青岛市传染病医院 山东青岛 266033
摘要：目的 探讨青岛地区汉族人群中慢性乙型病毒性肝炎患者用聚乙二醇干扰素α-2a治疗48周的疗效与人类白细胞抗原部分等位基因（HLA-DRB1）的关系，对指导慢性乙型病毒性肝炎的临床抗病毒治疗具有非常重要的理论和实际意义，为乙型肝炎的防治提供免疫遗传学方面的依据。方法 以接受聚乙二醇干扰素α-2a正规治疗48周的40例青岛地区汉族人群中慢性乙型肝炎患者作为研究对象，应用聚合酶链反应-序列特异性引物(PCR-SSP)技术对患者的HLA -II 类抗原的DRB1*04、*07进行等位基因检测，SC2000统计软件进行结果分析。结果 40例慢性乙型肝炎患者接受聚乙二醇干扰素α-2a治疗48周后，完全应答组有19例(47.5%)，部分应答组有10例(25%)，无应答组有11例(27.5%)。无应答组11例中，HLA-DRB1*04携带者4例，部分、完全应答组29例中，HLA-DRB1*04携带者1例，无应答组的HLA-DRB1*04携带率高于部分、完全应答组(P＜0.05，OR＝16.0)。无应答组11例中，HLA-DRB1*07携带者7例，部分、完全应答组29例中，HLA-DRB1*07携带者6例，无应答组的HLA-DRB1*07携带率高于部分、完全应答组(P＜0.05，OR＝6.7)。结论 青岛地区汉族人群中慢性乙型肝炎聚乙二醇干扰素α-2a治疗无应答与HLA-DRB1*04、*07呈正相关。
关键词：慢性乙型肝炎；HLA-DRB1抗原； 聚乙二醇干扰素α-2a； 聚合酶链反应；序列特异性引物
Abstract：Objective To study the relationship between efficacy of PEG-interferonα-2a for forty-eight weeks and some HLA alleles (HLA-DRB1) in the patients with chronic viral hepatitis B from Qingdao of the Han nationality, and it has very important theoretic practical meaning to guide clinical treatment of antivirus of patients with chronic viral hepatitis B, and provides immuno-genetic knowledge for the prevention and cure of hepatitis B virus infection. Methods Forty patients with chronic viral hepatitis B in a Qingdao population of the Han nationality were subjected to a standard course of treatment with PEG-interferonα-2a for 48 weeks. HLA-DRB1*04、*07 were detected by using the polymerase chain reaction-sequence specific primer(PCR-SSP) technique. The data were analysed by SC2000 software. Results After forty patients with chronic viral hepatitis B were subjected to a course of treatment with PEG-interferonα-2a for 48 weeks, there were nineteen patients in the complete-responders, and ten patients in the partial-responders, and eleven patients in non-responders. The patients of HLA-DRB1*04 in eleven non-responders were four, and in twenty-nine partial- or complete-responders was one. The frequency of HLA-DRB1*04 in non-responders was higher than that in the partial-or complete-responders (P＜0.05,OR＝16.0). The patients of HLA-DRB1*07 in eleven non-responders were seven, and in twenty-nine partial- or complete-responders were six. The frequency of HLA-DRB1*07 in non-responders was higher than that in the partial- or complete-responders (P＜0.05,OR＝6.7).Conclusions In a Qingdao population of the Han nationality, no response of PEG-interferonα-2a therapy in the patients with chronic viral hepatitis B was correlated positively with HLA-DRB1*04*、07.
Key words: Chronic hepatitis B; HLA-DRB1 antigen; PEG-interferonα-2a; Polymerase chain reaction; Sequence specific primes
乙型病毒性肝炎是世界范围的严重公共卫生问题之一,我国约有1.2亿人携带乙型肝炎病毒，其中慢性乙型肝炎患者约3000万人，现患病率为 2700/10万[1]。HBV感染可引起多种急、慢性肝病,从无症状感染到严重的进展性肝病 , 最终可能发展为肝硬化和肝癌。对人类健康造成极大威胁。提高其治愈率是国内外的重大科研课题。但暴露于同等危险环境中的不同人群，是否感染HBV，感染HBV后是否慢性化及重型化以及抗病毒治疗效果在不同个体间也存在很大差异。近年来随着长效干扰素的面世，聚乙二醇干扰素α-2a对慢性乙型肝炎的疗效显著，其疗效优于普通干扰素,但仍有部分慢性乙型肝炎患者对聚乙二醇干扰素治疗无应答。HBV感染后个体有不同转归及乙型肝炎患者干扰素治疗后应答不同，除了与病毒本身的因素有关外，更重要的是由于不同个体对乙型肝炎病毒所发生的免疫反应不同[2,3]。人类白细胞抗原（HLA）复合体在HBV 感染方面的作用日益受到重视。目前已经明确HLA-II抗原与多种疾病相关[4]。有关HLA-DRB1与干扰素治疗敏感性关系的研究较少，且研究结果并不一致 , 可能与种族和地域间的差异有关 。本研究初步探讨青岛地区汉族人群HLA-DRB1等位基因多态性对乙型病毒性肝炎聚乙二醇干扰素疗效的影响。对指导慢性乙型病毒性肝炎的临床抗病毒治疗具有非常重要的理论和实际意义。
一、材料与方法：
（一）药物：聚乙二醇干扰素α-2a（PEG-interferonα-2a，）上海罗氏制药有限公司生产。
（二）研究对象及用药方案：
为青岛市传染病医院2009年3月～2010年10月间接受聚乙二醇干扰素α-2a：180μg每周一次，皮下注射，总疗程48周，治疗随访的青岛地区汉族人群中慢性乙型病毒性肝炎患者40例。诊断符合2000年全国传染病与寄生虫病学术会议（西安）修订的病毒性肝炎防治方案的临床诊断标准[5]，治疗前血清丙氨酸转氨酶（ALT）异常，乙型肝炎病毒标志物：HBsAg、HBeAg、抗-HBc及HBV DNA均阳性，排除HAV、HCV、HDV、HEV的感染，治疗前1年内未使用过抗病毒及免疫调节药物。其中男27例，女13例，年龄从19岁～57岁，平均年龄为37岁±1.5岁。分别于治疗前、治疗4、8、12、24、48周后抽血检测ALT、乙型肝炎病毒标志物及HBV DNA（采用PCR定量法）。治疗前检测HLA-DRB1*04、*07。治疗48周时近期疗效判断标准：根据治疗结果将患者分为有应答组和无应答组，有应答组包括完全应答即HBeAg阴转，抗-HBe阳转，HBV DNA阴转，血清ALT正常，部分应答即HBV DNA滴度下降，血清ALT正常；无应答组即血清ALT异常、HBV DNA滴度无变化甚至升高。
（三）标本的采集与处理：
无菌采集慢性乙型肝炎患者治疗前枸橼酸钠抗凝静脉血5ml，按全血DNA抽提试剂盒（大连Takara生物制品公司产品）操作程序分离纯化基因组DNA，于-20℃保存，用于HLA-DRB1*04、*07扩增检测。
（四）HLA-DRB1*04、*07的检测：
1．引物设计
应用聚合酶链反应-序列特异性引物（PCR-SSP）方法。根据第11届国际HLA Workshop会议确定的HLA-DRB1基因核苷酸序列[6]，按照引物设计基本原理，设计相应的特异性引物序列（由大连Takara生物制品公司合成）。
HLA-DRB1*04引物序列为：
（5‘→3’）：正义链，GTTTCTTGGAGCAGGTTAAACA 反义链，CTGCAGTAGGTGTCCACCG
HLA-DRB1*07引物序列为：
（5‘→3’）：正义链，CCGGATCCTTCGTGTCCCCAGAGCAC 反义链，TCGCCGCTGCACTGTGAAG
另设一内参照引物，检测PCR反应体系是否正常进行，本实验选用人生长激素基因，human growth hormone gene ），其引物序列为：
（5‘→3’）：正义链，GCCTTCCCAACCATTCCCTTA 反义链，TCACGGATTTCTCTTGTGTTTC
2．PCR反应
利用试剂盒（大连Takara生物制品公司产品）提供的标准条件进行反应。
3 .PCR反应质量控制
每次扩增均重复一次,每次扩增均设阳性对照和阴性对照。。
4. 扩增产物分析
取10μlPCR扩增产物于含溴化乙锭（0.5μg/ml）的1.5%琼脂糖凝胶中电泳，80V，30分钟。取出凝胶，在紫外投射仪下观察结果并照相，分析判断和确定HLA-DRB1*04、*07型别。
（五）统计学处理：
数据统计使用SC2000统计软件。无应答组和部分、完全应答组的基因频率比较用四格表的x2检验，P<0.05为差异有显著性意义。关联强度用比值比（Odds ratio,OR）反映，按Woolf公式计算，OR=ad/bc。
二、结果：
40例慢性乙型肝炎患者接受聚乙二醇干扰素α-2a（派罗欣）治疗48周后，完全应答者有19例(47.5%)，部分应答者有10例(25%)，无应答者有11例(27.5%)。
（一）治疗无应答组与部分、完全应答组的HLA-DRB1*04携带率的比较：无应答组的HLA-DRB1*04携带率高于部分、完全应答组(P＜0.05,OR＝16.0)。见表2.1。
（二）治疗无应答组与部分、完全应答组的HLA-DRB1*07携带率的比较：无应答组的HLA-DRB1*07携带率高于部分、完全应答组(P＜0.05,OR＝6.7)。见表2.2。
泳道7，13，24，26，37是40例慢乙肝患者中HLA-DRB1*04阳性扩增产物。
泳道1,3,5,6,8,11,12,15,17,19,23,31,40是40例慢乙肝患者中HLA-DRB1*07阳性扩增产物。
三、讨论：
不同个体感染HBV后，临床表现复杂多样，对干扰素的治疗效果差异，除与病毒本身因素有关外，更重要的是由于不同个体对HBV所发生的免疫反应不同 [2,3]，而后者主要取决于人类主要组织相容性复合体(MHC)，人类白细胞抗原（HLA）复合体是MHC的基因产物，与抗HBV免疫反应有着密切的关系。
1 HLA-Ⅱ类抗原的概况
HLA 复合体是迄今已知的人体最复杂的基因体系，作为个体组织细胞的遗传标志，在抗原识别、免疫应答和免疫调控方面起到重要作用。它包括I、Ⅱ、Ⅲ类基因， II类基因包括HLA-DQ、DP、DR三个亚区和新近确定的DN、DO、DM三个亚区。HLA-Ⅱ类抗原被认为是促进免疫应答的一类重要的辅佐分子。研究表明，对HBV抗原物质的免疫应答水平存在的明显个体差异是由免疫应答基因（Ir基因）决定的，而Ir基因的功能主要由HLA-DR基因承担[7]。DR可分成DRB1-9,目前针对HLA与疾病的相关性的研究主要集中在HLA-II 类基因的DRB1亚区。
2 HLA-Ⅱ类抗原在抗HBV感染免疫中的作用
HLA-Ⅱ类分子主要参与HBV抗原物质的抗原识别和提呈过程，是宿主识别和清除HBV的重要环节。大多数学者认为， HLA-Ⅱ限制性的核衣壳抗原特异性CD4+Th细胞反应对于病毒的清除起关键作用.HLA-Ⅱ类分子参与CD4+的Th细胞的分化 [4]。目前认为，HBV抗原特异性的Th1/Th2的平衡状态可能影响HBV感染慢性化的发生和持续，HBV抗原特异性的Th1细胞因子占优势时，倾向于发生急性或自限性感染， Th2 细胞因子占优势时，倾向于发生持续性的HBV感染[8,9]。
3 聚乙二醇干扰素α-2a治疗慢性HBV感染的优点
聚乙二醇干扰素α-2a是聚乙二醇（PEG）与重组干扰素α-2a结合形成的长效干扰素。当干扰素分子聚乙二醇化以后，聚乙二醇分子就在干扰素分子外面形成一个分子屏障，降低其免疫原性，保护其免受酶的分解[10]。由于HBV的动力学特点，其HBV DNA的复制很快。干扰素治疗时需要维持恒定的血药浓度以发挥最大的病毒抑制作用。聚乙二醇干扰素每周虽然只给药1次，但在给药后的1周内，血中可维持恒定的干扰素浓度。因此对病毒的抑制作用也是持续性的，而非间歇性的，不存在普通干扰素的“峰-谷”效应，这是聚乙二醇干扰素疗效优于普通干扰素的主要原因。聚乙二醇干扰素与细胞表面的特异性受体结合，触发细胞内复杂的信号传递途径并迅速激活基因转录，抑制感染细胞内的病毒复制，并具有免疫调节作用。
4 HLA-Ⅱ类抗原在α-干扰素治疗慢性HBV感染中的作用
有研究表明，应用干扰素-α治疗时，无论干扰素治疗结果如何，干扰素-α引起的CD4+的增殖依赖于HLA-Ⅱ类分子的表达[11] 。另一方面，干扰素-α作为一种免疫调节因子，通过免疫细胞间的相互作用来平衡HBV感染时的异常免疫状态，免疫细胞间的相互作用也受到HLA的调控和约束。由此可见，慢性乙型肝炎患者间HLA的差异不仅注定了慢性乙型肝炎的发病具有宿主遗传的差别，也决定了不同感染人群对干扰素治疗敏感性的差别。
5 HLA-II类抗原与乙型肝炎及干扰素治疗敏感性的关系
有关HLA-II类抗原与乙型肝炎及干扰素治疗敏感性关系的研究相对较少，且研究结果并不一致，可能与种族和地域间的差异有关。蒋业贵等[12]研究发现携带HLA-DRB1*1001的慢乙肝患者发生重型肝炎的可能性增高。袁俊华等[13]的对山东地区慢乙肝患者研究也表明HLA-DRB1*0701与HBV感染的持续化有关。奚敏[14]等研究发现干扰素-α治疗上海地区慢乙肝患者无应答与HLA-DRB1*04呈正相关，与HLA-DRB1*0505 HLA-DRB1*0301呈负相关。Cotrina等[15]在一组美国成人的研究中也显示HLA- DRB1*1302具有对抗HBV 感染慢性化的作用，并发现HLA-DRB1*0401在慢性乙型、丙型肝炎患者中携带率低。Chen等[16]发现HBV持续感染者中HLA-B8，-DR3，-A30和DQA1*0501基因频率明显增高，提示这些基因型与HBV感染慢性化形成有关。
6 研究的临床意义
本研究结果表明青岛地区汉族人群中慢性乙型肝炎患者聚乙二醇干扰素α-2a治疗无应答与HLA-DRB1*04、*07呈正相关。本结果作为研究慢性乙型肝炎聚乙二醇干扰素疗效与HLA-DRB1等位基因的相关性的初步成果，可能会成为解释青岛地区汉族人群HLA-DRB1等位基因的差异是影响慢性乙型肝炎患者对干扰素敏感性的重要因素之一。有关慢性乙型肝炎聚乙二醇干扰素α-2a治疗敏感性与HLA-DRB1相关性的研究不仅有利于探讨干扰素治疗慢性乙型肝炎的作用机制，而且可以为患者的预后提供依据，对指导慢性乙型病毒性肝炎的临床抗病毒治疗提供理论基础。
参考文献：
1骆抗先，编著．乙型肝炎基础与临床．第二版．北京：人民卫生出版社，2001，3，385-389
2Mark R, Thurz M.R.C.P, Dominec Kwiakowski, et al. Association between an MHC class Ⅱ alleles and clearance of hepatitis B virus in the Gambia. New Engl J Med, 1995,332(13):1065-1068
3Czaja A J, Carpenter H A, Santrach P J, et al. Significance of human leukocyte antigen DR3 and DR4 in chronic viral hepatitis. Dig Dis Sci, 1995,40(10):2098-2106
4沈晶晶，冀英，关晓蕾，等．HLA-DRB1*10与中国人慢性乙肝关联．中华微生物学和免疫学杂志，1999，19：58-59
5 中华医学会传染病与寄生虫病学会、肝病学分会．病毒性肝炎防治方案．中华传染病杂志，2001，19：56-62
6Teven G.E, Marsh, Julia G, Bodmer. HLA class Ⅱ nucleotiod sequence. Immunogenetics,1991,33:321-324
7 曹孟德，秦东春，孙含笑，主编．HLA分子生物学及临床应用．郑州：河南医科大学出版社，1998，44-45
8Nishimura T, Ohta A. A critical role for antigen-specfic Th1 cells in acute liver injury in mice. J Immunol, 1999,162(11):6503-6509
9 Lee M, Lee SK, Son M, et al. Expression of Th1 and Th2 type cytokines responding to HBsAg and HbxAg in chronic hepatitis B patients. J Korean Men Sci, 1999,14(2):175-181
10 Ue P. Chnical pharmacology of pegylated interferon α-2 b. In:35th annual meeting of the European Association for the Study of the Liver. 2000,13
11Alric L, Izopet J, Fort M, et al. Study of the association between major histocompatibility complex class Ⅱ genes and the response to interferon-αin patients with chronic hepatitis C infection. Human Immunology 1999,60:516-523
12蒋业贵，王宇明．人类白细胞抗原-DRB1*1001与慢性乙型肝炎重型化密切关联．中华肝脏病杂志，2003，11：256
13袁俊华，孙成刚．山东地区慢乙肝的预后与HLA-DRB1等位基因相关性研究．临床肝胆病杂志，2004，20（4）：236-237
14奚敏，臧国庆，冯明亮，等．慢性乙型肝炎干扰素疗效与人类白细胞抗原-等位基因的关系．中华传染病杂志，2004，22(4)：242-245
15Cotrina M, Buti M, Jardi R,et al. Study of HLA- Ⅱ antigens in chronic hepatitis C and B and in acute hepatitis B. Gastroenterol Hepatol, 1997, 20:115-118
16 Chen DF, Kliem V, Endres W, et al. Relationship between human leukocyte antigen determinants and courses of hepatitis B virus infection in Caucasian patients with end-stage renal disease. Scand J Gastroenterol, 1996, 31: 1211-1215
论文作者:王晓彬
论文发表刊物:《临床医学教育》2018年4期
论文发表时间:2018/5/11
标签：干扰素论文; 乙型肝炎论文; 抗原论文; 引物论文; 免疫论文; 患者论文; 基因论文; 《临床医学教育》2018年4期论文;