秀敏，王羽，张先舟，等．环介导等温扩增技术快速检测单核细胞增生性李斯特氏菌的研究［J］.安徽农业科学，2010，38(24) :13122－13123，13134．
[4］马晓燕，张蕴哲，王羽，等．环介导等温扩增技术快速检测椰毒假单胞菌的研究［J］.食品工业科技，2013，34( 3) :321－324．
[5］刘哲，马晓燕，张会彦，等．环介导等温扩增技术快速检测产气荚膜梭菌的研究［J］.中国食品学报，2012，12( 4) :168－173.
[6］石 磊,曹以诚,杜正平,等.基于环介导等温扩增技术的沙门氏菌基因快速诊断试剂盒[Ｐ].ＣＮ200610035692.9,2007-12-05.
[7］石 磊,曹以诚,杜正平,等.环介导等温扩增技术的副溶血弧菌基因快速诊断试剂盒[Ｐ].ＣＮ200610035690.Ｘ,2007-12-05.
[8］石 磊,曹以诚,杜正平,等.环介导等温扩增技术的大肠杆菌0157基因快速诊断试剂盒[Ｐ].ＣＮ200610035691.4,2007-12-05.
论文作者:李铭新
论文发表刊物:《中外健康文摘》2013年第42期供稿
论文发表时间:2014-4-25
标签：引物论文; 杆菌论文; 技术论文; 李斯特论文; 浓度论文; 快速论文; 特异性论文; 《中外健康文摘》2013年第42期供稿论文;