王艳林[1]1995年在《热休克基因表达及调控的研究》文中研究表明热休克蛋白(HSP)在细胞的应激保护、生长发育和分化等过程中具有重要生理作用，编码HSP的热休克基因(hsp)表达水平受多种因素包括多种临床疾病的影响，因而对人hsp表达水平的分析研究具有理论和临床实践的双重意义。热休克因子(HSF)是转录水平上hsp表达调控的重要反式作用因子，对HSF的深入研究有助于对hsp转录活化调控机制的进一步了解。本研究成功地建立了可用于定量检测三种主要人hsp表达水平的RT-PCR系统，用此系统分析了五种细胞在不同刺激条件下的hsp表达水平。建立了两种人HSF原核表达体系并研究了原核表达产物与顺式作用元件HSE(heat shock element)相互作用的性质。 1．定量RT-PCR技术的关键之一是必须有适当的内参照标准，我们首先利用DNA重组技术，通过13个中间克隆的复杂过程，合成出一种复合内参照DNA(Ic-DNA)。该Ic-DNA由来自人hsp70，hsp90α，hsp90β的6个DNA片段，按70_1-β_1-α_1-70_2-β_2-α_2交替排列组合而成，各片段方向一致均为5′-3′。在合成基因Ic-DNA的两侧分别连有用于转录和反转录的DNA序列。 2．以Ic-DNA体外转录出的互补RNA(cRNA)作为内参照模板，建立了定量检测人细胞中三种hsp mRNA水平的RT-PCR系统。研究了该系统的特异性并对反应条件进行了优化。此系统用同一对引物、在同一试管中对c-RNA和目的mRNA进行RT-PCR扩增，由于二者扩增产物的长度不同，可在电泳中有
黄炎[2]2015年在《基于生物组学方法的纳米银细胞毒性机理研究》文中进行了进一步梳理随着纳米粒子在生物医学领域中的应用日趋广泛,纳米粒子对人体健康的影响即纳米毒性引起了人们的密切关注。虽然研究者已采用多种方法从不同层面研究了纳米粒子的毒性,但目前人们对纳米粒子与活细胞的相互作用仍知之甚少,更重要的是采用动物整体实验、细胞学实验和传统分子生物学方法不能系统全面地解释纳米粒子与细胞相互作用的机理。高通量生物组学技术(基因表达谱芯片技术、蛋白质组学技术、SOLiD测序技术等)的快速发展为全面、系统地在分子水平上研究纳米粒子毒性机理提供了新方法和新技术手段。但迄今为止,对纳米粒子作用后引起的细胞中基因、蛋白质、microRNA表达谱的变化都是采用单一的生物组学方法分别进行研究的,因此只能获知纳米粒子对细胞影响的一个方面,而无法对纳米粒子的毒性进行系统整体的分析。纳米银由于效果强、杀菌光谱,在医学领域获得了广泛的应用,但由于纳米银对生物系统影响的复杂性,其毒性作用还有许多方面未被揭示。目前已有研究者开始研究纳米银对细胞内基因、蛋白质表达谱的影响,但尚未见对细胞中microRNA表达谱影响的报道,也未见联合多种生物组学方法系统研究纳米银毒性机制的报道。本论文将通过对将基因、microRNA、蛋白质表达数据的联合分析,探讨microRNA在纳米银对人皮肤成纤维细胞毒性中的调控机制。本论文的具体内容如下：1、采用硼氢化钠还原硝酸银的方法制备纳米银,通过调节硼氢化钠的浓度和改变溶剂的种类制备一系列纳米银溶液。紫外可见分光光度计和透射电镜表征结果显示,还原剂的浓度和溶剂的种类均会影响纳米银的大小和形状。用二蒸水制备的纳米银形状均一,大部分呈球形。为了获得实验用20nm的纳米银,确定以二蒸水为溶剂、浓度为2mM的硼氢化钠和硝酸银溶液进行制备。2、采用MTT法、实时细胞电阻抗仪、光学显微镜、荧光显微镜和扫描电镜对纳米银对人皮肤成纤维细胞增殖和形貌的影响进行分析,采用流式细胞术研究纳米银对细胞周期和细胞凋亡的影响,进一步采用原子吸收光谱仪分析纳米银在细胞中的摄取。结果显示,低浓度的纳米银(1、10、50、100μM)作用细胞72h内,细胞毒性均为0级,高浓度纳米银(200、300μM)在作用细胞48h后均出现1级细胞毒性,且细胞的规则排列发生变化。而200μM纳米银作用细胞1、4、8h时虽未产生细胞毒性,影响细胞形态,但已使细胞滞留于DNA合成期,且在8h时纳米银对细胞周期和凋亡的影响最为显著。此外,随着作用时间的增加,细胞中摄取的纳米银量显著升高。3、采用基于二维差异凝胶电泳分离技术和质谱鉴定的蛋白质组学技术研究200／μM纳米银作用1、4、8h后人皮肤成纤维细胞中的蛋白质表达谱,筛选获得25种在三个时间点均发生差异表达的功能蛋白质,其中发生上调表达的蛋白质19种,发生下调表达的蛋白质4种,既有上调又有下调的蛋白质2种。进一步采用Cluster & Treeview, Gosurfer、GenMAPP、Ingenuity Pathway Analysis软件对差异表达蛋白质进行聚类、Gene Ontology (GO)功能分类、生物学通路和蛋白质-蛋白质相互作用网络分析,发现25种差异表达蛋白质影响多个GO功能类别,并参与31条生物学通路和4个蛋白质相互作用网络。纳米银可能影响细胞信号传导、细胞骨架、细胞粘附、细胞能量代谢、mRNA加工等功能,抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡。4、采用SOLiD测序技术分析2001μM纳米银对人皮肤成纤维细胞中microRNA表达谱的影响,在1、4、8h三个时间点分别获得59、143和142个差异表达microRNA,其中不重复的共有246个。进一步使用miRanda、TargetScan和PicTar三种方法同时对差异表达microRNA进行靶基因预测,在三个时间点分别获得1747个、2928个和2667个靶基因,其中不重复的共有3594个。生物信息学分析发现,差异表达microRNA靶基因显著影响171、272、233个生物学过程、分子功能和细胞组分第三层次的功能类别,并参与120、132和129条生物学通路,其功能涉及细胞粘附、细胞骨架、细胞凋亡、细胞周期、炎症反应等。5、将纳米银作用细胞后的蛋白质表达数据和本课题组前期获得的基因表达数据进行比较,发现两者在种类、数量和表达模式上都存在明显差别。对比差异表达基因、microRNA和蛋白质涉及的GO生物学过程功能类别和参与的生物学通路,发现三者之间存在差异。通过联合分析microRNA、基因和蛋白质表达数据,在1、4、8h三个时间点分别匹配到具有生物学意义的microRNA-靶基因作用对36、429、116个,microRNA-靶蛋白质作用对2、1、3个,包含的靶基因和靶蛋白质有28、186和82个,不重复的共257个。在匹配到的microRNA-靶基因／靶蛋白质对找到对应3个基因／蛋白质对的6个microRNA,而靶基因-蛋白质对的表达分别受多个microRNA的共同调控,microRNA本身的表达方式也会影响其对靶基因／靶蛋白质的调控效果,microRNA可通过降解mRNA和抑制翻译两种方式发挥对靶基因-蛋白质对的调控作用。对257个microRNA靶基因／靶蛋白质的生物信息学分析显示,其功能主要与细胞通讯和细胞代谢过程有关,并且参与57条生物学通路。而差异表达nicroRNA和调控的靶基因-蛋白质对共同参与4条主要的生物学通路,即“肌动蛋白细胞骨架的调节”、“肝细胞生长因子受体”、“胰岛素信号”和‘'MAPK信号通路”。纳米银可能通过差异表达microRNA调控这4条通路中的靶基因和靶蛋白质,最终导致细胞骨架的破坏、ATP水平的降低和细胞凋亡的产生。6、采用Western blot和qRT-PCR对选定的4种蛋白质和8个microRNA的表达值进行测定,证实纳米银与细胞作用的蛋白质组学和nicroRNA测序实验结果的可信性。进一步采用肌动蛋白细胞骨架染色试剂盒、ATP检测试剂盒和Hoechst荧光染色法对纳米银作用1、4、8、24、48和72h后细胞骨架、细胞内ATP含量和细胞凋亡进行分析,证实生物信息学分析结果,证明纳米银主要通过破坏细胞骨架、降低ATP水平和诱导细胞凋亡这三个方面的作用引起人皮肤成纤维细胞毒性。7、采用SOLiD测序技术分析200μM纳米金对人皮肤成纤维细胞中microRNA表达谱的影响,在1、4、8h三个时间点分别获得109、78和124个差异表达]microRNA。进一步使用miRanda, TargetScan和PicTar同时对差异表达microRNA进行靶基因预测,在三个时间点分别获得2403个、2044个和3002个靶基因,这些靶基因显著影响208、193、249个生物学过程、分子功能和细胞组分第三层次的功能类别,并参与126、125和129条生物学通路。通过联合分析microRNA、基因和蛋白质表达数据,在1、4、8h三个时间点分别匹配到具有生物学意义的microRNA-靶基因／蛋白质作用对132、38、137个,包含的不重复的靶基因和靶蛋白质共187个。对匹配的187个microRNA靶基因／靶蛋白质的生物信息学分析显示,其功能主要与细胞代谢过程有关,并且参与71条生物学通路。而差异表达microRNA和调控的靶基因-蛋白质对共同参与2条主要的生物学通路,即"mRNA加工”和"MAPK信号通路”。纳米金可能通过差异表达microRNA调控这2条通路中的靶基因和靶蛋白质,影响细胞周期但抑制细胞凋亡。8、从细胞水平、蛋白质水平和microRNA水平对纳米银与纳米金对人皮肤成纤维细胞的影响进行比较。结果发现,这两种纳米粒子对细胞增殖、细胞周期、细胞骨架、氧化应激、能量代谢、细胞凋亡等方面的影响均存在差异。进一步在蛋白质水平上的比较发现,这两种纳米粒子诱导的差异表达蛋白质中相同的只有5种,生物学过程、分子功能、细胞组分分类中包含蛋白质最多的类别基本相同,而纳米银影响的通路数量(31条)多于纳米金(24条)。在]microRNA水平上的比较显示,纳米银和纳米金作用细胞后差异表达microRNA的种类、靶基因／靶蛋白质功能、参与的生物学通路和对生物学通路的影响均不同。与纳米银相比,纳米金影响细胞周期,减弱对ATP合成的抑制和对细胞骨架的损伤,并抑制细胞凋亡的产生,最终未产生细胞毒性。而两种纳米粒子作用后细胞中活性氧水平的差异与纳米金无细胞毒性而纳米银诱导产生细胞毒性有关。
韩延平[3]2005年在《环境因素调控鼠疫耶尔森氏菌基因表达的比较转录谱学研究》文中认为鼠疫是一种古老的自然疫源性疾病,其病原菌鼠疫耶尔森氏菌(以下简称鼠疫菌)是多宿主寄生菌,体现在:鼠疫菌以蚤类为传播媒介寄居在特定的宿主(主要是啮齿动物),并在自然界宿主中造成鼠疫疫情的周期性爆发,该过程中偶然与患畜接触或被带菌跳蚤叮咬而感染到人。鼠疫菌感染机体早期能在巨噬细胞内存活并繁殖,目前认为巨噬细胞内存活与繁殖获得致病能力是鼠疫菌得以最终致病的关键阶段。 面对上述复杂的环境因素,鼠疫菌必须能够感应并快速适应每个环节的环境变化,才能最终在宿主体内存活和在自然界中传播并最终致病,而每个适应性反应也必然伴随着鼠疫菌基因转录改变。依据上述传播和感染过程中鼠疫菌可能面临的胁迫环境,我们设计并实施了多个体外模拟刺激条件的转录谱分析,包括温度(生长温度、冷休克和热休克)、渗透压(高盐、高渗和OmpR调控元)、H_2O_2(H_2O2刺激元和OxyR调控元)、低镁(低镁刺激元和PhoP调控元)等刺激因素。 经过全基因组DNA芯片单个体外条件的转录谱分析,我们分别得到了本研究多个体外条件下鼠疫菌在细胞代谢和毒力等方面的特征转录谱。野生株与突变株的比较转录谱分析得到鼠疫菌调节蛋白OmpR、OxyR和PhoP在特定条件下可能调节的基因,为今后调节网络的研究提供调控元的靶标基因。更重要的是,我们将上述转录谱以及目前本实验室所有的体外条件转录谱结果中各个基因的转录数据进行汇总,归纳总结了目前已知毒力相关基因在本研究体外条件的转录规律,丰富了现有关于毒力相关基因的研究成果;通过聚类分析,并利用统计学分析方法对鼠疫菌基因组内在多个条件下共转录的基因或基因簇进行分析,最终预测了鼠疫菌基因组中39个可能的操纵子;根据聚类分析结果,结合基因组序列和注释信息,对部分基因和操纵子的功能进行预测。上述结果为鼠疫菌基因转录调控网络的构建及某些基因功能的预测提供了部分实验证据,有助于深入认识鼠疫菌的致病性及宿主-细菌间相互作用。
邹素芬[4]2001年在《清热复方对热休克大鼠HSP70基因表达调控的研究》文中提出在《黄帝内经》，关于热证的描述不少。在著名的“病机十九条”中，属于火与热的分别就有四条。同时提出热证的治疗原则为“：热者寒之”，“温者清之”，治法为“治以咸寒，佐以甘苦，以酸收之，以苦发之”。对后世产生重要影响。历代医家延用此治则治法创制了众多卓有成效的清热方剂。现代科研工作者对清热方剂进行了多方面的研究，证实它们有抗病原微生物、抗毒、抗炎、解热、降血压、降血脂以及对免疫系统等的作用。而深入到分子生物学的报道较少。 热休克蛋白（Heat Shock Proteins，HSPs）是近年来医学界研究的热点之一。其普遍存在于从细菌到高等真核生物的整个生物界，在正常生长条件下，各种细胞处于应激状态时，如热休克反应（HSR）或环境温度改变、病原体感染和组织损伤，被氨基酸类似物、生长因子、重金属高子等多种因素可诱导其在体内明显增高。HSPs是一种保护机体的蛋白，在各种属高度保守，并与一些基本的细胞功能有关，称作“分子伴侣”作用。其中HSP70及HSP84是两类最重要的热休克蛋白，迄今为止，对HSP70和HSP70mRNA的研究最为广泛。 HSR过程类似于中医的“热证”、“热毒证”等范畴，我们的研究就是探讨清热方剂的作用是否通过诱导HSPs而实现的。本课题选择了两首代表方，分别为治疗气分热盛的白虎汤，清热解毒的黄连解毒汤作为研究对象。我们主要采用RT-PCR法、免疫组化法研究白虎汤和黄连解毒汤在热休克大鼠、内毒素中毒两种大鼠热证模型的HSP70基因表达调控情况。实验结果表明：1．两种模型HSP70的mRNA表达并不一致，热休克模型明显高于内毒素模型。2．用药后，在热休克模型中，白虎汤和黄连解毒汤方组的HSP70的基因表达均明显高于对照组（P〈0.05），白虎汤易高于黄连解毒汤组，（P〈0.05）。在内毒素模型中，涧热复方对热休克大鼠HSP70基因表达橱控的研究白虎汤和黄连解毒汤组的HSP70的基因表达与对照组相比无统计学差异。3．在电镜的形态学观察中表明，两方均能减轻组织细胞的损伤，但作用位置不同，形态改变亦不一致。结论：＊在热休克动物模型实验中，清热中药是可通过诱导HSP70mRNA的表达而提高细胞的热耐受力。2．在内毒素中毒模型中，清热中药能有效保护细胞，但不是通过诱导 HSP70mRNA 的表达而实现的。提示：清热方剂的热保护作用可以通过诱导HSP表达而实现，但不同方剂的作用途径有所不同。
曾涛[5]2015年在《调控北京鸭和番鸭抗热应激关键基因的筛选与鉴定》文中研究说明随着畜牧业集约化和产业化的发展,养殖者都力求在最小的空间内饲养更多的畜禽,导致养殖密度越来越大,尽管可以最大限度的提高畜禽的生产性能,降低劳动成本,增加经济效益,但也容易带来一些外在的不良因素,从而影响畜禽的生长发育以及饲料报酬,最终引起畜禽产生疾病或死亡,给养殖者造成巨大的经济损失。这些因素包括高温、缺氧、高压、紫外线、组织感染、重金属等,其中高温环境带来的不良影响尤其显著。当外界环境温度在畜禽的舒适区温度范围时,动物就能正常生产,发挥良好的繁殖性能;当外界温度与舒适区温度不适应时,导致畜禽的生产性能等受到严重的影响,造成较大的经济损失。本试验以较多在中国北方饲养的北京鸭和主要在南方饲养的番鸭为研究对象,重点研究了急性热应激对鸭肝脏功能代谢的影响。通过组织形态学观察和抗氧化指标的测定研究了热应激对鸭肝脏组织损伤及氧化功能的影响;通过荧光定量PCR研究了热应激状态下鸭肝脏热休克蛋白及炎性因子相关基因的表达水平;采用二代转录组测序RNA-Seq的方法分析了热应激前后番鸭肝脏组织中差异表达的基因情况;利用体外培养的方法,研究了 HSP70-siRNA对鸭肝细胞细胞凋亡信号通路关键基因表达的影响;运用了蛋白质组学的方法,研究了热应激对北京鸭和番鸭肝脏组织蛋白表达的影响;同时,我们还根据蛋白质组学的结果,克隆了部分与热应激相关的基因,分析了两个鸭种间的序列结构差异。1.急性热应激对北京鸭和番鸭肝脏组织抗氧化系统、炎性因子及热休克蛋白的影响热应激严重影响家鸭存活率、产蛋率及肉质性能。本试验旨在研究急性热应激对北京鸭和番鸭肝脏组织病理损伤、抗氧化酶活性(SOD、MDA、CAT、T-AOC)、炎性因子及热休克蛋白的影响。鸭被暴露于39±0.5℃下1h,然后迅速转入20℃中恢复1h和3h,迅速采集各温度下的鸭肝脏组织用于后续分析。结果显示,热应激导致北京鸭和番鸭都出现不同程度的组织损伤,但北京鸭肝脏损伤情况更加严重;热应激1h后,番鸭肝脏组织抗氧化酶(SOD、MDA、CAT、T-AOC)活性均出现上调,而北京鸭则下调,恢复期鸭肝脏组织抗氧化酶活性均下调;与对照组相比,热应激后鸭肝脏组织中HSP70,HSP60,HSP40基因表达水平均出现上调的现象;番鸭肝脏组织中HSP10基因表达上调,北京鸭则无明显变化;相反地,应激组HSP90基因表达水平在均显著下降。热应激状态下,番鸭iNOS基因水平有明显的上升,北京鸭则有明显的下降;COX-2基因表达水平在鸭肝脏组织中均出现上调的现象。综上所述,急性热应激能够影响北京鸭和番鸭肝脏组织形态学特征,导致其抗氧化机能发生改变,并显著影响鸭肝脏组织内HSP基因与相关炎性因子的表达水平。与北京鸭相比,番鸭具有更强的热应激抵抗能力。2.热应激番鸭肝脏组织转录组分析在本试验中,运用Illumina高通量测序技术分析了番鸭在热应激后肝脏组织中转录组水平上所有基因表达水平的情况。结果显示:de novo测序总共获得超过225,000,000个原始reads,对应产生22.75 Gb数据。从头拼接组装后,产生36,903个Unigenes,平均长度为1,135bp,其中21,221(57.50%)个Unigenes有注释。对有注释的Unigenes进行GO分析发现,富集最多的是转录、信号转导及凋亡通路。同时,我们对热应激组及对照组数据比较分析发现,共产生470个差异表达的基因,240个基因表达上调,230个基因表达下调。GO富集分析显示这些基因主要与蛋白质折叠及伴侣绑定有关;KEGG通路分析发现,番鸭热应激后,Ras和MAPKs信号通路被激活。同时,我们对主要的几个基因进行了实时荧光定量PCR验证。本研究丰富了番鸭基因组的序列信息,对研究鸭在抗热应激中的反应提供了新的视角,分析得到的相关差异基因可以作为今后的候选基因,为培育鸭耐热品系提供理论数据。3.抑制HSP70基因表达对鸭肝脏细胞凋亡相关基因表达的影响研究表明,在不良刺激影响下,HSP自身可以调控细胞的凋亡。本试验利用鸭肝细胞体外培养的方法,研究HSP70-siRNA对鸭肝脏细胞内细胞凋亡信号通路关键基因表达的影响。试验采用常用的二步灌流分离法,得到了活力较高的鸭肝脏细胞,随后进行HSP70基因干扰试验。结果表明,HSP70-siRNA处理细胞CCO基因表达水平提高1156.7%(P<0.01)、SAPK基因表达水平提高733.3%(P<0.01)、p38MAPK基因表达量降低70.0%(P<0.01)、RASA1基因表达量降低83.4%(P<0.01)。4.急性热应激前后北京鸭与番鸭肝脏蛋白质代谢的研究本试验运用蛋白组学的方法,研究北京鸭与番鸭中与耐热相关的蛋白。鸭被暴露于39±0.5℃下1h,然后迅速转入20℃环境中恢复3h,采集各温度下的鸭肝脏组织,提取肝蛋白用于2D电泳分析。凝胶图像分析之后,共发现61个差异表达的蛋白,其中54个经MALDI TOF/TOF MS成功鉴定。在这54个蛋白中,7个蛋白共同存在于北京鸭和番鸭中,47个为单独存在(25在番鸭,22在北京鸭中)。分析这些蛋白发现,分子伴侣相关蛋白如HSP70和HSP10,在北京鸭和番鸭中都出现显著的上调。然而,本试验还发现其它的一些蛋白,例如α烯醇化酶(α-enolase),S-腺苷甲硫氨酸合成酶(S-adenosylmethionine synthetase),在北京鸭和番鸭中呈相反地表达趋势。根据GO富集分析显示,差异表达的蛋白主要富集在细胞死亡与凋亡(20.93%)、氨基酸代谢(13.95%)和氧化还原(20.93%)三大类。同时,我们选取几个差异表达的蛋白所对应的基因进行了RT-PCR验证。本文第一次从蛋白组学方向研究了北京鸭和番鸭在对抗热应激时的蛋白表达差异,为今后更好的理解热应激反应机制,耐热品种的培育提供可靠的理论数据。5.番鸭ENO1基因cds序列克隆及结构分析温度能够影响蛋白质3D结构的稳定性,导致蛋白质的功能如配体的识别与结合等发生改变,从而使其对热敏感。因此,蛋白质氨基酸的自然进化应朝向其能在特殊的热环境中发挥良好功能的方向进行。本试验根据前面试验得到的北京鸭番鸭差异表达蛋白的数据,挑选出α-enolase(ENO1)这一蛋白,以GenBank上公布的绿头野鸭ENO1基因序列为参考,克隆番鸭ENO1基因cds序列,分析ENO1基因序列及结构的差异,探讨该基因结构的变化对北京鸭和番鸭耐热性差异可能造成的影响。结果表明,番鸭ENO1基因cds序列含有1305碱基,共编码434个氨基酸;北京鸭ENO1基因(GI213090)与番鸭ENO1基因的cds序列共存在21个碱基的差异;在蛋白序列上共存在5个氨基酸的差异。其中,北京鸭第171位和173位分别为脯氨酸(P)和半胱氨酸(C),而番鸭分别为亮氨酸(L)和缬氨酸(V)。缬氨酸(V)为非极性氨基酸(疏水),而半胱氨酸为极性氨基酸(亲水),同时,在α-enolase三级结构中,171位和173位同时位于β折叠的最上沿,对于进入蛋白催化区域的底物具有一定的指导作用,这可能与北京鸭和番鸭耐热性的不同有关。综上所述,急性热应激对北京鸭与番鸭肝脏组织均有不同程度的损伤,但比较发现,番鸭具有更好的耐热能力。肝脏组织转录组和蛋白质组学分析结果发现,北京鸭和番鸭耐热性的差异可能主要与机体内能量供应和抗氧化能力有关。本研究为鸭抗热应激的分子调控机理及分子辅助育种奠定了基础。
周思卉[6]2017年在《FLHS中自噬及凋亡相关基因在肝脏、肾脏和小肠中的异常表达及白藜芦醇对其的调控作用》文中指出本试验旨在研究高能低蛋白日粮诱导的蛋鸡脂肪肝脏、肾脏和小肠中自噬、凋亡及相关基因m RNA表达量的变化以及日粮中添加白藜芦醇对其基因表达量的调控作用。144羽海兰褐蛋鸡随机分成正常组(Con)、病理组(HELP)、预防组(HELP+Res)和白藜芦醇组(Con+Res)。试验期为120d,分别于试验第40d、第80d和第120d剖杀12羽蛋鸡,取肝、肾脏及小肠并提取RNA,通过Quantitative Real Time PCR技术检测其ATG5、ATG7、Beclin-1和P62及相关基因Caspase-3、Bax、Bcl-2、HSP60、HSP70、HSP90、apoA-Ⅰ和apoB-100 mRNA表达量。结果如下:1、与Con组比,肝、肾脏及小肠中Beclin-1、ATG5和ATG7 mRNA表达量在HELP组降低,在Con+Res组升高,P62 mRNA则完全相反,均差异极显著(P<0.01);与HELP组比,HELP+Res组各组织中Beclin-1、ATG5和ATG7 mRNA表达量升高,P62 m RNA降低,均差异极显著(P<0.01)。2、与Con组比,各组织中Caspase-3和Bax mRNA表达量在HELP组升高,在Con+Res组降低,Bcl-2 mRNA则完全相反,均差异极显著(P<0.01);与HELP组比,HELP+Res组各组织中Caspase-3和Bax mRNA表达量降低,Bcl-2 mRNA升高,均差异极显著(P<0.01)。3、与Con组比,各组织中HSP60、HSP70和HSP90 mRNA表达量在HELP组呈升高,均差异显著(P<0.05),在Con+Res组中无明显差异(P>0.05);与HELP组,HELP+Res组各组织中HSP60、HSP70和HSP90 mRNA表达量降低,均差异显著(P<0.05)。4、与Con组比,各组织apoA-Ⅰ和apoB-100 mRNA表达量在HELP组降低,在Con+Res组升高,均差异极显著(P<0.01);与HELP组比,HELP+Res组各组织中apoA-Ⅰ和apoB-100表达量升高,均差异极显著(P<0.01)。高能低蛋白诱导的蛋鸡脂肪肝出血综合征会抑制肝、肾脏及小肠自噬、载脂蛋白基因的表达,促进凋亡基和热休克基因的表达,日粮中添加白藜芦醇能对这些基因的表达进行调控。
张春暖[7]2015年在《果寡糖对两种鲂属鱼生长、免疫和抗应激的研究》文中认为在目前的水产养殖过程中,病毒、病菌会对鱼类造成威胁、环境因子的急剧变化等也会对其造成不良应激。尤其是夏季,是鱼病的高发期,应激现象也尤为严重,疾病大规模的爆发,造成了死亡率上升和生长缓慢等现象,最终造成了巨大的经济损失。过去主要是通过使用抗生素来对抗疾病,但是抗生素的负面影响也有不少报道,因此,如何通过绿色环保的途径提高鱼体免疫力成为当前研究的热点。果寡糖是一种不能被机体完全消化吸收利用而通过调节肠道微生物促进机体健康的一种新型饲料添加剂,作为饲料添加剂有着广阔的应用前景。团头鲂(Megalobrama amblycephala)和三角鲂(Megalobrama terminalis)都是鲂属鱼类,属于鲤科,具有生长速度快,易繁殖,抗病力强,肉质鲜美等特点成为淡水养殖的珍品。近年来,由嗜水气单胞菌等病菌的感染、应激引起的暴发性出血病在团头鲂养殖中也时有发生。鉴于此,本研究通过研究果寡糖对鲂属鱼类健康机理调控机制的影响,开发新型饲料添加剂,增强鲂属鱼类的免疫力,提高其抗病力和抗应激能力,为解决水产养殖中容易出现的高发病率和应激提供依据。本研究试验内容主要由6部分组成:1饲料中不同添加水平的果寡糖在不同投喂模式下对团头鲂生长性能、免疫指标、抗氧化和抗病力的影响本试验的目的主要是探讨饲料中的果寡糖在不同添加水平和不同投喂模式下对团头纺生长性能、免疫指标、抗氧化和抗病力的影响,3个果寡糖水平(0、0.4%、0.8%)和2种投喂模式(连续投喂、间隔5天投喂)采用3×2因素设计,经过8周的养殖试验后,用嗜水气单胞菌在1×105cfu/ml浓度下对采样剩余的鱼进行攻毒试验,并统计其在96h内的死亡率。试验结果表明,连续投喂0.4%组和间隔投喂0.8%果寡糖组的生长性能较好,血清中溶菌酶、ACP、MPO的活性以及补体C3、总蛋白和免疫球蛋白的含量都是在间隔投喂0.8%果寡糖组出现最大值,显著好于(P<0.05)对照组或连续投喂0.8%果寡糖组,但是和连续投喂0.4%果寡糖组并无显著差异(P＞0.05),抗菌肽LEAP-1和LEAP-2都出现相同的趋势,死亡率在间隔投喂0.8%果寡糖组出现最小值,显著低于对照组,此试验结果表明,果寡糖在适宜的添加浓度和投喂模式下能够提高团头鲂生长性能、免疫力、抗氧化能力和抗病力,连续投喂0.4%果寡糖组和间隔投喂0.8%果寡糖组产的效果较好。2高温应激下果寡糖对团头鲂免疫、抗氧化和热休克蛋白基因表达的影响本试验的目的是研究果寡糖在高温应激下对团头鲂免疫、抗氧化和热休克蛋白(HSP70和HSP90)基因表达的影响,360尾初重为13.8g的团头鲂随机被分为3组,每组有4个重复,每缸30尾鱼,分别投喂果寡糖浓度为0、0.4%、0.8%的三组饲料,经过8周的养殖试验后,每缸挑选20尾鱼,用34℃的高温对其进行急性热应激试验,并分别在应激前(Oh)和应激后的3h、6h、12h、24h、48h采样。结果表明血液皮质醇和血糖在应激后的3h和6h处0.4%果寡糖组明显低于对照组(P<0.05),乳酸含量在这一组的3h处也显著小于对照组(P<0.05),血液溶菌酶、酸性磷酸酶和补体ACH50的活性以及总蛋白、免疫球蛋白的含量在应激后都呈现先升高或降低的趋势,并在6h处出现最大值,另外添加0.4%果寡糖组的免疫指标的活性在3h或6h处大部分都显著高于对照组(P<0.05);肝脏SOD和CAT活性在应激前和应激后都是0.4%果寡糖组显著高于对照组(P<0.05),而MDA含量呈相反的趋势;添加果寡糖增强HSP70和HSP90基因的表达量,并在3h、6h或12h显著高于对照组(P<0.05)。本试验得出饲料中添加适宜浓度的果寡糖能够提高团头鲂的免疫指标活性、抗氧化能力和热休克蛋白的表达,从而提高了团头鲂的抗高温应激的能力。3氨氮应激下果寡糖对团头鲂免疫、抗氧化和热休克蛋白基因表达的影响本试验的目的是研究在氨氮应激条件下果寡糖对团头鲂免疫指标、抗氧化和热休克蛋白(HSP70和HSP90)基因表达的影响,360尾初重为13.8g的团头鲂随机分为3组,每组4个重复,每缸30尾鱼,对照组投喂基础日粮,试验组分别投喂果寡糖添加浓度为0.4%和0.8%的试验日粮,养殖试验结束后,用10mg/L的NH4Cl对采样剩余的24尾鱼进行氨氮应激试验。试验结果表明,应激后的3h或6h分别发现,血清皮质醇和血糖在投喂0.4%果寡糖组显著低于对照组(P<0.05),血清溶菌酶、补体ACH50的活性以及NO的含量都呈现先升高后降低的趋势,并且分别在6h,6h,和3h的0.4%果寡糖组显著高于对照组(P<0.05),在应激前后的0.4%组肝脏的超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)的活性都显著高于对照组(P<0.05),但是丙二醛含量的变化呈相反的趋势。应激后,试验验组的HSP70和HSP90的相对表达量分别在6h和12h处显著高于对照组(P<0.05),应激后12h后发现试验组的累计死亡率也显著低于对照组(P<0.05),本试验结果表明饲料中添加0.4%的果寡糖能够提高团头鲂的免疫力指标活性、抗氧化能力和热休克基因的表达,从而提高了团头鲂抗氨氮应激的能力。4果寡糖和芽孢杆菌交互对三角鲂生长性能、体组成、肠道消化酶和肠道微绒毛发育的影响本研究的目的是为了研究果寡糖和地衣芽孢杆菌对三角鲂生长性能、体组成、肠道消化酶和肠道微绒毛的发育的影响,采用3×3交互的方法,试验鱼随机分成9组,其中果寡糖分别为0、0.3%、0.6%3个水平,芽孢杆菌的添加水平分别为0、1×107CFU/g、5×107CFU/g三个水平。经过8周的养殖试验后,试验结果得出末重和特定生长率都随着果寡糖的添加量的增加而呈现升高趋势,而随着芽孢杆菌的增加而呈先升高后降低的趋势,另外,果寡糖和芽孢杆菌的交互作用对三角鲂的末重、特定生长率和成活率都有较显著的影响(P<0.05),并在果寡糖添加量为0.3%、芽孢杆菌1×107CFU/g复配组生长性能出现最大值,肝体比、胴体脂肪含量、脂肪酶活性和肠道微绒毛长度都随着芽孢杆菌添加量从0到1×107的增加而增加,但这些指标受果寡糖添加水平的影响并不显著(P>0.05);蛋白酶和Na+,K+-ATP酶的活性受果寡糖和芽孢杆菌交互作用的显著影响(P<0.05),并果寡糖添加量为0.3%、芽孢杆菌1×107CFU/g复配组出现最高值,以上试验结果表明饲料中添加适量的果寡糖和芽孢杆菌可以提高三角鲂的生长性能、肠道消化酶和微绒毛长度,并且果寡糖和芽孢杆菌之间存在显著的交互作用,饲料中最适的添加水平为0.3%果寡糖和1×107CFU/g的芽孢杆菌配伍。5果寡糖和芽孢杆菌交互对三角鲂免疫指标活性、抗氧化和抗病力的影响为了研究果寡糖和地衣芽孢杆菌交互对三角鲂免疫、抗氧化和抗病力的研究,三个水平的果寡糖(0、0.3%和0.6%)以及三个芽孢杆菌水平(0,1×107,5×107CFUg-1)通过3×3因素交互,共制成9组饲料,投喂三角鲂8周,养殖试验结束后用嗜水气单胞菌进行攻毒试验,并统计其一周内的累计死亡率,结果表明,随着芽孢杆菌添加水平从0到1×107CFU/g的增加而增加,血液白细胞数、补体ACH50、总蛋白和球蛋白都呈升高的趋势,但是果寡糖添加水平对这些指标并无明显的增加(P＞0.05),碱性磷酸酶和酚氧化酶都受到果寡糖添加水平的显著影响,分别在添加0.6%和0.3%组出现最大值,免疫球蛋白和肝脏超氧化物歧化酶都是即受到果寡糖添加水平的影响(P<0.05),又受到芽孢杆菌添加水平的显著影响(P<0.05),肝脏中的CAT、GPX和血液中的SOD的活性在1×107 CFU/g组显著高于其它组(P<0.05),但是丙二醛的含量呈相反的趋势,嗜水气单胞菌攻毒后累计死亡率显著受到果寡糖和芽孢杆菌交互作用的影响(P<0.05),并且在0.3%果寡糖和1×107CFU/g芽孢杆菌配伍组死亡率最小,本研究结果表明果寡糖和地衣芽孢杆菌能显著提高三角鲂的免疫指标活性、抗氧化和抗病力。并建议三角鲂饲料中添加0.3%果寡糖和1×107CFU/g的地衣芽孢杆菌复配使用。6团头鲂IL-6基因克隆分析和氨氮应激及攻毒对其表达量的影响IL-6基因是典型的促炎因子,在免疫反应和炎症反应起到重要作用,并能影响巨噬细胞的功能,本研究主要是对IL-6基因的cDNA的全长序列进行了克隆,并对在氨氮应激以及攻毒之后,它在不同组织表达量变化的差异进行了分析,结果显示IL-6基因一共包含了 1045个碱基,开放阅读框有696个碱基,翻译了 232个氨基酸,其中信号肽是1-24个氨基酸,通过对不同组织IL-6基因的相对表达量分析,IL-6基因在肠道、肝脏和鳃组织的表达比较高,在眼和腹脂的表达量较低,在氨氮应激之后,脾脏和肠道IL-6基因的相对表达量出现先上升后下降的趋势,并分别在6h和12h到达了最大值,在48h又恢复到了应激前的水平,但是肝脏IL-6基因的表达在前3h先出现下降之后又上升并在12h达到最大;攻毒之后脾脏、肠道和肝脏都呈先上升后下降的趋势,并分别在攻毒后的6h、3h和6h达到最大值,本研究结果对以后研究抗应激和抗病菌机制提供一定的理论依据。
魏兰珍[8]2010年在《外源基因在集胞藻6803中高效表达及调控的研究》文中研究指明蓝藻是一类能进行光合放氧作用的原核生物。集胞藻6803 (Synechocystis sp. strainPCC 6803)是一种单细胞蓝藻。该株系具有天然DNA转化系统,细胞结构简单,生长速度快,适应性强,是第一个完成基因组序列测定的光合生物。另外,它还能利用简单无机物合成有机物,并且表达的外源基因产物不易形成包含体。因此,利用转基因蓝藻制备基因工程药物的下游加工过程相对简化,是理想的基因工程研究的模式藻。但是,蓝藻中外源基因的表达效率低下,一直制约着蓝藻基因工程的长足发展。本研究以增强型绿色荧光蛋白基因egfp (enhanced green fluorescent protein)作为外源基因,构建适用于插入各种调控元件的同源重组整合平台——P0载体；然后利用该整合平台,通过插入各种已知的和未知的调控元件、自然转化、继代筛选,从而获得了多种转基因株系；通过比较各种转基因株系中外源基因的表达水平,对各种调控元件进行评价,从而筛选出能高效表达蓝藻外源基因的调控元件,具体步骤如下：(1)利用P0载体,在其报告基因上游分别插入聚球藻7942中groESL基因的温度诱导型启动子以及SD序列(GGAGAG),转化集胞藻6803,得到转基因Pg和Pg-s藻株。利用蛋白免疫印迹,研究不同生长时期、不同温度以及不同诱导时间下转基因株系中外源egfp基因的表达情况。研究结果表明,处于衰退期的转基因株系中外源基因的表达水平最高；并在此生长时期下,该启动子最适宜的诱导条件是在42℃诱导30分钟。通过比较各转基因藻中外源基因的表达情况发现：添加SD序列后则使外源基因的表达水平提高了1.6倍,而含groESL基因启动子和SD序列的Pg-s藻株中外源基因的表达水平比未添加启动子的P0藻株提高了2.0倍。综上所述,在集胞藻6803中,异源groESL基因启动子和SD序列的串联可明显提高蓝藻细胞中外源基因的表达水平。(2)利用P0载体,在报告基因上游插入聚球藻7002中cpcβ基因的光诱导型启动子,并转化集胞藻6803,获得转基因藻Pc。通过蛋白免疫印迹,研究不同光强、不同诱导时间以及不同CO2浓度对转基因株系中外源egfp基因的表达情况。结果表明：10μEm-2·s-1的光强诱导4小时后,转基因株系中外源基因的表达水平达到最高,而且低浓度的CO2也可以明显增强外源egfp基因的表达。(3)通过基因芯片数据和生物信息学的分析,初步确定ndhC-K-J操纵子可能的启动子区域,并插入到PO载体报告基因的上游区域,转化集胞藻6803,获得转基因株系P330。通过蛋白免疫印迹,研究不同生长时期、不同高光诱导时间以及二氧化碳浓度下转基因株系中外源基因的表达情况。结果表明,该未知启动子在高光诱导4小时,低二氧化碳培养条件下,使外源egfp基因的表达水平达到最高。通过比较Pg-s与P330藻株中外源基因的表达情况,揭示ndhC-K-J操纵子可能的启动子区域对外源基因的启动效果更为显著；P330藻株中外源基因的表达水平比Pg-s藻株提高4.2倍,比P0藻株提高8.2倍；蛋白定量结果表明,在转基因P330藻株中,外源egfp基因的表达量可达总蛋白的1.725%。本研究在构建同源重组双交换平台的基础上,分析来源于聚球藻7942的groESL基因启动子、聚球藻7002的cpcβ基因启动子、SD序列以及集胞藻6803自身ndhC-K-J操纵子可能的启动子区域对集胞藻6803中外源基因表达水平的影响。蛋白免疫印迹结果表明,这些调控元件均在一定程度提高了集胞藻6803中外源基因的表达效率,其中,ndhC-K-J操纵子可能的启动子区域对外源基因表达水平的提高幅度最大。以上结果为最终解决蓝藻细胞这一新型宿主系统中外源基因表达效率低下的问题注入了新的希望,为将来利用转基因蓝藻制备基因工程药物奠定了实验基础。
郑玲[9]2007年在《“逆针灸”对更年期大鼠热休克蛋白及应激相关机制影响的研究》文中提出“治未病”是中医基础理论的重要组成部分,是《内经》以预防为主的学术观点的具体体现,对后世影响深远。“逆针灸”作为中医“治未病”的重要方法之一,即在机体无病、疾病发生之前或疾病发展轻浅之时,预先应用针灸的方法,以激发经络之气,扶助正气,调动机体内在调衡阴阳的能力,从而达到防止疾病的发生、减轻随后疾病的损害或保健延年的目的。逆针灸防病保健的作用已被大量研究证实,但其确切的作用机制尚在探询中。随着现代应激理论研究的深入,机体具有内源性保护机制已被广泛证实,利用人为手段使机体适度应激,预防或减轻随后疾病正引起医学界的高度重视。其特点在于:并非向机体补充大量的外源性物质,而是采取一些理化的预处理手段激发机体应激,启动机体内源性保护机制,加强机体对随后疾病损伤的抵抗与耐受力,是一种充分重视机体自身潜力激发与调动的整体调节方法。这正是“逆针灸”防病保健的特色所在,因而极具研究与开发潜力。更年期是妇女衰老进程中的关键启动期,此期由于肾元渐衰,天癸将竭,导致机体内环境急剧变化,多系统出现动荡与紊乱,机体处于一种生理性应激状态,在调整过程中不能适应而造成的由生理性应激转变成的病理性应激,致使70%～90%的更年期妇女出现繁杂多变的更年期综合征。更年期综合征的发生机理尚未完全明了,而应激反应中诱导生成的热休克蛋白与更年期时机体诸多环节如神经内分泌、免疫、抗氧化、雌激素受体、胰岛素受体功能等密切相关,因此探讨热休克蛋白在更年期机体中的作用,对于防治更年期综合征具有重要意义。本课题结合中医“治未病”的学术思想和现代应激医学理论,以自然更年期大鼠为模型,采用免疫组化、原位杂交、放射免疫、免疫比浊等方法,观察逆针灸关元穴对随后不同月龄自然更年期大鼠热休克蛋白、应激激素、神经递质、抗氧化相关因子及免疫因子等的影响,试图从HSP70及HSP70mRNA的角度探询逆针灸关元穴防治更年期综合征的相关应激机制。主要实验结果及结论如下:1.大鼠进入更年期后下丘脑不同核团HSP70及mRNA的表达随着月龄的增长表现不同的分布趋势,即视上核呈波动性升高,而室旁核和弓状核升高的幅度随着月龄的增长有下降的趋势。提示下丘脑不同核团在介导更年期中枢应激反应中发挥着不同的作用。下丘脑CRH含量的波动性降低和血浆ACTH、皮层5-HT含量的波动性升高,提示更年期大鼠HPA轴处于异常活跃状态,应激激素可能通过受体结合途径激活中枢吲哚类神经递质的大量合成。同时下丘脑抑制性应激激素β-EP含量却呈增龄性波动下降,皮层NE含量呈波动性升高,提示机体抑制性激素降低增强应激兴奋性的同时,也削弱了对儿茶酚胺神经元的紧张性抑制作用。预先针灸关元穴可不同程度的下调视上核HSP70及mRNA的表达,上调弓状核HSP70及mRNA的表达。提示逆针灸能够降低应激兴奋性因素,提高抑制性因素,有利于减缓应激中枢异常活跃状态。而对于应激反应中心核团的室旁核作用复杂,表现为各月龄HSP70mRNA的表达增强,说明逆针灸能够提高下丘脑室旁核应激调节中枢的警觉状态,转录大量HSP70mRNA以增强细胞应激保护能力。而12、14月龄HSP70表达的下调,可能与逆针灸提前诱导的HSP70在组织细胞中发挥保护效应减轻组织损伤、减缓应激反应程度有关;16月龄HSP70表达的升高,可能由于细胞内有害物质蓄积增多,逆针灸作用后使得机体翻译合成更多的HSP70以加强机体防御适应反应的能力,从而表现出双向性的调节作用。逆针灸下调CRH的作用主要表现在12、14月龄,对于血浆ACTH的调节表现为12月龄升高,14月龄降低,以缓和14月龄骤然升高的ACTH水平。而对于β-EP的上调和NE、5-HT的下调作用则主要体现在12月龄。提示逆针灸对中枢应激激素及神经递质的调节以早期效应为主。而逆针灸是否通过调节下丘脑重要核团HSP70及mRNA的表达及功能活动影响相应核团应激激素的合成和释放从而调节中枢神经递质的水平及其他神经内分泌功能,改善更年期精神及植物神经紊乱状态,有待于进一步研究。2.更年期机体应激反应使得CRH大量释放,能够造成对GnRH、垂体促性腺激素及卵巢雌激素合成的抑制作用,同时也可诱导细胞内热休克蛋白的生成。本实验观察到随着大鼠月龄的增长子宫HSP70及mRNA的表达呈先增后降的变化,早期热休克蛋白的增加可能与CRH的增加及局部雌激素水平下降对HSP抑制作用的降低有关,但随着组织器官的衰退,其蛋白合成能力下降,因而表现出晚期热休克蛋白及基因表达下调。同时随着机体进入更年期子宫SOD、NOS活性明显降低,而经逆针灸作用能增强各月龄组HSP70及mRNA的表达;且提高SOD、NOS的活性,主要表现在12、16月龄。提示逆针灸关元穴对随后更年期大鼠子宫产生保护作用机制可能通过减缓应激中枢的异常活跃状态,提高不同月龄外周子宫组织细胞HSP70及mRNA的表达,以促进组织SOD、NOS活性的增强,对抗应激激素及卵巢功能衰退引起的子宫靶器官的结构及功能的改变,提高机体抗氧化能力,增强NO/NOS的局部调节作用,减轻随后更年期衰老过程中自由基对组织器官的损害及组织器官功能紊乱,对于维持子宫正常的结构和功能,延缓子宫退行性变具有重要作用。3.更年期时机体的应激状态不仅引起机体神经内分泌系统的应答,同时也对免疫系统功能活动产生重要影响。本实验观察到更年期早期血清免疫因子IL-2、TNF-α的含量的下降,可能与机体应激导致血液和组织中神经递质及肽类激素含量升高,对免疫细胞产生的抑制性调节作用有关。而同时这些神经递质和肽类激素也能够诱导免疫细胞HSP的表达,因而表现出更年期大鼠早期脾脏HSP70mRNA表达的增高。随着月龄的增长,脾脏HSP70及mRNA的表达、血清IL-2的含量呈增龄性下降,而血清TNF-α的含量显著升高,提示机体在更年期衰老进程中由于自身保护能力和免疫功能的降低,可能导致有害物质在体内的蓄积,刺激TNF-α大量合成。而预先运用逆针灸的方法后,不同月龄更年期大鼠脾脏HSP70及mRNA的表达明显增强,血清IL-2含量显著升高,以14、16月龄尤为明显,且能提高更年期早期血清TNF-α的含量,降低更年期晚期TNF-α的过度表达。提示逆针灸关元穴对随后更年期大鼠免疫系统功能调整作用的机制可能与其调节应激中枢的功能状态,增强脾脏组织细胞HSP70及其基因表达,进而调节IL-2、TNF-α的合成、分泌及其生物学效应等相关,从而提高机体对外源性抗原的免疫应答能力,降低自身免疫炎性反应和组织器官损伤,减轻更年期应激状态下机体免疫系统功能的抑制或紊乱状态,对于延缓免疫系统退变和功能紊乱造成的机体衰老加速具有重要意义,并表现出良性、双向性的调整作用。综上所述:逆针灸关元穴可能通过调节中枢(下丘脑)及外周(子宫、脾脏)组织细胞热休克蛋白及基因的表达,调动了机体内在的抗病与应变能力;从而减缓中枢应激过度活跃状态,一定程度上降低脑内神经递质的异常分泌,提高子宫SOD、NOS的活性,调节血清免疫因子IL-2、TNF-α的含量,对于维持机体内环境稳定,调整更年期植物神经及免疫功能紊乱,改善子宫退行性变化具有一定作用。
刘巨洪[10]1995年在《人热休克蛋白90β（hsp90β）的转录调控》文中提出热休克蛋白90(HSP90)细胞生长、发育、分化及应急条件下对细胞的保护等生理过程中起着重要的作用。研究它的表达调控机制不仅有助于对其生理功能的进一步了解，也可为真核基因诱导表达调控机制的研究建立一个良好的模型。我们以前的研究表明人热休克蛋白90β基因受热和丝裂原的双重诱导，其表达调控主要表现在转录水平，并且对两种诱导因素表现出不同的表达动力学形式。为了深入研究hsp90β的转录调控机制，我们通过PCR分别扩增并克隆了人hsp90β上游(-1102／+68bp)和第一外显子、内含子(-4／+1530bp)片段。将它们进行删切后在荧光酶(Luc)和氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因真核表达载体的上游构建了18个亚克隆并分别转染Jurkat细胞。报告基因的酶活性检测、电泳迁移率分析及Jurkat细胞总RNA的引物延伸分析共同表明： 1．位于hsp90β上游-88／-20bp的启动子序列可以单独介导较高水平的基础转录，其转录水平明显高于相似转染条件下的其它一些启动子如IL-2、IL-2Rα、tk等，这使细胞在正常生理条件下可以维持较高水平的HSP90β的浓度，保障细胞正常生理、生化反应的进行。另外，hsp90β第一内含子的3′端存在一个启动子类似序列，它单独存在时的基础转录效率虽然远低于上游的启动子，却明显高于tk启动子，在上游启动子的协助下，它的基础转录效率可以有所升高，是hsp90β基础表达的一个组成部。热休克时它的转录效率可以被其上游的HSE提高。
参考文献：
[1]. 热休克基因表达及调控的研究[D]. 王艳林. 中国协和医科大学. 1995
[2]. 基于生物组学方法的纳米银细胞毒性机理研究[D]. 黄炎. 东南大学. 2015
[3]. 环境因素调控鼠疫耶尔森氏菌基因表达的比较转录谱学研究[D]. 韩延平. 中国人民解放军军事医学科学院. 2005
[4]. 清热复方对热休克大鼠HSP70基因表达调控的研究[D]. 邹素芬. 广州中医药大学. 2001
[5]. 调控北京鸭和番鸭抗热应激关键基因的筛选与鉴定[D]. 曾涛. 南京农业大学. 2015
[6]. FLHS中自噬及凋亡相关基因在肝脏、肾脏和小肠中的异常表达及白藜芦醇对其的调控作用[D]. 周思卉. 江西农业大学. 2017
[7]. 果寡糖对两种鲂属鱼生长、免疫和抗应激的研究[D]. 张春暖. 南京农业大学. 2015
[8]. 外源基因在集胞藻6803中高效表达及调控的研究[D]. 魏兰珍. 华东师范大学. 2010
[9]. “逆针灸”对更年期大鼠热休克蛋白及应激相关机制影响的研究[D]. 郑玲. 北京中医药大学. 2007
[10]. 人热休克蛋白90β（hsp90β）的转录调控[D]. 刘巨洪. 中国协和医科大学. 1995
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