贺慧霞[1]2005年在《牙髓干细胞分离鉴定及其制备组织工程化牙本质牙髓复合体的实验研究》文中研究指明干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的未分化细胞,按来源分为胚胎干细胞和成体干细胞。成体干细胞因具有来源广泛、可塑性强、无排斥反应等优势成为近年来研究的热点之一。目前已经在机体几乎所有组织中发现了成体干细胞。这些成体干细胞的发现不仅为机体损伤修复机理研究提供了新的研究平台,而且将通过干细胞移植或构建人工组织或器官在人类多种疾病治疗史上产生划时代的影响。 牙髓干细胞属于成体干细胞,2000年由Gronthos首次提出。其主要特征之一是在一定条件下能形成牙本质牙髓样复合体,这将为其组织工程化研究提供理论依据和可靠的细胞来源。目前已有关于人、小鼠、大鼠、犬等牙髓干细胞培养成功的报道,但多仅限于对其生物学特性研究。最近虽有关于其表型、向成牙本质样细胞分化的研究,但尚处于起步阶段,缺乏对牙髓干细胞基础和应用方面较为全面而深入的研究。本研究在对人、大鼠牙髓干细胞培养、鉴定的基础上,进行了以其为种子细胞,构建组织工程化牙本质牙髓复合体的研究,并将其应用于大鼠牙齿部分去髓模型的修复再生治疗中,为牙本质牙髓复合体人工生物器官的构建和牙髓再生治疗进行了有益的探索,提供重要的理论和实验依据;并为牙本质形成机制和牙齿再生研究奠定了基础。 本研究的主要内容和结果如下:
郭红延[2]2004年在《大鼠牙髓干细胞培养鉴定及生物学特性研究》文中研究表明干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞，它包括胚胎干细胞和成体干细胞。目前已经成功分离培养包括来自骨髓、肌肉、神经、上皮等组织的成体干细胞。牙髓干细胞是位于牙髓组织的一种成体干细胞。2000年，Gronthos等首先成功地分离培养出人牙髓干细胞，为干细胞的研究开辟了一个新的领域。牙髓干细胞具有同其他成体干细胞相似的生物学特性，具有较强的克隆形成能力，可以分化为牙髓组织中的终末功能细胞并具有一定的横向分化能力。目前国内外只有人牙髓干细胞培养成功的报道，鼠牙髓干细胞的相关研究国内外还未见报道，而鼠是实验研究最常用的模型，它具有取材容易、与人同源性较高等优点，因此本研究以大鼠为实验对象，采用细胞克隆分离培养方式进行大鼠牙髓干细胞的培养，同时对大鼠牙髓干细胞进行了一系列生物学特性研究，为牙髓干细胞的研究增加了新的内容，为牙齿再生的研究奠定基础。 第一部分：大鼠牙髓干细胞的分离培养及鉴定 本部分实验采用细胞克隆分离培养的方式，对大鼠牙髓细胞进行克隆筛选，将获得的单细胞克隆来源的细胞进行体外诱导分化及体内接种实验，结果共获得4株单细胞克隆来源细胞株(282、6A11、8A1、8A7)，对282细胞株进行矿化液诱导，部分细胞出现细长的单个胞浆突起，与成牙本质细胞胞浆突起相似，同时出现牙本质特异性蛋白DSPP的表达。裸鼠体内种植实验结果表明，该株细胞经过8周的体内种植后，形成了类牙髓牙本质复合体结构，该结构具有前期牙本质、矿化牙本质、成牙本质细胞层及牙髓组织，第四军医大学博士学位论文与正常牙髓牙本质复合体结构相似，并表达牙本质特异性蛋白DSP。 第二部分:大鼠牙髓千细胞的生物学特征分析 首次培养成功的细胞株明确其生物学特征至关重要，本部分实验研究了大鼠牙髓干细胞的形态学、生长及增殖、矿化能力、细胞克隆形成等一系列细胞生物学特征，同时对大鼠牙髓干细胞的细胞周期与核型进行了检测，旨在通过一系列细胞生物学研究方法对所获得的2B2株牙髓干细胞进行综合分析及评测。结果显示大鼠牙髓干细胞2B2株为成纤维细胞样生长，细胞密集区可见多角形或椭圆形细胞。从细胞生长曲线图来看，大鼠牙髓千细胞的生长能力弱于大鼠骨髓间充质干细胞，其生长曲线在8一10天达到最大值，该细胞株群体倍增时间为58.3小时。大鼠牙髓干细胞的克隆形成率为2.55%，较第一部分大鼠牙髓细胞的克隆形成率为高。细胞核型及致瘤性检测表明该细胞株无染色体畸形及致瘤性等肿瘤细胞特性。大鼠牙髓千细胞经过一定的诱导后，出现了矿化结节，表明具有一定的矿化能力。以上对牙髓干细胞的生物学特性研究为其进一步的功能学研究奠定了基础。 第叁部分:大鼠牙髓千细胞的功能学特征分析 本部分实验从叁个方面对大鼠牙髓干细胞2B2株进行研究。实验一采用免疫组织化学的方法进行了大鼠牙髓干细胞相关蛋白的检测。研究结果表明，未经诱导的大鼠牙髓干细胞DMPI仅个别细胞阳性表达，DSP少量细胞阳性表达，而CBFAI、BMPZ为阳性染色。经矿化液7一10天的诱导后，大鼠牙髓干细胞DSP染色出现部分细胞强阳性，DMPI出现阳性表达，表明矿化液的诱导使部分大鼠牙髓干细胞具有了成牙本质细胞的特征。实验二对大鼠牙髓干细胞的脂肪、神经、肌肉转分化进行研究。在对大鼠牙髓干细胞进行适当的诱导后，采用RT一PCR的方法对诱导前后相关特异性蛋白mRNA的表达进行检测，结果表明:大鼠牙髓干细胞可以向脂肪细胞系进行转分化，表明具有一定的横向分化能力，而向神经及肌肉细胞系方向的分化没有阳性结果，表明常规诱导条件下，大鼠牙髓干细胞不具备向神经细胞系、肌细胞系横向分化的能力。实验叁采用TGF一p做为细胞诱导因子，对大鼠牙髓干细胞进行一定的诱导，研究其生物学特性的改变。结果表明经过TGF一p诱导后，大鼠牙髓干细胞内总蛋白含量增加，细胞生长及增殖能力明显增强，碱性磷酸酶活性增强表明该细胞具有了更强的矿化能力，诱导后出现DSPP第四军医大学博士学位论文的阳性表达表明TGF一p可以促使该细胞株向成牙本质细胞方向分化。 综上所述，本研究以大鼠作为研究对象，采用细胞克隆分离培养模式首次成功获得了大鼠牙髓千细胞2B2株，并对其进行了鉴定。在此基础上对该细胞株的细胞生物学特性进行了一系列的研究，为牙髓干细胞研究领域提供了新的研究工具，为牙齿再生及牙齿发育研究奠定了基础，具有重要的理论意义和潜在的临床应用前景.
陆群[3]2002年在《牙髓干细胞分离培养鉴定和体外诱导分化的研究》文中研究表明牙髓干细胞的研究是目前牙髓生物学领域一个崭新的课题，它对认识牙髓损伤修复机理、探索新的保存牙髓治疗技术具有重要的意义。本研究着眼于小鼠牙髓干细胞分离、培养、鉴定的实验研究，为研究牙髓干细胞体外定向诱导分化创建可靠的实验模型。并初步探讨Notch信号在牙髓干细胞中的生物学功能。 我们成功地从小鼠牙髓组织中培养获得牙髓干细胞，进一步分析结果显示：1)牙髓干细胞有增殖快的特点，细胞呈集落状生长，集落形成率为1.6-2.5／10~4个细胞。2)H．E．染色，见细胞有体小、核大的特点，有较多的双核细胞，细胞间的界限不清。3)碱性磷酸酶染色阳性。4)细胞表型组化鉴定Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ、Osteonectin、Osteopontin、FGF-2、BSP染色阳性，而DSPP染色阴性。5)端粒酶 第口旱巨大卿馋士学正枯文活性分析结果，牙髓干细胞与肿瘤细胞有着本质上的区别，为非永生性细胞，且端粒酶活性随着体外培养时间延长而降低。6）电镜观察牙髓干细胞间存在细胞连接，在一定程度上说明细胞间有着较复杂的信号通讯方式，并影响着牙髓干细胞的增殖与分化。 本课题对获得的小鼠牙髓干细胞进行了体外诱导分化实验。用BMP》TGF－e、FGF等细胞因子对牙髓干细胞体外诱导8天DSPPIn－RNA的表达，用 RT－PCR分析，结果表明有 DSPP InRNA的表达，提示成牙本质细胞的分化成熟是牙髓干细胞和前体细胞增生并沿着一定方向分阶段分化的结果。DSPP是终末分化的成牙本质细胞的特征蛋白，说明牙髓干细胞可在BMPZ、TGF－p、FGF细胞因子诱导作用下，有向成牙本质样细胞分化的趋势。同时观察到细胞间信号NOtCh在牙髓干细胞中有表达，为研究N。tCh信号对牙髓干细胞的增殖的影响奠定基础。 为了进一步研究NOtCh信号途径在牙髓干细胞分化过程中的作用，我们拟利用N。tch途径关键转录因子RBP－J条件性基因剔除小鼠，分析NmCh信号途径阻断后牙髓干细胞分化的变化。因此，我们构建了表达Cre基因的逆转录病毒载体，获得表达有Cre的病毒上清，并尝试着感染N。t。h－RBP－J条件敲除小鼠的牙髓干细胞，结果显示牙髓干细胞的N。tCh信号途径阻断后，细胞的增殖受到一定程度的抑制，提示N扯Ch信号途径可能参与了牙髓干细胞的分化。
徐娜[4]2013年在《Smurf1介导的对Runx2表达调控在牙髓干细胞向成牙本质细胞分化中的作用》文中研究表明Runx2是一种胚胎发育期在牙源性和骨源性间充质细胞中均有表达的转录因子。研究显示，发育期间其在成骨细胞和成牙本质细胞分化过程中表达趋势不尽相同，提示分化过程中Runx2特定的表达形式可能是决定细胞向成骨或成牙本质细胞分化的关键因子。泛素化修饰可通过控制Runx2蛋白的稳定性，调控Runx2的蛋白表达水平，Smurf1是蛋白泛素化降解调控通路中一种重要的E3泛素连接酶，其介导的泛素-蛋白酶体途径是调控Runx2表达的重要机制。那么Smurf1介导的Runx2泛素化蛋白降解途径是否在牙髓干细胞向成牙本质细胞分化过程中发挥着重要的作用呢？实验目的：本课题旨在比较Runx2在成牙本质细胞和成骨细胞分化过程中的表达水平和变化趋势，并利用shRNA慢病毒表达载体探讨牙髓干细胞内Smurf1对Runx2的表达调控作用，以及其在不同分化阶段对成牙本质细胞分化表型的影响，以揭示Smurf1介导的Runx2泛素化蛋白降解在牙髓干细胞向成牙本质细胞定向分化中发挥的调控作用。实验方法:1.人牙髓干细胞（HDPSCs）的分离、培养及鉴定通过酶消化法和有限稀释法分离纯化出HDPSCs克隆，并进行扩大培养。利用流式细胞技术鉴定其间充质干细胞表面标记物，同时诱导细胞多向分化并进行鉴定。2.检测并比较Runx2在干细胞向成牙本质和成骨细胞分化过程中的表达变化矿化液诱导培养人牙髓干细胞和骨髓间充质干细胞3周，鉴定成牙本质细胞和成骨细胞分化表型，Western blot和实时定量PCR动态检测矿化液诱导培养0d,3d,5d,7d,14d,21d成牙分化和成骨分化过程中Runx2的表达变化。3.探讨牙髓干细胞内Runx2表达受Smurf1介导的蛋白降解途径调控通过Smurf1shRNA慢病毒转染技术使牙髓干细胞内Smurf1基因沉默，然后用矿化诱导液诱导细胞分化，Western blot和实时定量PCR检测Runx2的表达，同时采用蛋白酶体抑制剂MG132和蛋白合成抑制剂cycloheximide分别处理未分化的HDPSCs和Smurf1基因沉默HDPSCs，Western blot检测Runx2的表达。4.研究Smurf1对成牙本质细胞分化表型的影响对Smurf1shRNA转染的牙髓干细胞进行矿化诱导培养7d和14d，茜素红染色检测矿化结节的形成，Western blot检测Runx2的表达，实时定量PCR检测成牙本质细胞相关表型的变化。结果：1.细胞鉴定结果证实，所培养细胞为牙髓干细胞（DPSCs），具有干细胞相关特性，并且在矿化液诱导下可分化为成牙本质细胞，经成脂诱导可分化为脂肪细胞。2. Runx2在人骨髓间充质干细胞向成骨细胞定向分化过程中表达逐渐增高，细胞分化越成熟，表达越强。但在牙髓干细胞向成牙本质细胞定向分化过程中，Runx2表达总体呈先高后低的趋势，细胞分化早期较未分化时表达增高，到分化晚期和分化成熟时表达则明显下降。3.在Smurf1shRNA转染的未分化HDPSCs内以及细胞经矿化诱导培养7天后，Runx2表达均明显增加，且这种表达变化仅体现在蛋白水平，Runx2mRNA水平的表达并无明显变化。蛋白酶体抑制剂MG132可使HDPSCs内Runx2蛋白水平明显增加，而Smurf1shRNA转染细胞经可阻断新蛋白的合成的蛋白合成抑制剂cycloheximide处理后，其内Runx2蛋白半衰期延长，降解速度明显减慢。4. Smurf1基因沉默可明显促进矿化结节的形成；其对早期矿化基因表达并无明显影响；而在矿化晚期，而细胞内成牙本质细胞分化相关基因DSPP、DMP-1的表达降低，成骨细胞分化相关基因OCN、BSP的表达则增强。细胞成牙分化减弱，成骨分化增强。同时，Smurf1基因沉默明显上调了成牙本质细胞分化晚期Runx2的蛋白表达。结论：Smurf1在牙髓干细胞向成牙本质细胞分化的过程中通过UPS介导了对Runx2的泛素化降解。同时Smurf1还在成牙本质细胞分化晚期发挥重要作用，而这种作用可能是通过其介导的对Runx2的蛋白酶体降解来实现的，这可能作为一种调控细胞定向分化的关键机制参与调控成牙本质细胞的分化。为了进一步深入研究牙髓干细胞定向分化机制，慢病毒过表达载体将被用于进一步验证实验结果，Runx2shRNA用于深入探讨Smurf1介导的Runx2泛素化蛋白降解在成牙本质细胞定向分化中的调控作用，后续研究将着重于裸鼠体内移植实验，以研究该调控作用在组织工程领域的应用。
关岳锋[5]2016年在《牙髓干细胞在鼠尾胶原和钛金属表面生物学特性比较研究》文中进行了进一步梳理研究目的:目前DPSCs生物学特征的研究多为干细胞的定向分化研究。因此,本实验主要研究目的为DPSCs在鼠尾胶原蛋白和钛金属上的细胞表型特点、细胞活性、矿化潜能、组织再生能力、多向分化潜能的体外生物学特性比较。实验方法:完整拔除牙根尚未发育完全的正畸牙或从未有牙体牙周疾病的第叁磨牙(16-28岁),用组织块发原代培养DPSCs,之后分组。分叁组,空白对照组,正常培养(10%FBS+α-MEM培养液);实验组A:加入鼠尾胶原蛋白和10%FBS+α-MEM培养液;实验组B:加入钛金属和10%FBS+α-MEM培养液。倒置显微镜下观察叁组DPSCs原代细胞和传代细胞的生长和传代特征。之后将叁组P2细胞接种于盖玻片上,用荧光免疫技术检测DPSCs表明标记物STRO-1的表达情况。再将对数生长的叁组细胞制成细胞悬液,接种至6孔板中,培养7D后,加入结晶紫染液染色,观察细胞克隆形成情况。采用MTT法分别连续10D测定叁组DPSCs的P3细胞的OD值,绘制叁组DPSCs的生长曲线。在取叁组P2细胞在成脂诱导液下进行培养,观察到脂滴形成后使用油红-O染色。对经矿化诱导4W后的叁组细胞进行西红素染色,并行半定量测定两组干细胞的钙含量以比较鼠尾胶原蛋白和钛金属对DPSCs矿化结节形成能力的影响。对矿化诱导4W后的叁组DPSCs采用免疫荧光技术检测成骨标志碱性磷酸盐(alkaline phosphatase,ALP)、骨涎磷蛋白(bone sialophosphoprotein,BSP)、牙本质涎蛋白(dentin sialoprotein,DSP)、骨钙素(osteocalcin,OC)的表达情况。应用荧光定量PCR仪7900分别检测叁组DPSCs矿化诱导3D,14D,21D的ALP、BSP、DSP、OC基因的m RNA表达水平,定量比较鼠尾胶原蛋白和钛金属对干细胞体外成骨/成牙骨质能力的影响。结果:连续培养7D后,倒置显微镜下叁组均可见有贴壁细胞以组织块为中心成放射状生长。叁组中的大部分细胞为成纤维细胞样生长,呈梭状,轮廓清晰,大小基本一致。对P0的叁组DPSCs爬片进行抗STRO-1免疫荧光检测,镜下叁组DPSCs细胞核均呈蓝色荧光,胞浆呈绿色荧光,是阳性表达。培养7D后进行结晶紫染液染色,镜下均可见有明显的细胞集形成,其中A组克隆形成率为8.5%,B组为5%。经统计学分析,A组形成率高于B组,差异具有统计学意义(p<0.05)。DPSCs的生长曲线呈“S”型,1-2D是潜伏期,3-8D为对数生长期,细胞加速生长,8D后进入平台期,细胞生长速度减缓,符合干细胞慢周期的特点,P4开始A组和B组相比较,差异存在统计学意义(p<0.05)。叁组DPSCs体外诱导成脂3W后进行油红-O染色均呈阳性,倒置显微镜下观察到有明显的红色脂滴形成。矿化诱导4W后,叁组细胞使用茜素红染色法检测,可见有橘红色矿化结节形成。茜素红半定量检测叁组细胞的钙含量,其中A组的钙含量为5.89±0.41,明显高于B组的3.83±0.27,差异具有统计学意义(p<0.05)。对矿化诱导4W后的DPSCs进行抗ALP、BSP、DSP、OC的免疫荧光检测,结果为阳性,其中A组荧光强度明显高于其他2组。荧光定量PCR结果显示随着诱导时间的增加,BSP、DSP和OC基因水平表达上升,而ALP基因水平表达则随诱导时间的增加而下降,且A组中的各基因的m RNA表达水平均高于其他2组,差异具有统计学意义(p<0.05)。结论:本实验成功地对人恒牙牙髓干细胞进行原代培养,并且在体外分别对鼠尾胶原蛋白和钛金属对恒牙牙髓干细胞的成骨性/牙源性的分化及相关成骨标志物的鉴定和比较,并证实了鼠尾胶原蛋白对DPSCs关于以上综述各指标的影响和促进作用。
麦麦提依明·哈力克[6]2016年在《肝素促进转化生长因子-β_3体外诱导兔牙髓干细胞成骨向分化能力的研究》文中进行了进一步梳理目的:应用酶解组织块儿法分离,培养兔牙髓干细胞的基础上探讨肝素对转化生长因子(transforming growth factor)-β_3在体外诱导兔牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs)成骨向分化的能力。方法:新西兰幼兔4只,采用酶解组织块法分离培养兔DPSCs,传代培养至第3代兔DPSCs,分别以含0,5u/mL,10u/m L,20u/mL肝素的培养基培养兔DPSCs,绘制生长曲线,筛选最适浓度的肝素后成骨诱导实验分为空白对照组、TGF-β_3组,肝素组和TGF-β_3+肝素组,空白对照组正常培养,TGF-β_3组在细胞培养基中加入20μg/L TGF-β_3,肝素组在培养基中加入5u/mL肝素,TGF-β_3+肝素组在细胞培养基中同时加入20μg/L TGF-β_3和5 u/mL肝素。各组采用碱性磷酸酶(alkailine phosphate,ALP)试剂盒检测兔DPSCs成骨向诱导后第7、14天细胞内ALP活性,细胞爬片采用免疫细胞化学法检测成骨细胞标记物RUNT相关转录因子2(runt related transcription factor 2,RUNX-2)和骨钙素(osteocalcin,OC)表达情况,采用茜素红染色观察矿化结节形成情况,对肝素组行免疫荧光定量PCR检测RUNX-2,BSP等成骨相关基因mRNA的相对表达量。结果:通过酶解组织块儿法获取的兔牙髓干细胞在诱导体系中生长良好。连续9天的培养后,肝素对兔DPSCs增殖表现为从10u/m L开始有明显的抑制作用,而5u/mL肝素组跟空白对照组没有差异,说明5u/m L肝素对兔DPSCs增殖没有抑制作用,即该浓度肝素对DPSCs没有损害性。TGF-β_3+肝素组第7,14天ALP活性[(27.20±1.01),(29.06±1.39)u/mg·pro]明显高于TGF-β_3组[(12.69±1.03),(9.44±1.05)u/mg·pro]和对照组[(5.96±3.68)、(6.10±3.66)u/mg·pro](P<0.01),TGF-β_3组明显高于对照组(P<0.001);TGF-β_3组,肝素组和TGF-β_3+肝素组成骨诱导第7天RUNX-2开始出现阳性表达,第14天TGF-β_3组,TGF-β_3+肝素组OC有阳性表达,对照组和肝素组为阴性;第21天茜素红染色对照组和肝素组为阴性,TGF-β_3组为阳性,TGF-β_3+肝素组为强阳性,PCR结果显示较对照组肝素组有RUNX-2 mRNA表达量上升,而BSP mRNA表达量没有上升。结论肝素有促进TGF-β_3体外诱导兔DPSCs成骨向分化的能力。
马蓉[7]2013年在《兔牙髓细胞体外增殖及鉴定的实验研究》文中研究说明目的：体外分离培养兔牙髓细胞，研究兔牙髓细胞体外增殖特性及表面标志物的鉴定。方法：酶解组织块法培养兔牙髓原代细胞，有限稀释化克隆培养兔传代细胞，显微镜下观察原代细胞及传代细胞形态变化。取第3-6代细胞进行细胞活率的检测。取2代细胞进行细胞克隆计数。取第2、4、6、8、10代细胞绘制生长曲线。流式细胞仪对第2、4、6、8、10代细胞进行细胞周期的检测。取第2代细胞进行牙髓干细胞表面标志物vimentin、CD44、osteonectin、DSP的鉴定。结果：采用酶解组织块法培养的兔原代牙髓细胞、有限稀释化克隆培养的兔牙髓细胞形态学无明显差异。从第3代到第6代细胞活率细胞数比分别为：94.7%、95.8%、95.2%、95.3%。兔牙髓细胞克隆形成率为8-26个/2000个细胞。不同代细胞之间增殖率有差异，LSD-t检验示第2、4和6代DPCs间无统计学差异，第8代和10代DPCs与其他各代细胞之间的差异均有统计学意义。随着细胞传代，s期细胞比例增加。LSD-t检验示第2、4和6代DPCs的各期细胞比例无统计学差异(P＞0.05)，第8和10代DPCs与其他各代细胞之间均有统计学差异(P＜0.05)。牙髓干细胞表面标志物vimentin、CD44、osteonectin、DSP均为阳性。结论：体外分离培养的兔牙髓细胞具有较强的增殖活性、免疫细胞化学vimentin、CD44、osteonectin、DSP均为阳性表达，证实兔牙髓细胞可分离培养出牙髓干细胞，为牙组织工程提供了新型种子细胞。
王娟[8]2015年在《NF-κB抑制剂PDTC对人牙髓干细胞定向分化影响及其分子机制的研究》文中指出龋病是被WHO列为当代危害人类健康非传染性疾病之一。牙龋坏后,牙本质小管内细菌可导致牙髓组织感染或者发炎。此时牙髓组织中的可分化为成牙本质细胞,成骨细胞,神经细胞的多能干细胞--牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs)迁移分化成为有功能的成牙本质样细胞(odontoblast-like cells,OBLCs),保护牙髓。研究表明,NF-κB信号通路在调节干细胞分化方面有重要作用,如炎症因子TNF、IL-17作用于骨髓间充质干细胞激活IKK-NF-κB信号通路促进降解β-catenin,进而促进骨髓间充质干细胞成骨分化[1];在牙髓干细胞分化方面,我们前期研究证明炎症微环境下通过TLR4/My D88/NF-кB信号通路促进炎症因子表达,PDTC作为NF-κB通路抑制剂,能够抑制NF-κB参与炎症环境下对干细胞分化的调控作用,减轻炎症反应[2]。吡咯烷二硫基甲酸(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)是一种稳定的化合物,氨基甲酸盐的一种,并且被广泛用作NF-κB通路的抑制剂,文献报道,PDTC在干细胞分化中发挥重要作用,如体外大鼠骨髓间充质干细胞在LPS刺激下,激活NF-κB信号通路,RT-PCR检测得出炎症环境下即LPS处理后的骨髓间充质干细胞抗炎因子IL-10和TGF-β3表达升高,当PDTC作用于大鼠间充质干细胞后,抗炎因子的表达受到抑制,表明PDTC参与炎症环境下细胞的免疫调节[3];PDTC阻断NF-κB通路后下调Smad信号通路可以促进系统性红斑狼疮患者的骨髓间充质干细胞的成骨分化[4];而在脂肪间充质干细胞中,PDTC抑制NF-κB通路促进TAZ的表达来抑制脂肪间充质干细胞的成骨向分化[5]。那么PDTC对炎症状态下牙髓干细胞分化是否有积极影响以及作用机制还不清楚。本研究通过体内、体外实验研究NF-κB抑制剂PDTC对牙髓干细胞成牙/成骨分化能力的影响,以探讨PDTC在牙髓干细胞分化中的作用,对牙髓损伤修复时h DPSCs定向分化机制有重要意义。主要的研究结果如下:1.h DPSCs分离、培养和鉴定我们使用组织块酶消化方法,成功分离培养人牙髓原代细胞,然后应用有限稀释法,分离培养牙髓干细胞,取叁代细胞运用流式细胞仪进行细胞表面抗原检测和鉴定,并且体外分别矿化诱导2周、成脂诱导3周对细胞多向分化能力进行检测,实验结果表明我们分离并培养的牙髓干细胞符合间充质干细胞相应的分子生物学特点,证明成功建立了h DPSCs细胞系。2.PDTC对h DPSCs增殖能力的影响配制不同浓度PDTC刺激液,通过MTT实验检测不同浓度PDTC刺激液(2-200μmol/L)对h DPSCs增殖能力的影响。结果表明,200μmol/L PDTC可明显抑制该细胞的增殖能力,对h DPSCs有毒性作用,而其余2μmol/L、20μmol/L两组浓度PDTC刺激液与对照组相比,抑制h DPSCs增殖能力,但组间无明显的差异。3.PDTC对体外二维、叁维环境培养h DPSCs定向分化的影响首先二维培养环境下用2μmol/L、20μmol/L PDTC刺激液分别矿化诱导h DPSCs2周,通过茜素红染色及定量实验表明,与对照组相比20μmol/L PDTC组矿化结节表达明显高于对照组,以上证明20μmol/L PDTC能有效地促进h DPSCs的成牙/成骨分化。其次体外将h DPSCs接种于多孔纳米纤维结构明胶复合支架,为h DPSCs提供叁维生长环境,然后配制浓度为2μmol/L、20μmol/L PDTC刺激液,对照组为10%FBS培养液,通过MTT测定刺激组和对照组1、3、5、7天490 nm吸光度值,结果表明,2μmol/L、20μmol/L PDTC抑制细胞增殖能力;再次,配制2μmol/L、20μmol/L PDTC刺激液,矿化诱导2周,通过茜素红染色及定量结果与矿化组比较表明20μmol/L PDTC刺激组促进h DPSCs成骨分化,结果证明PDTC促进体外叁维培养环境下h DPSCs成牙/成骨分化。4.体内裸鼠实验观察PDTC对h DPSCs定向分化的影响本实验通过将预先用20μmol/L PDTC矿化诱导的h DPSCs接种于纳米明胶支架材料,并观察6周后取材,HE染色、Masson染色、Von Kossa染色、X线平片结果及Micro-CT叁维重建及数据分析来观察PDTC对h DPSCs成牙/成骨向分化的影响,结果表明,20μmol/L PDTC促进h DPSCs成牙/成骨向分化。5.研究PDTC对h DPSCs定向分化影响机制通过茜素红染色及定量实验和Western blot技术,初步探讨PDTC调控h DPSCs定向分化机制。结果证明PDTC刺激组和对照组比较p-p65蛋白表达降低,表明NF-κB通路参与h DPSCs成牙/成骨分化调节;ERK通路抑制剂(U0126)明显抑制PDTC诱导h DPSCs矿化结节的形成,MAPK(JNK、p38)抑制剂(SP600125、SB203580)抑制相应通路后,PDTC对h DPSCs成牙/成骨分化作用不受影响,即JNK、p38通路不参与PDTC对h DPSCs成牙/成骨分化。综上所述,本研究通过体外、体内实验证明一定浓度PDTC能够抑制h DPSCs增殖,促进h DPSCs的成牙/成骨向分化,并且进一步研究发现NF-κB负向调节PDTC刺激下h DPSCs成牙/成骨分化,ERK通路正向调节该过程,为进一步阐明h DPSCs定向分化机制奠定坚实理论基础。
王亦菁[9]2005年在《牙髓干细胞与外胚间充质干细胞表型和分化能力的比较研究》文中进行了进一步梳理原始干细胞亚群在胚胎发育成熟后逐渐丢失部分分化潜能,储存在某些组织器官形成成体干细胞(ASC)。在口腔颌面部发育中,颅神经嵴干细胞(CNCSC)迁移形成胚胎面突外胚间充质干细胞(EMSC),参与口腔颌面大部分组织结构的发育,机体发育成熟后,EMSC是否仍存在于口腔颌面部组织器官的相应部位并继续发挥干细胞的作用,其细胞表型和生物学行为是否有所变化尚不可知。胚胎期的牙髓组织由外胚间充质衍生而来,成体牙髓组织中存在有牙髓干细胞(DPSC),其与EMSC是否存在有延续性,二者的细胞表型及生物学行为有何异同也无明确认识。DPSC、EMSC来源于间充质,而骨髓间充质干细胞(BMSC)是目前研究较为深入的间充质干细胞(MSC),本研究以BMSC为参照,针对DPSC和EMSC的生长增殖特性,细胞表型,体内外分化能力和参与牙髓组织损伤修复能力等生物学行为进行了研究分析,主要研究结果如下: 1 DPSC、EMSC的分离培养及生长增殖特性的观察 利用酶解消化及克隆筛选成功建立了大鼠DPSC体外的培养方法。以BMSC为参照,对DPSC、EMSC的形态学特征和生长增殖活性进行观察分析,表明DPSC、EMSC的细胞学形态与BMSC相似,具有间充质来源的干细胞形态,DPSC的形态均一,呈典型的短梭性,而EMSC的形态多样,形成的克隆集落中含有多种形态差异显着的细胞,表明
孙海花[10]2015年在《牙周炎症状态对患牙牙髓中牙髓干细胞生物学行为的影响》文中认为研究背景牙组织工程,特别是牙髓再生研究是口腔再生医学的重要分支,牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs)作为牙组织工程的种子细胞之一,也是迄今为止在牙髓再生研究中得到最多应用的种子细胞。DPSCs存在于乳牙及恒牙牙髓组织中,以往研究表明,DPSCs可以简单高效的由医疗废弃物(如正畸需要拔除的牙齿、阻生智齿等)中获得,具有良好的增殖和多向分化能力,可诱导形成骨、软骨、肌肉、神经以及牙髓/牙本质复合体等多种组织。目前不可逆性牙髓炎的常规治疗方案是去髓术结合根管治疗,以达到消除感染、保留患牙的目的;另一方面,由于牙周疾病引起的逆行性牙髓炎等牙周牙髓联合病变,也需要通过上述治疗手段保留患牙。近来不少研究证实,由炎性牙髓组织中也可分离培养出DPSCs,即炎性DPSCs(inflamed DPSCs,i DPSCs),此类DPSCs保留着与健康组织来源细胞相似的分化特性及组织再生潜能。此后,相继由感染根尖组织、炎性牙周组织中分离出了具有多能性的间充质细胞,上述炎性来源细胞均保留了较为良好的多向分化及组织再生潜能,这提示了分离自炎性牙齿组织的干细胞可能是未来干细胞治疗一个重要的细胞资源。然而,炎性环境对干细胞生物学特性的干预以及间充质干细胞对炎症反应的调节是多分子参与的复杂过程,对其信号通路的阐明则需要进一步深入研究。虽然由炎性牙髓组织中分离所得的牙髓干细胞经证实仍然保留着部分多向分化及组织再生潜能,但是在诸如由牙周炎症引发牙髓炎症的牙周牙髓联合病变患牙牙髓组织中是否仍然存在具有活力的牙髓干细胞,这些细胞的分化、再生潜能与由正常牙髓组织中获得的DPSCs是否存在差异,目前未却见相关研究报道。本课题将就以上问题进行集中深入研究。材料与方法本研究由因侵袭性牙周炎而必须拔除的患牙牙髓组织中分离培养炎性牙髓干细胞i DPSCs,根据患牙牙槽骨吸收程度将所分离的i DPSCs分为3个实验组(A组:牙槽骨吸收接近根尖;B组:牙槽骨吸收到达根尖但未完全波及;C组:牙槽骨吸收波及整个根尖周),以来源于同一患者因阻生或无咀嚼功能拔除的健康智齿的DPSCs作为对照。观察比较上述各组细胞克隆形成能力、增殖活力、细胞周期、细胞表面特异性标记物、细胞多向分化(成骨/成牙、成脂)能力及相关基因表达水平,并结合生物材料及离体牙根管段,异位观察各组细胞体内特征性组织新生能力。通过以上研究,综合评估牙周炎症对牙髓干细胞的影响。结果研究发现,可由前述牙槽骨不同吸收程度的患牙中分离获得阳性表达STRO-1及CD146的i DPSCs;尽管相较对照组DPSCs,各组i DPSCs(A、B及C组)的克隆形成能力及增殖活力都有显着降低,但降低的幅度与牙周炎症严重程度无明显相关性;并非所有组别的i DPSCs体外多向分化的潜能都降低;A组(牙槽骨吸收接近根尖患牙来源)i DPSCs、对照组DPSCs与生物材料复合后,移植于裸鼠皮下12周后生成了牙本质样结构;而将各组细胞/支架复合物充填于离体牙根管片段内移植于裸鼠皮下,均可观察到牙本质/牙髓样复合体样组织的生成,但相较于对照组DPSCs,i DPSCs成牙能力显着受到抑制,不过各组i DPSCs生成牙原性组织的能力与患牙牙周炎症严重程度并无相关性。结论综上所述,牙周炎症累及的患牙只要牙髓组织尚未完全坏死,就可以分离出具有MSCs(间充质干细胞)性质的i DPSCs,此类i DPSCs仍然具有一定的增殖、分化和组织再生潜能,但是这种牙周炎症来源的i DPSCs能否作为自源性干细胞进行临床再生治疗,还需基于大样本及多种类型牙周炎临床病例的研究。
参考文献：
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[4]. Smurf1介导的对Runx2表达调控在牙髓干细胞向成牙本质细胞分化中的作用[D]. 徐娜. 第四军医大学. 2013
[5]. 牙髓干细胞在鼠尾胶原和钛金属表面生物学特性比较研究[D]. 关岳锋. 吉林大学. 2016
[6]. 肝素促进转化生长因子-β_3体外诱导兔牙髓干细胞成骨向分化能力的研究[D]. 麦麦提依明·哈力克. 新疆医科大学. 2016
[7]. 兔牙髓细胞体外增殖及鉴定的实验研究[D]. 马蓉. 新疆医科大学. 2013
[8]. NF-κB抑制剂PDTC对人牙髓干细胞定向分化影响及其分子机制的研究[D]. 王娟. 第四军医大学. 2015
[9]. 牙髓干细胞与外胚间充质干细胞表型和分化能力的比较研究[D]. 王亦菁. 第四军医大学. 2005
[10]. 牙周炎症状态对患牙牙髓中牙髓干细胞生物学行为的影响[D]. 孙海花. 第四军医大学. 2015