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摘要：目的 探讨下边缘皮层（IL脑区）的兴奋性和抑制性突触传递对小鼠焦虑样行为的调控作用 方法 成年C57BL/6J小鼠30只，随机分成三组（ACSF对照组、GABAA受体激动剂毒蝇蕈醇组、谷氨酸受体拮抗剂犬尿烯酸组），每组10只。用脑内立体定位技术将导管埋到小鼠的IL脑区，一周后通过导管进行给药，给药后1h进行开放旷场实验。将小鼠休息一个星期后，重复给药，再进行高架十字迷宫实验。结果 犬尿烯酸组和毒蝇蕈醇组小鼠的焦虑样行为减少，但其活动能力没有改变。结论 无论是用犬尿烯酸抑制了IL脑区的兴奋性传递或者用毒蝇蕈醇增加IL脑区的抑制性传递均可以减少小鼠的焦虑样行为。
关键词：毒蝇蕈醇；犬尿烯酸；突触传递；IL 脑区；焦虑
[Abstract] Objective To explore the function of excitatory and inhibitory neurotransmission of infralimbic cortex （IL cortex） on regulation of anxiety.Methods Thirty adult C57BL/6J mice were randomly divided into three groups （ACSF group，muscimol group，kynurenic acid group） with 10 rats in each group.Canulas were stereotactically implanted into the IL cortex.One week later，drugs were infused through the guide cannulas.1 hour after the drug infusion，mice underwent the open field test.Mice were allowed to rest for a week，and were given drug treatment.1 hour after the drug injection，mice underwent the elevated plus maze test.Results Both muscimol group and kynurenic acid group showed decreased anxiety-like behaviors，with no impairment of locomotor activity.Conclusion Whether inhibiting excitatory neurotransmission of the IL cortex with kynurenic acid or increasing inhibitory neurotransmission of IL cortex with muscimol could decrease mice’s anxiety-like behaviors.
Key words：muscimol；kynurenic acid；transmission；IL cortex；anxiety
以往研究表明大脑内谷氨酸受体介导的兴奋性突触传递和γ-氨基丁酸受体介导的抑制性突触传递对调节焦虑相关的行为具有很重要的作用[1]。短暂的强烈刺激足以引起啮齿动物前额叶皮层（mPFC）脑区神经元的结构的显著重塑[2]。mPFC在介导啮齿类动物的焦虑样行为中扮演一个相当复杂的角色[2-4]，然而作为组成前额叶皮层（mPFC）的一个重要亚脑区—下边缘皮层（IL）是否在焦虑病的发病过程中的作用存在争议。本研究旨在观察IL脑区的兴奋性和抑制性突触传递对焦虑的调控功能，为焦虑病的临床治疗提供参考。
1．材料与方法
1.1 研究对象 体重约为20-25g，年龄约为10-12周的成年C57 BL/B公小鼠。饲养环境为每天12小时光照（8：00 A.M.至8：00 P.M），4-5只每笼，室温为21-25℃，小鼠可以自由涉水和进食。实验过程采用随机对照单盲实验研究，
1.2 方法
1.2.1 立体定位脑内埋管
C57BL/6J小鼠经腹腔注射10%的水合氯醛（0.35 g/kg体重）麻醉后，固定于脑立体定位仪上，头顶部去毛，消毒皮肤，头顶部正中切口，以10%过氧化氢溶液去除结缔组织，暴露前囟。以持针器夹持连接有塑料软管的不锈钢导管，并将持针器固定于立体定位仪。按IL脑区（前囟后1.9 mm，矢状缝旁0.4 mm，脑表面下2.75 mm）定位并标记，后使用打磨机钻孔。进针时，导管进入孔内时归零，缓慢进针至IL脑区定位深度。调制玻璃离子水门汀至半凝固状，小心将其涂抹于进针位点，待水门汀凝固后小心解除持针器，使导管留在小鼠脑内，并封闭塑料管，以免引起感染。将术后小鼠放于保暖性较好的盒中，自由饮食，恢复一周以上后进行后续实验。
1.2.2 实验分组及给药
实验分组如下：ACSF对照组、GABAA受体激动剂毒蝇蕈醇组（0.1nmol）、谷氨酸受体拮抗剂犬尿烯酸组（0.1mM）。药物经连接于微量进样器上的细塑料管通过预先固定在小鼠侧脑室内的不锈钢导管注入IL脑区，事先应使药物充满不锈钢导管及细塑料管，后给予剂量为o.5μl，注射速率为0.5μl/min，给药完毕后停留数分钟后拔出微量进样器，并封闭塑料管。一小时后进行动物行为学检测。每组小鼠进行多次打药和打药后的焦虑样行为检测实验，各项实验进行之间应相隔3天以上，以保证动物充分休息。
1.2.3 高架十字迷宫实验
将给药后一小时的小鼠置于迷宫中央，头朝开臂，观察者距离迷宫中心至少１m，且应在小鼠视线之外，保持实验室安静。使用摄像头记录下小鼠的行为视频，分别记录实验期间（通常为5min）小鼠进入开臂和闭臂的次数和在两臂滞留时间，并以后者作为检测指标。
1.2.4 旷场实验
将规格为40*70*70的实验箱置于隔音箱内，维持人工照明。将给药一小时后的动物放入箱内底面中心，同时进行摄像和计时，记录动物所经过的路程，速度以及在中心区域停留时间作为参考指标。实验时间为5min。
1.2.5 立体定位技术鉴定
将实验结束的小鼠经10%水合氯醛麻醉，开胸暴露心脏，直视下将穿刺针经左心室刺入升主动脉。先用生理盐水100ml快速洗注，再灌注含4%多聚甲醛的缓冲液500ml。开颅取脑，多聚甲醛浸泡4h后流水冲洗1h，然后放入30%蔗糖溶液脱水。48h后待脑沉入底部后进行冰冻切片，以观察IL脑区部位是否有染料痕迹。
1.3 数据统计
用SPSS13.0软件进行统计分析，实验数据用均数±标准差（Mean±SD）表示。采用One-Way ANOVA方差分析进行数据处理，各组均数间的多重比较采用LSD法（Least-significant difference test），如果方差不齐则用Welch法，各组间多重比较采用dunnett’s T3检验。P<0.05被认为有显著差异。
2．结果
Table 1：The open field test one hour after the drug treatment
*P < 0.05，**P < 0.01；多重比较的P值为各加药组分别与生理盐水组进行比较的P值；表中数据格式为?x±s
2.2高架十字迷宫实验中，与生理盐水组相比，毒蝇蕈醇组和犬尿烯酸组小鼠在开放臂待的时间增多（P < 0.05，P < 0.01），在闭合臂待的时间减少（P < 0.01，P < 0.01），说明药物处理组的焦虑样行为降低，见表2。
3．讨论
焦虑是动物面对应激刺激的一个正常反应，同时焦虑也属于自然界基本生存法则的一部分。焦虑可以激励人们更好得处理困境和危险的情况。但是当焦虑过度，它可能妨碍人类的正常生活而发展成焦虑性障碍病。经典的1，4-苯二氮卓类有着显著的抗焦虑作用，是已公认的治疗焦虑病的标准用药[5]。然而，苯二氮卓类的镇静催眠、肌肉松弛、和破坏记忆等副作用可能限制了他们的治疗使用。因此，有必要对焦虑发生的神经生物学机制和病理生理学进行研究，从而推动焦虑病的治疗的发展。
新进研究表明短暂的强烈刺激足以引起啮齿动物前额叶皮层（mPFC）脑区神经元的结构的显著重塑[2]。mPFC由内侧无颗粒皮层，前具带皮层（AC），缘前皮层（PL），下边缘皮层（IL）组成，它在处理认知相关事件和调控应激反应中觉有十分重要的作用[3，6-8]。内侧前额叶皮层（mPFC）在介导啮齿类动物的焦虑样行为中扮演一个相当复杂的角色[2-4]，这可能是由于它的不同亚区的功能不同。作为组成前额叶皮层（mPFC）的一个重要亚脑区—下边缘皮层（IL）是否在焦虑病的发病过程中的作用存在争议[2，9]，由此需要进一步的研究来阐明IL脑区调控焦虑的功能和分子机制等。我们的研究结果提供了有力的证据支持可以持久的假说，IL脑区的神经传递对调控焦虑样的行为具有重要作用。以往的研究提示IL脑区的GABAA受体受到抑制增加焦虑样行为[9]，本实验用GABAA受体激动剂毒蝇蕈醇验证了增强IL脑区的GABAA受体后能减少焦虑样行为，同时本实验还发现用谷氨酸受体拮抗剂犬尿烯酸抑制IL脑区的谷氨酸受体后同样能减少焦虑样行为。
开放旷场实验和高架十字迷宫实验是测试小鼠焦虑状态的经典模型实验。同时在开放旷场实验中，小鼠在5分钟的测试时间内的总的运动路程可作为检测小鼠运动能力的指标。虽然有实验报道过，小鼠前额叶皮层的GABA合成受到抑制后，在24小时内的活动增多[10]，但我们的实验发现无论是用犬尿烯酸抑制了IL脑区的兴奋性传递或者用毒蝇蕈醇增加IL脑区的抑制性传递，对小鼠在打药1h后的5分钟内的运动能力没有损伤。导致该矛盾结果的原因可能是由于所使用小鼠的品系不同或者测试运动的时间不同所造成的。
本实验证明了犬尿烯酸抑制了IL脑区的兴奋性传递或者用毒蝇蕈醇增加IL脑区的抑制性传递减少焦虑样行为，但对小鼠活动能力没有影响，该现象可为更好治疗焦虑病，改善焦虑病的治疗用药提供更多的神经科学理论依据。
参考文献：
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论文作者:郭永洋,于慧静,柳晓静
论文发表刊物:《健康世界》2016年第7期
论文发表时间:2016/7/12
标签：小鼠论文; 焦虑论文; 皮层论文; 受体论文; 额叶论文; 抑制论文; 突触论文; 《健康世界》2016年第7期论文;