高丽芳[1]2004年在《RNAi沉默STAT3对前列腺癌及黑色素瘤的生长抑制作用》文中提出前列腺癌多发生远离尿道的周边区，出现排尿困难的主动就诊者多为失去根治机会的晚期病例，或已经发生了骨肺转移。1989年起，美国应用血清PSA进行全国性的前列腺癌筛查以来，实现了前列腺癌的早期发现与早期治疗。1996年的美国资料表明，前列腺癌发病率已居男性恶性肿瘤首位，死亡率仅次于肺癌位居第二。传统的看法认为，中国是前列腺癌的极低发国家，但是，近20年来我国随着人口老龄化，生活方式与饮食结构的改变。临床前列腺癌的发病率呈逐年增长的趋势，并且，中晚期前列腺癌病例超过72% 。本论文是在“前列腺疾病防治研究中心”完成。“中心”应用血清PSA对长春市15 000余名50岁以上男性进行了前列腺癌集团筛查，前列腺癌发现率为1.7%，其中，中晚期前列腺癌占42%，早期前列腺癌接受了根治手术者只占13.1%。可见，前列腺癌也是威胁我国老年男性健康的严重疾病之一。前列腺癌治疗存在很多难题。除早期前列腺癌可获得根治性治疗的机会以外，多选用内分泌治疗，如去势或药物阻断雄激素作用等治疗方式。内分泌治疗后可取得立竿见影的效果，
常亮[2]2016年在《RNA干扰介导非小细胞肺癌ADAM9和Stat3基因沉默的研究》文中提出背景:肺癌是目前发病率和死亡率最高的恶性肿瘤,且发病率呈持续增长趋势,严重威胁人类健康,其中以非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)流行最广,约占肺癌总数的80%,其发病和致死的主要原因是癌细胞转移,但目前对NSCLC转移机制尚不清楚,使得对NSCLC的预防和治疗更加困难。目前对NSCLC的治疗主要采用手术、放疗和化疗,但多数患者确诊时已是晚期,失去了手术治疗的最佳时机而以化疗为主。化疗虽然能改善晚期NSCLC患者生存期限,但由于其没有细胞选择性,对正常细胞的杀伤同样严重,会导致患者免疫力下降并产生严重并发症。因此,研究潜在NSCLC治疗靶点和治疗策略迫在眉睫。近几年对分子靶向治疗的研究日益深入,并逐渐应用于癌症的临床治疗,取得了较好的疗效,为NSCLC的治疗提供了新的方向。去整合素和金属蛋白酶家族(A disintegrin and metalloproteinases,ADAMs)是一类锌依赖性I型跨膜蛋白,具有蛋白水解酶活性和细胞粘附功能,能水解多种蛋白的胞外功能区,使之脱落,从而参与调节相关信号转导途径。此外,ADAMs还参与降解胞外基质、细胞间及细胞与基质间粘连、细胞融合等过程,并在精卵结合、伤口愈合及肿瘤发生和转移等病理生理过程中发挥重要作用。ADAM9作为ADAMs家族重要成员,可高表达于多种癌变组织和细胞中,并参与肿瘤的发生发展和转移过程。研究发现,ADAM9显着表达于NSCLC患者中,并可导致患者生存期缩短;ADAM9过表达可增加NSCLC细胞粘附和侵袭能力;通过RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术使ADAM9基因沉默可抑制腺样囊性癌细胞生长和转移;RNAi介导ADAM9基因沉默可抑制A549细胞增殖、迁移和侵袭,诱导细胞凋亡。研究表明,ADAM9参与表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)配体外功能区酶解脱落及裂解Delta-likel等过程。以上研究结果揭示,ADAM9可作为NSCLC治疗的潜在靶点。信号转导与转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription,Stat3)是STAT家族重要成员,多种细胞因子、生长因子均可激活Stat3,并参与相关信号转导。研究发现,Stat3活化后可参与调节细胞生长、凋亡及细胞周期等;Stat3参与多个癌症相关的酪氨酸激酶信号途径,并高表达于多种肿瘤组织和细胞中,如前列腺癌、乳腺癌、NSCLC和卵巢癌等。Stat3的活化有利于诱导肿瘤细胞增殖、抑制细胞凋亡,从而使癌症恶化;而通过RNAi或小分子抑制剂抑制Stat3的表达,可抑制肿瘤细胞增殖、侵袭,诱导细胞凋亡;且在对NSCLC的研究中发现,下调Stat3的表达可抑制肿瘤生长。揭示Stat3可能是NSCLC治疗的潜在靶点。EGFR具有酪氨酸蛋白激酶活性,研究表明,EGFR过表达可导致细胞过度生长和恶性肿瘤,Stat3是STAT家族肿瘤细胞和癌组织中表达最活跃的转录因子。研究证明,应用EGFR单克隆抗体治疗后,抑制Stat3的磷酸化,细胞增殖、侵袭能力降低,促进细胞凋亡,这些结果表明EGFR-STAT3信号转导途径作用于肺癌细胞增殖过程中起到重要作用。目前实验研究表明JAK-STAT3信号转导通路和ADAM9-EGFR信号转导通路对NSCLC发生发展起到促进作用,两条信号转导通路在肿瘤的发生发展中存在信号对答。目的:探讨JAK-STAT3与ADAM9-EGFR信号转导通路在NSCLC中的关系方法:构建ADAM9 sh RNA、Stat3 sh RNA以及对照组的慢病毒载体,并转染至293T细胞,从而分别获得表达ADAM9 sh RNA慢病毒(Lv/sh-ADAM9)、Stat3 sh RNA慢病毒(Lv/sh-Stat3)或非沉默sh RNA慢病毒(Lv/sh-NC),用慢病毒Lv/sh-Stat3、Lv/sh-ADAM9、Lv/sh-NC单独感染A549细胞,或Lv/sh-Stat3和Lv/sh-ADAM9联合感染细胞。分别采用RT-q PCR技术和WB方法检测细胞中Stat3和ADAM9 m RNA和蛋白表达水平。通过CCK-8方法检测A549细胞增殖水平。TUNEL方法检测细胞凋亡;检测细胞caspase-3、caspase-8和caspase-9活性。细胞划痕实验检测细胞迁移能力。Transwell方法分析细胞侵袭水平;检测细胞MMP-2和MMP-9蛋白表达水平。雄性BALB/c裸鼠皮下注射A549细胞以构建NSCLC荷瘤裸鼠模型,并对荷瘤小鼠注射慢病毒Lv/sh-NC、Lv/sh-ADAM9、Lv/sh-Stat3或Lv/sh-ADAM9和Lv/sh-Stat3联合进行治疗,对肿瘤体积及重量进行测量;通过TUNEL方法检测肿瘤细胞凋亡水平。结果:所构建慢病毒载体经PCR和测序鉴定无误;重组质粒可成功转染至293T细胞中;慢病毒Lv/sh Stat3和Lv/sh ADAM9可分别或者共同感染A549细胞。RNAi介导的Stat3或ADAM9基因沉默可分别抑制A549细胞Stat3或ADAM9 m RNA和蛋白表达,二者基因共沉默同样可抑制Stat3和ADAM9 m RNA和蛋白表达。RNAi介导的Stat3或ADAM9基因沉默均可抑制A549细胞的体外增殖,而二者基因共沉默在抑制细胞增殖上显示出协同效应。RNAi介导的Stat3或ADAM9基因沉默均可诱导A549细胞的体外凋亡,二者基因共沉默对细胞凋亡的诱导作用更为显着。RNAi介导的Stat3或ADAM9基因沉默均可抑制A549细胞体外迁移和侵袭,而二者基因共沉默对细胞侵袭显示出协同抑制作用。RNAi介导的Stat3和ADAM9基因共沉默可抑制MMP-2和MMP-9蛋白表达,与细胞迁移和侵袭能力的变化一致,揭示MMP-2和MMP-9参与A549细胞的体外迁移和侵袭。RNAi介导的体内Stat3或ADAM9基因沉默可抑制NSCLC肿瘤组织生长,二者基因共沉默对肿瘤组织生长的抑制作用更强。结论:ADAM9和Stat3基因共沉默可协同抑制体外NSCLC增殖、迁移和侵袭能力,并诱导细胞凋亡,能够协同抑制体内肿瘤生长。JAK-STAT3与ADAM9-EGFR信号转导通路在NSCLC发生发展过程中起协同作用。Stat3不是JAK-STAT3与ADAM9-EGFR两条信号转导通路下游的共同关键节点。
李相良[3]2008年在《SiRNA技术沉默Stat3对膀胱肿瘤的生长抑制作用》文中研究表明目的:研究Stat3基因沉默在膀胱癌细胞增殖凋亡中的作用并探讨其相关机制。方法:(1)应用免疫组织化学染色方法检测膀胱移行细胞癌标本中Stat3蛋白表达情况。(2)以Stat3己知序列为靶点,构建能够稳定表达Stat3 siRNA的重组质粒。(3)应用真核细胞转染技术转染膀胱癌细胞株T24,观察Stat3的表达及对细胞凋亡的影响。(4)复制裸鼠膀胱癌皮下移植瘤模型及膀胱癌原位移植瘤模型,应用沙门氏菌运载特异性siRNA-Stat3表达载体对膀胱肿瘤作用观察。结果:(1)Star3的表达随膀胱肿瘤病理分级的等级的升高而增加。(2)成功构建pSilencer~(TM)neo 3.1-H1-Stat3 siRNA表达质粒。(3)体外实验证明该质粒对膀胱癌细胞具有增殖抑制及促进凋亡的作用。(4)体内实验证明Si-Stat3具有明显抑制肿瘤的生长作用。(5)减毒沙门氏菌可以运载质粒到达深部肿瘤并可起到抑制肿瘤生长的作用。结论:采用Stat3特异性siRNA基因表达系统对膀胱癌的治疗取得了显着效果;并首次以减毒鼠伤寒沙门氏菌为siRNA-Stat3运载体进行膀胱肿瘤的有效靶向治疗。本研究所采用的技术路线及实验结果在国内外均未见报道。
李静[4]2008年在《RNA干涉技术沉默STAT3基因抗人原发性肝癌的体内外实验研究》文中提出目的:探讨RNA干涉技术沉默STAT3基因抗人原发性肝癌的效应,为肝癌的基因治疗提供有效靶点及技术。方法:以基因重组技术构建pSilencer 3.0-H1-siRNA-STAT3重组质粒;应用真核细胞转染技术转染人原发性肝癌细胞株进行体外研究;建立裸鼠人原发性肝癌皮下移植瘤模型,采用瘤内注射联合电转染法将重组质粒导入裸鼠移植瘤内观察抑瘤作用。结果:(1)成功构建pSilencer 3.0-H1-siRNA-STAT3重组质粒。(2)体外实验证明pSilencer 3.0-H1-siRNA-STAT3重组质粒对人原发性肝癌细胞具有增殖抑制及促进凋亡的作用。(3)体内实验证明pSilencer 3.0-H1-siRNA-STAT3重组质粒具有抑制裸鼠人原发性肝癌皮下移植瘤的生长作用。结论:STAT3基因可作为肝癌基因治疗的有效靶点,应用RNAi技术沉默STAT3基因对人原发性肝癌具有显着的治疗效果。
张春福[5]2007年在《RNA干扰沉默STAT3基因抗大肠癌作用及其机制的研究》文中研究表明大肠癌是最常见的恶性肿瘤之一,传统治疗方法是以手术治疗为主,同时辅以化疗、放疗的治疗方案,虽然对Ⅰ期和Ⅱ期大肠癌有一定疗效,但仍有20%左右的患者失去手术机会,而化疗和放疗对肿瘤非特异性,且敏感性差,副作用大,效果欠佳。因此大肠癌的基因治疗一直是研究的热点。RNA干扰技术于2001年成功用于哺乳动物细胞,现在RNA干扰已经成为研究基因功能的有效方法,并有发展成为特异性治疗手段的趋势。目前,应用RNAi技术沉默STAT3基因抑制大肠癌细胞的生长,在国内外尚未见报道。本研究以基因重组技术构建pSilencer3.1-H1-siRNA-STAT3重组质粒;应用真核细胞转染技术转染人大肠癌细胞株HCT8进行体外研究;应用HCT8复制裸鼠移植大肠癌模型,应用电转染技术将pSilencer3.1-H1-siRNA-STAT3注入瘤体内观察抑瘤作用。本研究构建了pSilencer3.1-H1-siRNA-STAT3重组质粒,酶切法证明构建成功;MTT法证明pSilencer3.1-H1-siRNA-STAT3对HCT8细胞有抑制作用;流式细胞技术证实其可诱导HCT8细胞凋亡;RT-PCR与Western blot分析表明,pSilencer3.1-H1-siRNA-STAT3在mRNA水平及蛋白质水平特异性抑制了STAT3的表达;体内实验表明pSilencer3.1-H1-siRNA-STAT3可明显抑制裸鼠移植大肠癌的生长。因此,本研究表明RNAi技术沉默STAT3基因具有明显的抗大肠癌作用。
张灵[6]2006年在《以减毒沙门氏菌携带共表达siRNA-Stat3及GRIM-19质粒抗前列腺癌的体内外实验研究》文中认为目的:探讨以减毒沙门氏菌携带共表达siRNA-Stat3及GRIM-19质粒抗前列腺癌效应。方法:以基因重组技术构建共表达siRNA-Stat3和GRIM-19质粒;应用真核细胞转染技术转染前列腺癌细胞株进行体外研究;复制裸鼠前列腺癌皮下移植瘤模型并建立小鼠前列腺癌原位组织块移植瘤模型,应用减毒沙门氏菌将重组质粒带入瘤体内观察抑瘤作用。结果:(1)成功构建siRNA-Stat3和GRIM-19的共表达质粒。(2)体外实验证明共表达质粒对前列腺癌细胞具有增殖抑制及促进凋亡的作用。(3)体内实验证明共表达质粒具有协同作用抑制肿瘤的生长、浸润及转移。(4)减毒沙门氏菌可以运载质粒到达深部肿瘤并可起到抑制肿瘤生长和转移的作用。结论:减毒沙门氏菌携带Stat3特异性siRNA,联合对Stat3呈现拮抗作用的GRIM-19基因共表达系统,对前列腺癌及转移癌具有显着的治疗效果。本研究所采用的技术路线及实验结果在国内外均未见报道。RNA干涉;基因治疗
黄陈[7]2007年在《阻断STAT3信号通路对胰腺癌侵袭转移的抑制作用及其机制》文中指出1目的:探讨胰腺癌组织中信号传导和转录激活因子3 (signal transduction and activators of transcription-3, STAT3)和转移相关基因的表达情况及其与胰腺癌临床病理特征的关系;应用Janus激酶(Janus kinase, JAK)抑制剂AG490和STAT3特异性小干扰RNA表达载体阻断STAT3信号通路,探讨阻断STAT3信号通路对胰腺癌细胞侵袭转移能力的抑制作用及其可能机制。方法:⑴免疫组织化学方法检测34例胰腺癌和10例正常胰腺组织中STAT3、磷酸化STAT3 (phosphorylated STAT3, p-STAT3)、基质金属蛋白酶-2 (matrix metalloproteinase-2, MMP-2)和基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9, MMP-9)的表达。⑵细胞侵袭测定试剂盒检测人胰腺癌细胞株SW1990和CaPan-2的体外侵袭力;Western blot检测SW1990和CaPan-2细胞中STAT3、p-STAT3蛋白的表达;电泳迁移率实验(electrophoresis mobility shift assay, EMSA)检测SW1990和CaPan-2细胞中STAT3的DNA结合活性。应用AG490处理SW1990和CanPan-2细胞,细胞侵袭测定试剂盒检测细胞体外侵袭力的改变,Western blot检测STAT3、p-STAT3蛋白表达的变化,EMSA检测STAT3的DNA结合活性的变化, Western blot和RT-PCR分别检测转移相关基因蛋白和mRNA表达的变化。⑶构建叁条STAT3特异性小干扰RNA(small interfere RNA, siRNA)表达载体,并瞬时转染SW1990细胞,RT-PCR和Western blot观察STAT3 siRNA表达载体对SW1990细胞中STAT3的抑制作用。选择最为有效的STAT3 siRNA表达载体稳定转染SW1990细胞,细胞侵袭测定试剂盒和裸鼠体内急性血路转移模型观察SW1990细胞STAT3沉默前后侵袭转移能力的改变。RT-PCR和Western blot分别检测SW1990细胞STAT3沉默前后转移相关基因mRNA和蛋白表达的改变。结果:⑴免疫组化发现p-STAT3、MMP-2和MMP-9在胰腺癌组织中存在高表达,p-STAT3、MMP-2和MMP-9表达均与临床分期及淋巴结转移有关(P<0.05)。p-STAT3与MMP-2的表达呈正相关(r=0.583, P=0.000),p-STAT3与MMP-9的表达亦呈正相关(r=0.410, P=0.016)。⑵体外侵袭实验发现SW1990细胞比CaPan-2细胞具有更高的侵袭力。高侵袭力细胞株SW1990中存在p-STAT3蛋白的高表达,而低侵袭力细胞株CaPan-2中呈低表达;EMSA实验亦证实SW1990细胞的STAT3的DNA结合活性明显比CaPan-2细胞高。用AG490处理48h后,对CanPan-2细胞的侵袭力无明显影响,但可明显抑制SW1990细胞的侵袭力,且随AG490浓度升高,SW1990细胞的侵袭力抑制愈强。AG490可明显抑制SW1990细胞中p-STAT3蛋白表达和STAT3的DNA结合活性。AG490处理SW1990细胞48h后,MMP-2和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的蛋白和mRNA表达均明显下调,且其表达随着AG490浓度增大而有逐渐降低的趋势。⑶成功构建叁条STAT3 siRNA表达载体( pRNAT-STAT3 siRNA-I ,pRNAT-STAT3 siRNA-II , pRNAT-STAT3 siRNA-Ⅲ)和阴性对照表达载体pRNAT-Con。叁条STAT3 siRNA表达载体瞬时转染SW1990细胞后,STAT3的mRNA以及蛋白的表达量与未转染组相比均明显下降(P<0.05),其中pRNAT-STAT3 siRNA-II组中mRNA和蛋白的表达水平分别比未转染组下降了78.5%和71.8%。选择STAT3 siRNA表达载体pRNAT-STAT3 siRNA-II稳定转染SW1990细胞,G-418持续筛选,建立稳定表达STAT3 siRNA的长期基因沉默的细胞SW1990-RNAi-a和SW1990-RNAi-b。体外侵袭实验和体内转移实验表明SW1990-RNAi-a和SW1990-RNAi-b细胞的侵袭转移能力较SW1990亲代细胞明显下降。RT-PCR和Western blot显示SW1990-RNAi-a和SW1990-RNAi-b细胞中MMP-2和VEGF的mRNA和蛋白表达较SW1990亲代细胞均明显下调。结论:⑴p-STAT3、MMP-2和MMP-9在胰腺癌组织中存在高表达,且与临床分期和淋巴结转移有关;p-STAT3与MMP-2和MMP-9的表达呈正相关。STAT3可能通过上调MMP-2和MMP-9的表达促进胰腺癌侵袭转移,在胰腺癌发生发展中起着重要作用。⑵STAT3活性与胰腺癌细胞的侵袭力密切相关;AG490阻断STAT3活化可通过下调MMP-2和VEGF表达,抑制胰腺癌细胞体外侵袭能力。阻断STAT3信号通路可能为预防和治疗胰腺癌的侵袭转移提供一种新的策略。⑶成功构建STAT3 siRNA表达载体,并且有效抑制STAT3表达;稳定转染STAT3 siRNA表达载体能高效、特异的抑制STAT3表达,通过下调MMP-2和VEGF表达,显着抑制人胰腺癌细胞侵袭转移能力。RNAi沉默STAT3的治疗策略可能为防治胰腺癌的侵袭转移提供新的思路。
任仲喜[8]2012年在《共表达siRNA-Stat3与GRIM-19质粒对甲状腺癌细胞的抑制效应及机理探讨》文中研究表明甲状腺癌是内分泌系统最常见的恶性肿瘤，虽然绝大多数甲状腺肿瘤可以通过手术、~(131)I、抑制TSH治疗获得良好的效果，但是仍有15%左右的病人因低分化早期转移而失去治疗机会。其中髓样癌、未分化癌和鳞癌的预后则更差，且对放、化疗不敏感。另外，部分分化较好的肿瘤，因为首次手术治疗不规范而出现局部复发，再次手术的风险大大增加。因此，我们对于这类难治性甲状腺癌寻求新的治疗方法，以改善病人预后，提高生存期,非常有现实意义。STAT3是JAK-STAT信号转导途径中，Janus激酶的底物。该途径调节细胞的生长增殖，如果持续性激活，可导致细胞异常增殖与恶性转化。目前已在多种肿瘤组织中，证实有Stat3的持续高表达，应用RNAi技术沉默Stat3的表达后，发现有显着的抗肿瘤效应。GRIM-19是STAT3的特异性抑制蛋白，可与STAT3蛋白结合，抑制其转录激活功能，从而阻止细胞生长增殖、促其凋亡。在哺乳动物细胞中，RNAi并不能完全阻断基因的表达，尤其是异常高表达的基因，为了寻求更好的治疗方案以加强疗效，我们采取了siRNA-Stat3联合GRIM-19的基因治疗方法。目的：本研究观察siRNA-Stat3联合GRIM-19共表达质粒（pGRIM-19-Si-Stat3）对人甲状腺癌细胞SW579的抑制效应，并探讨其作用机制。方法：本实验分为五个组，分别为脂质体对照组（mock组）、空白质粒对照组（psi-Scramble组）、psi-Stat3组、pGRIM-19组以及pGRIM-19-si-Stat3组（pGS组）。脂质体法将各组质粒转染人甲状腺癌SW579细胞。(1)转染48h后相差显微镜下观察各组癌细胞生长情况及形态特征；（2）采用半定量逆转录PCR检测各组癌细胞Stat3和GRIM-19表达水平；（3）Western blot法检测STAT3、GRIM-19及Stat3的下游靶基因Bcl-2与MMP9蛋白表达情况；（4）MTT法检测各组质粒对SW579细胞增殖活性的影响；（5）划痕实验及Transwell实验观察各组质粒对SW579细胞迁移和侵袭的作用。结果：（1）半定量RT-PCR与Western blot结果显示pGS组与其余四组相比，Stat3表达下降，GRIM-19基因表达升高；pGS组Bcl-2、MMP9的蛋白表达明显下降；（2）显微镜下，pSi-Stat3组、pGRIM-19组与两个对照组相比，呈病态改变，细胞皱缩、变圆，细胞稀疏，细胞周围可见颗粒样物；pGS组细胞改变更加明显，细胞稀少，并可见到细胞碎片。（3）MTT实验数据显示，pGS组SW579细胞增殖活性受到明显抑制，共表达质粒表现出良好的协同作用；（4）划痕实验及Transwell实验的结果提示pGS组SW579细胞相比于其他各组，迁移和侵袭性明显降低。结论：（1）共表达质粒pGS对SW579细胞有抑制增殖、促进凋亡的作用，并降低了其侵袭与迁移能力，与单一的psi-Stat3或pGRIM-19比较，有明显的协同作用。（2）pGS治疗甲状腺癌的机制可能是一方面siRNA-Stat3抑制了Stat3的基因表达；另一方面增强表达的GRIM-19抑制了STAT3的转录激活功能。两方面协同作用于Stat3,导致其下游MMP9和Bcl-2的基因表达下降,从而最终抑制了细胞增殖、侵袭和迁移能力，导致细胞凋亡。
郑晶莹[9]2010年在《RNAi沉默STAT3基因对人卵巢癌SKOV3细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用》文中进行了进一步梳理目的:已有实验证明pSilencer1.0-U6-siRNA-STAT3重组质粒有效抑制STAT3在人卵巢浆液性乳头状囊腺癌细胞株SKOV3中的表达。故此次实验旨在研究pSilencer1.0-U6-siRNA-STAT3重组质粒对人卵巢癌SKOV3细胞裸鼠移植瘤生长的抑制效应。方法:应用人卵巢浆液性乳头状囊腺癌细胞株SKOV3对15例裸鼠建立人卵巢癌皮下移植瘤模型,随机分为3组:生理盐水对照组,空质粒对照组及siRNA-STAT3重组质粒组。pSilencer1.0-U6-siRNA-STAT3重组质粒由吉林大学前列腺疾病研究治疗中心惠赠,应用去内毒素质粒提取试剂盒提取重组质粒。用微量注射器分别将生理盐水,空质粒,pSilencer1.0-U6-siRNA-STAT3重组质粒注射入对应组的裸鼠移植瘤内,联合电转染技术提高转染率,每隔5天重复一次,每隔3天观察各组裸鼠皮下移植瘤生长情况。利用Western Blot检测重组质粒对STAT3基因表达的影响,免疫组织化学技术,HE染色及TUNEL检测细胞凋亡的方法观察肿瘤组织形态及细胞凋亡情况。结果:重组质粒瘤内注射,对SKOV3裸鼠移植瘤的生长有明显的抑制效应,与两对照组相比,裸鼠移植瘤生长速度明显减慢(P<0.05)。重组质粒抑制肿瘤组织中STAT3及cyclin-D1、VEGF、survivin、c-myc基因表达,与两对照组相比,差异有显着性意义(P<0.05)。免疫组化分析表明STAT3在空质粒及生理盐水对照组的肿瘤组织内呈强阳性表达,而在重组质粒组表达量明显减少。HE染色证实重组质粒组出现大片细胞核固缩、破碎等凋亡征象,TUNEL检测结果显示癌组织出现大量细胞凋亡。结论:pSilencer1.0-U6-siRNA-STAT3重组质粒能有效抑制人卵巢癌SKOV3细胞裸鼠移植瘤的生长。
李莉娟[10]2017年在《CCT3基因调控胃癌细胞增殖及机制研究》文中指出背景胃癌是全球癌症死亡的第二大原因,且发病率逐年升高。2016年全球每年新发胃癌病例近100万,41%发生在中国。国内大部分患者首次诊断时已为进展期,然而目前可能的干预手段如手术、化疗、放疗及其他辅助治疗效果欠佳。因此,临床亟需新型干预治疗方法,靶向治疗晚期胃癌有很大的前景。CCT(Chaperonin Containing TCP1)家族的CCT3有报道在肝癌、胆管癌等消化系统的恶性肿瘤中有着重要的作用,然而它在胃癌中的作用尚未报道。本研究的目的是探讨CCT3在人胃癌组织及癌旁组织中表达量,并揭示CCT3在胃癌发生发展中的重要生物学功能,以及该基因对胃癌发生发展影响的机制探索,为新的个体化治疗策略提供实验理论依据。方法首先分析在线TCGA(The Cancer Genome Atlas)数据库中RNA测序(RNA-seq)数据并筛选出一个CCT3的基因,同正常样本相比其在胃癌组织显着高表达。通过免疫组织化学染色检测CCT3在癌组织及癌旁组织的表达情况,通过实时定量PCR反应(qRT-PCR)检测CCT3的表达情况。应用RNA干扰技术(RNAi)靶向沉默胃癌细胞株CCT3基因的表达,通过Cellomic细胞计数、MTT实验、克隆形成及凋亡检测对CCT3在胃癌细胞株(AGS、MGC-803、BGC-823)的生物学功能进行分析。在胃癌细胞株BGC-823中沉默CCT3基因的表达,检测裸鼠体内成瘤能力。应用Affymetrix人类全基因表达谱芯片检测CCT3基因沉默前后胃癌细胞株BGC-823中全基因组mRNA表达丰度。用Ingenuity通路分析(Ingenuity?pathway analysis,IPA)差异表达基因,利用差异基因寻找下游潜在的候选基因。应用qRT-PCR和Western blot检测CCT3基因沉默后,部分候选下游通路基因mRNA和蛋白表达量。应用抗体芯片技术检测比较实验组和对照组两组样本中关键信号通路分子的变化,从分子水平揭示CCT3基因影响胃癌发生发展的作用机制。结果CCT3基因在胃癌组织和细胞株中高表达并且其主要定位于细胞核中。应用CCT3-shRNA靶向沉默胃癌AGS、BGC-823和MGC-803细胞中CCT3基因显着抑制胃癌细胞系的增殖能力。同样,抑制CCT3导致细胞凋亡明显增加。为了探讨CCT3在胃癌中可能的功能,本实验使用体外及体内肿瘤模型。体外实验,观察到在CCT3沉默的情况下胃癌细胞的克隆形成能力显着受到抑制;体内模型中,沉默CCT3的BGC-823细胞在裸鼠成瘤体积显着小于对照组。通过CCT3-shRNA沉默CCT3后,859个基因表达量上调,887个基因表达量下调。CCT3的沉默导致蛋白激酶A(PKA)、Wnt/β-catenin、PPAR及cAMP介导的信号通路发生改变。使用qRT-PCR及蛋白印迹实验验证沉默BGC-823细胞中的CCT3,导致细胞应激及凋亡相关的基因发生改变,其中MAP3K7、CDC42、CCND3的表达水平显着下调,CDK2、CDK6表达水平显着上调。结论综上所述,CCT3基因很可能是一个重要的分子,其过表达与胃癌的发生有关系。因此CCT3基因可能是新的胃癌相关的原癌基因,并在之后胃癌靶向治疗中有潜在的价值。进一步的研究(如过表达CCT3的胃癌稳定株及相关的动物模型)能够帮助我们探究及确定CCT3基因的致癌能力。
参考文献：
[1]. RNAi沉默STAT3对前列腺癌及黑色素瘤的生长抑制作用[D]. 高丽芳. 吉林大学. 2004
[2]. RNA干扰介导非小细胞肺癌ADAM9和Stat3基因沉默的研究[D]. 常亮. 吉林大学. 2016
[3]. SiRNA技术沉默Stat3对膀胱肿瘤的生长抑制作用[D]. 李相良. 吉林大学. 2008
[4]. RNA干涉技术沉默STAT3基因抗人原发性肝癌的体内外实验研究[D]. 李静. 吉林大学. 2008
[5]. RNA干扰沉默STAT3基因抗大肠癌作用及其机制的研究[D]. 张春福. 吉林大学. 2007
[6]. 以减毒沙门氏菌携带共表达siRNA-Stat3及GRIM-19质粒抗前列腺癌的体内外实验研究[D]. 张灵. 吉林大学. 2006
[7]. 阻断STAT3信号通路对胰腺癌侵袭转移的抑制作用及其机制[D]. 黄陈. 上海交通大学. 2007
[8]. 共表达siRNA-Stat3与GRIM-19质粒对甲状腺癌细胞的抑制效应及机理探讨[D]. 任仲喜. 吉林大学. 2012
[9]. RNAi沉默STAT3基因对人卵巢癌SKOV3细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用[D]. 郑晶莹. 吉林大学. 2010
[10]. CCT3基因调控胃癌细胞增殖及机制研究[D]. 李莉娟. 兰州大学. 2017
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