胡旭光[1]2002年在《溃结灵治疗实验性溃疡性结肠炎的药理作用及其机理研究》文中进行了进一步梳理背景和目的 溃疡性结肠炎(ulcerative colitis)，简称(U.C)，是炎症性肠病的一种。U.C在欧、美等国家发病率高，在我国其发病率有逐年增加的趋势，近年来已成为我国常见的消化道疾病。对于U.C的治疗，轻症多首选柳氮磺胺吡啶类(SASP)制剂，重症选用皮质类固醇和免疫抑制剂，这些药物具有起效快，临床症状缓解率高的特点，但患者长期用药后对药物的依赖性强，毒副作用多且严重，停药后易复发。中医药对U.C的研究结果表明：中药，特别是中药复方在临床上能达到较好的治疗效果，具有疗效确切、副作用小的特点；但中医药研究也存在不足之处：中医药研究多侧重于临床，而实验研究则相对比较少，存在着临床与实验研究相脱节的问题。 清热利湿方药溃结灵由防风、地榆、水蛭等六种中药组成，本方系广东省名中医劳绍贤教授的经验方，具有清热解毒利湿、凉血活血的作用，经长期临床实践对溃疡性结肠炎有显着疗效。为了探讨该方治疗U.C的药理作用及其机理，本研究选用与临床溃疡性结肠炎病理特点相似的实验性溃疡性结肠炎动物模型，观察药物的作用，并从炎症因子(IL-6和TNF-α)、抗炎镇痛、止泻及胃肠运动等方面探讨其疗效机理，为中医药治疗U.C提供药理学依据。 方法 ①用免疫致敏法(兔结肠作为抗原加弗氏佐剂)、化学致敏法(二硝基氯苯)和乙酸化学刺激法，建立叁种溃疡性结肠炎动物模型，分别观察溃结灵高、中、低叁个剂量及阳性对照药柳氮磺胺吡啶的实验治疗作用。②治疗后对各组动物进行病理学观察(光学显微镜)；采用放射免疫法，测定前二种动物模型血清中IL-6和TNF-α含量；③抗炎作用实验采用慢性大鼠肉芽肿模型和急性大鼠足肿胀模型；镇痛作用实验分别采用小鼠热板法和小鼠醋酸扭体法动物模型。④止泻实验采用番泻叶及蓖麻油小鼠腹泻模型；胃肠运动实验采用在体小鼠小肠推进实验和离体肠管运动实验。 结果 ①溃疡性结肠炎模型组动物出现脓血便、活动减少，溃结灵高、中剂量及阳性药柳氮磺胺吡啶治疗组动物外观体征较非治疗组改善明显；②叁种造模动物的结肠都出现程度不同的溃疡、糜烂、淋巴细胞浸润，其中溃结灵高、中剂量组及阳性药治疗组动物结肠溃疡数、糜烂点数较非治疗组明显减少叩N．05和P＜0．01）；前两种动物模型血清中TNF－a含量较非治疗组明显下降（P＜0．01），虽然 IL－6含量有所下降，但与非治疗组比较差异无显着性（P＞0．05）。＠溃结灵可明显减轻肉芽肿的重量；也可以降低大鼠足肿胀度。④溃结灵可分别减少给药后小鼠扭体次数和不同时间小鼠的痛阈值，以高、中剂为明显。⑤溃结灵可明显减少两种小鼠腹泻模型的腹泻次数。③溃结灵具有明显延缓小鼠小肠推进的作用，。对乙酚胆碱和氯化钡引起兔回肠强直性收缩有一定的桔抗作用。 结论 溃结灵对兔疫法、化学致敏法、乙酸浸润法叁种实验性溃疡性结肠炎动物模型有明显的治疗作用，能明显改善U．C动物模型的外观体症，明显减轻结肠溃疡及炎性病变、降低血清中TNF－口和IL－6的含量和一定的抗炎镇痛、止泻等作用。其作用机理之一可能与抑制某些炎症因子有关。
宋宁[2]2008年在《溃结灵对溃疡性结肠炎大鼠结肠粘膜ITF表达及MEK/ERK通路的影响》文中进行了进一步梳理溃疡性结肠炎(UC)是一种主要累及直肠、结肠粘膜的慢性非特异性炎症,临床上至今没有特异性的根治措施,治疗多以抗炎、调节免疫为主。近年研究发现,肠道受到一系列损伤发生溃疡后,机体的修复机制开始启动来促进其快速愈合,其过程有许多生长因子参与。肠叁叶因子(ITF)是一种由杯状细胞分泌的特异分布于肠道的新型细胞生长因子,具有很强的细胞保护作用,可明显减轻多种损伤因子介导的肠粘膜损害,它不仅具有一般生长因子所具有的促进细胞增殖与移行能力,还具有独特的生理功能并可同粘液糖蛋白结合,稳定肠粘液层。因此,ITF被认为是肠道的特异保护因子。中医药在UC的治疗上有着明显的优势,开展中药对ITF调节作用的深入研究,有望为UC的治疗提供新的契机。脾胃研究所在多年临床经验的基础上,以清热健脾活血为治则,总结出治疗UC的溃结灵复方(KD),临床取得了较好的疗效。前期研究采用叁硝基苯磺酸法(TNBS)制作UC大鼠模型,发现KD能明显减少UC大鼠结肠溃疡个数和面积,改善结肠粘膜炎症和水肿等病理变化,同时又能降低模型大鼠血清中促炎因子IL-1β、TNF-α的含量和结肠组织中NF-κBp65蛋白的阳性细胞率,对模型大鼠结肠粘膜TLR2、TLR4基因表达也有抑制作用。本研究拟从促粘膜修复入手,观察KD对ITF的表达及其信号转导通路的关键蛋白MEK、ERK磷酸化的影响,探讨KD治疗UC的深层次作用机理。这一研究将使中医药治疗UC的机理研究深入到基因调控水平,并为开发高质量的抗UC中药新药打下坚实的基础,有着重要的理论意义和广阔的应用前景。1 KD对UC大鼠结肠粘膜超微结构的影响研究发现UC病变主要限于结肠粘膜和粘膜下层,且以溃疡和炎症变化为主。髓过氧化物酶(MPO)是中性粒细胞中含量较高的一种酶,与炎症变化密切相关。本实验在我们前期病理形态学研究的基础上,进一步观察了KD对UC大鼠结肠粘膜的超微结构影响及MPO含量的改变,以期对其作用机制进行初步的探讨。大鼠随机分为4N:正常组、模型对照组、KD组和阳性药SASP组。治疗十天后处死大鼠并采集结肠组织标本。透射电镜观察,发现UC模型组大鼠结肠粘膜上皮表面的微绒毛脱落,变短,扭曲,细胞器减少,细胞质液化溶解,腺上皮细胞间连接松散,提示炎症及溃疡引起了上皮细胞及细胞连接的损伤。杯状细胞分泌增强,有的细胞内颗粒呈排空状态,可能是在受到炎性介质刺激下,肠道杯状细胞分泌量代偿性增加(包括粘蛋白、叁叶因子等),从而启动肠粘膜自身保护机制。经溃结灵治疗后,大鼠结肠粘膜上皮表面的微绒毛基本完整,腺上皮间相互连接紧密,胞浆内粘液颗粒较丰富,并向腺腔排出,表明溃结灵能够减轻结肠粘膜超微结构损伤,促进杯状细胞分泌保护因子,进而加快肠道粘膜重建和溃疡修复过程。MPO检测结果显示,模型组大鼠结肠粘膜MPO活性为0.3516±0.0738U/g,明显高于正常组0.1982±0.0719 U/g(P＜0.01);与模型组比较,溃结灵组和SASP组结肠MPO活性显着降低(分别为0.2876±0.0554 U/g,P＜0.05;0.2507±0.0303 U/g,P＜0.01),提示溃结灵能减轻TNBS大鼠的炎症程度,减少溃疡发生。2 KD对UC大鼠结肠粘膜ITF基因和蛋白表达的影响ITF被看作是粘膜损伤的快速反应肽,在胃肠道有两个重要功能,即上皮保护和促进粘膜愈合,与肠道炎症性疾病的发生和发展有着密切的关系。本研究观察KD对TNBS法大鼠模型结肠粘膜ITF基因及蛋白表达的作用,深入探讨其作用机制。大鼠随机分组同前,治疗十天后处死大鼠并快速采集结肠标本。选择结肠病变相同部位剪取小块组织,固定包埋切片,免疫组织化学染色,光镜下观察ITF蛋白表达情况,并进行半定量统计分析。余下粘膜用Trizol提取总RNA,RT-PCR法检测ITFmRNA的表达,以GAPDH作为内参,产物进行凝胶电泳分离,用凝胶成像仪自带分析软件进行灰度分析,以ITF与GAPDH的灰度值比值作为ITFmRNA的相对表达量,进行组间比较分析。结果显示,模型组结肠粘膜中ITFmRNA相对表达量为1.027±0.1263,略高于正常组(1.004±0.1046;P＞0.05);模型组结肠组织ITF蛋白表达与正常组比较无显着差异(P＞0.05)。溃结灵组和SASP组结肠粘膜中ITFmRNA相对表达分别为1.268±0.2113和1.299±0.3117,明显高于模型组(P＜0.05);溃结灵组和SASP组结肠组织中ITF蛋白表达也明显高于模型组(P＜0.01),提示KD对TNBS法UC大鼠模型结肠粘膜ITF基因及蛋白表达有明显上调作用,这可能是溃结灵治疗作用的一个关键靶位。3 KD对UC大鼠结肠粘膜MUC2基因表达的影响粘蛋白2(MUC2)也是杯状细胞合成的分泌型蛋白,是维持粘液层厚度及胶体形态的主要成分,在粘膜保护及肠道疾病修复机制中占有重要的地位。本研究观察了KD对TNBS法UC大鼠模型结肠粘膜MUC2mRNA表达的影响,并探讨其中的作用机理。分组和治疗同前述,治疗结束后,刮取结肠粘膜标本并提取总RNA,采用RT-PCR法检测MUC2mRNA的表达,以GAPDH作为内参,产物进行凝胶电泳分离,用凝胶成像仪自带分析软件进行灰度分析,以MUC2与GAPDH的灰度值比值作为MUC2mRNA的相对表达量,进行组间比较分析。结果显示,UC模型组大鼠结肠粘膜MUC2mRNA的相对表达与正常组比较,略有增高,但没有显着差异(分别为0.6423±0.1668和0.5924±0.1758,P＞0.05)。与模型组比较,溃结灵和SASP对UC大鼠结肠粘膜MUC2基因的表达都有明显的上调作用(分别为0.9811±0.1828和1.0491±0.2675,P＜0.01)。提示,KD能上调MUC2基因表达,从而加强肠道粘膜屏障的保护功能,促进受损区域上皮细胞重建,这可能是溃结灵治疗UC的作用机理之一。4 KD对UC大鼠结肠粘膜pERK1/2、pMEK1/2蛋白水平的影响Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2等MAPK信号转导通路是广泛存在于真核细胞内的一条重要信号转导通路,参与调节细胞的分化、增生、凋亡等过程。有研究发现生长因子等有丝分裂刺激因素是激活ERK途径的主要细胞外信号,被激活的ERK可诱导细胞产生增殖、分化等核反应。KD对TNBS法UC大鼠模型结肠粘膜ITF基因及蛋白的表达有明显的上调作用,在此基础上本研究对UC大鼠模型结肠粘膜ERK1/2、MEK1/2磷酸化水平进行检测,以期对KD治疗UC的较深层次的作用机理进行探讨。分组和治疗同前,治疗结束后采集结肠粘膜标本并提取全细胞蛋白,运用蛋白免疫印迹(Western blot)方法对pERK1/2、pMEK1/2的蛋白表达水平进行检测,以β-action作为内参,以目的蛋白与β-action的密度比值作为目的蛋白的相对含量,进行组间比较分析。结果显示,模型组大鼠结肠粘膜中pERK1/2、pMEK1/2蛋白相对表达量分别为0.3974±0.1017和0.6994±0.1372,均高于正常组(分别为0.2037±0.1234和0.4092±0.1177,P＞0.05,P＜0.01)。与模型对照组比较,KD组pERK1/2、pMEK1/2蛋白相对表达量明显增高,分别为0.7060±0.1607和0.8928±0.1801(P＜0.01,P＜0.05)。阳性药SASP组pERK1/2、pMEK1/2蛋白相对表达量为0.7299±0.2710和0.9053±0.1591,也显着高于模型组(P＜0.01,P＜0.05)。提示KD对TNBS法UC大鼠模型结肠粘膜pERK1/2、pMEK1/2蛋白表达有显着上调作用,这可能是其治疗UC的作用环节之一。5结论ITF具有很好的胃肠粘膜保护作用,在炎症性肠病时上调表达,可促进损伤粘膜的修复。其作用机制涉及ITF与粘糖蛋白相互作用,增强粘液凝胶层对粘膜表面有害物质的抵抗,以及促进细胞迁移增殖等。对ITF的深入研究,特别是对其在炎性肠病粘膜修复中作用的研究,颇具应用价值。本研究选用清热健脾活血中药复方KD治疗大鼠实验性UC,取得了较好的疗效,结果表明,①KD能明显降低UC模型大鼠结肠中MPO的活性,改善结肠粘膜的超微结构;②显着上调UC模型大鼠结肠粘膜中MUC2基因、ITF基因及蛋白的表达水平;③明显提高UC模型大鼠结肠粘膜中ERK1/2和MEK1/2磷酸化水平。综合研究结果分析,KD治疗UC的作用机制,一方面可能是通过上调ITF和MUC2的表达,加强二者相互作用,促进了粘液凝胶层的形成,进而增强肠道粘膜防御屏障的保护能力;另一方面,也可能是通过上调ITF表达从而激活ERK信号转导通路,刺激UC大鼠肠道上皮细胞移行增殖,加速损伤修复的。进一步,我们还需对ITF及MAPK信号传导通路在肠损伤中的作用作更为深入和全面的动态研究,明确其作用的分子机制及具体的靶基因和蛋白,以便为临床UC治疗提供新的思路与方法。
顾培青[3]2007年在《溃结灵（口服）合解毒生肌汤（灌肠）治疗溃疡性结肠炎的临床研究》文中认为目的:观察溃结灵(口服)合解毒生肌汤(灌肠)治疗肝郁脾虚型溃疡性结肠炎的临床疗效,并初步探讨其作用机理。方法:临床选择符合纳入标准的肝郁脾虚型溃疡性结肠炎患者43例,随机分为两组,治疗组(22例)给予溃结灵口服、解毒生肌汤灌肠,对照组(21例)给予柳氮磺胺吡啶,观察两组的临床疗效。结果:临床研究显示,治疗组临床综合疗效、中医证候疗效、肠镜疗效及粘膜病理疗效均优于对照组(P<0.05或P<0.01)。治疗组能明显改善脓血便、腹泻、腹痛、里急后重等症状,其疗效优于对照组(P<0.01)。两组治疗期间均未发生不良反应。结论:溃结灵(口服)合解毒生肌汤(灌肠)是治疗肝郁脾虚型溃疡性结肠炎的有效方剂,能够消除或改善临床症状,促使肠道黏膜病变恢复,迅速缓解患者的痛苦。
王凤[4]2016年在《溃结灵对UC大鼠Treg细胞分化相关因子的作用》文中研究表明目的：调节性T细胞(Regulatory T cells,Treg)是一类功能独特的CD4+细胞亚群,其最主要的功能就是在包括炎症性肠病(Inflammatory bowel disease, IBD)的自身免疫性疾病中发挥免疫抑制作用。Treg细胞可有效抑制有害病原过度刺激T细胞反应,控制炎症反应,在实验性结肠炎中发挥有效的抗炎作用,与溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)的病情关系密切。研究表明,Treg细胞和辅助性T细胞17(Helper T cell,Th17)的平衡在慢性炎症和自身免疫性疾病的发病中可能起着关键性的作用,二者在分化途径和功能作用上相互拮抗,正常情况下维持机体内的免疫平衡。二者之一的任何异常改变,如Th17细胞数量上升,或者Treg细胞数量下降都能打破这种平衡,造成一系列急慢性炎症反应。前期研究表明,溃结灵(KD)能有效抑制叁硝基苯磺酸(TNBS)诱导的大鼠溃疡性结肠炎模型,能提高外周血CD4+Foxp3+Treg细胞比例和降低CD4+IL-17A+Th17细胞比例,并通过下调白细胞介素6(Interleukin-6,IL-6)、 IL-21、IL-17、孤独核受体t(orphan nuclear receptor gamma t,RORγt)、信号转导与转录活化因子3(signal transducers and activators of transcription 3,STAT3)等的表达,抑制Th17细胞的分化和功能,调节二者平衡,维持机体稳态。因此,本研究进一步探索与Treg细胞分化和功能相关的因子,如IL-2、IL-10、IL-6、转化生长因子β1 (Transforming growth factor-β1,TGF-β1)、叉头样转录因子p3(Forkhead box transcription factor, Foxp3)、STAT5,深入揭示溃结灵治疗UC的作用机理及靶点。内容：1.溃结灵对溃疡性结肠炎大鼠血浆IL-2、IL-10和结肠黏膜TGF-β1、IL-6、 IL-2、IL-10含量的影响Treg细胞的生成主要受TGF-β1、IL-2、IL-10等的影响。高浓度的TGF-β1诱导Treg细胞分化,而IL-6存在时,和TGF-β1共同促进T淋巴细胞分化为Th17细胞。IL-2信号通路对胸腺内Treg的发育,对外周Treg的维持与扩增,和对Treg的免疫抑制功能有促进作用。Treg细胞可通过分泌IL-10发挥免疫抑制作用。本实验观察溃结灵对UC大鼠血浆IL-2、IL-10和结肠黏膜TGF-β1、IL-6、IL-2、IL-10含量的影响,初步探讨其相关作用机制。方法：取SD雄性大鼠,除正常大鼠外,其余采用叁硝基苯磺酸(TNBS)法复制UC模型,随机分为模型组、溃结灵高剂量组、溃结灵中剂量组、溃结灵低剂量组和柳氮磺胺吡啶(SASP)组,给药组按相应药物、剂量干预,正常组和模型组给水。结束后采集血浆和结肠黏膜样本,使用ELISA试剂盒按说明书进行操作,检测血浆中IL-2、IL-10和结肠黏膜中TGF-β1、IL-6、IL-2、IL-10的含量。结果：UC模型组大鼠血浆中,IL-2的含量明显低于正常组(P<0.01),溃结灵高剂量组和SASP组血浆中IL-2的含量明显高于模型组(P<0.05或P<0.01)；IL-10的含量明显低于正常组(P<0.05),溃结灵高、低剂量组血浆中IL-10的含量明显高于模型组(P<0.05)；UC模型组结肠黏膜中,IL-2的含量明显低于正常组(P<0.05),溃结灵高剂量组和SASP组结肠黏膜中IL-2的含量明显高于模型组(P<O.05)；模型组结肠黏膜中IL-10的含量明显低于正常组(P<0.01),溃结灵高、中、低剂量组和SASP组结肠黏膜中IL-10的含量明显高于模型组(P<0.05或P<0.01)；模型组结肠黏膜中IL-6的含量明显高于正常组(P<0.05),溃结灵高剂量组和SASP组结肠黏膜中IL-6的含量明显低于模型组(P<0.05)；模型组结肠黏膜中TGF-β1的含量明显低于正常组(P<0.05),溃结灵高、中、低剂量组和SASP组结肠黏膜中TGF-β1的含量明显高于模型组(P<0.05)。2.溃结灵对UC大鼠结肠黏膜STAT5、IL-2 mRNA表达的影响IL-2对免疫耐受的建立和维持起关键性作用,它能促进Treg细胞的产生和维持Treg细胞的功能。STAT5是核转录因子,同时作为IL-2信号通路的下游信号,可被IL-2激活,从而调节Treg细胞的增殖、分化等。本实验用荧光定量PCR法观察溃结灵对UC大鼠结肠黏膜中IL-2、STAT5 mRNA的影响。方法：动物造模、分组、给药同实验一。结肠黏膜匀浆后,加入RNAios、氯仿、异丙醇等提取总RNA,逆转录为cDNA,逆转录反应条件以20ul反应体系进行,37℃15min,85℃ 5s,4℃终止。RT-PCR设置GAPDH为内参基因,反应条件：95℃30 sec,然后按95℃ 5 sec,60℃ 30 sec的条件,40个循环。结果：模型组大鼠结肠黏膜中STAT5和IL-2 mRNA表达低于正常组(P<0.05),溃结灵高剂量组和SASP组STAT5和IL-2 mRNA表达明显高于模型组(P<0.05或P<0.01)。3.溃结灵对UC大鼠结肠黏膜Foxp3、STAT5原位蛋白表达的影响CD4+CD25+Treg细胞的特异性转录因子为Foxp3,Treg细胞生长、发育、成熟和功能都受到Foxp3的影响,故Foxp3是Treg细胞的主要调节因子。STAT5在基因水平上与Foxp3具有结合位点,STAT5能直接结合到FOXP3基因的保守性区域,从而促进Foxp3的表达,调节Treg细胞的功能。因此,STAT5与Foxp3的表达有密切联系。本实验采用免疫组化法观察UC大鼠结肠黏膜Foxp3、STAT5蛋白的表达。方法：动物造模、分组、给药同实验一。采用中性福尔马林液固定结肠黏膜组织,制作病理切片,进行免疫组化染色,观察Foxp3、STAT5蛋白的阳性表达区域,以平均光密度值作为半定量标准。结果：模型组结肠黏膜组织中Foxp3、STAT5的蛋白低于正常组(P<0.01)；溃结灵高、中和低剂组以及SASP组的Foxp3、STAT5蛋白表达均高于模型组(P<0.01或P<0.05)。4.溃结灵对UC大鼠结肠黏膜Foxp3、STAT5蛋白表达的影响Foxp3、STAT5对Treg细胞的发生、发展和功能起决定性的作用。Foxp3蛋白是Treg细胞中重要的调控因子,而STAT5蛋白的活化对Foxp3的表达起关键作用。方法：动物造模、分组、给药同实验一。采用结肠黏膜提取胞浆蛋白,BCA法测定蛋白含量。取150ug蛋白变性样品进行10% SDS-PAGE电泳,半干转至硝酸纤维素膜上,封闭,加兔抗多克隆抗体孵育,辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体孵育。ECL显色后用Bio-RAD扫描仪对蛋白含量进行密度分析。结果：模型组大鼠Foxp3和STAT5蛋白表达低于正常组(P<0.05),溃结灵高、中、低剂量组Foxp3蛋白表达高于模型组(P<0.05或P<0.01),溃结灵高、中剂量组和SASP组STAT5的蛋白表达高于模型组(P<0.05)。结论：综合研究结果分析,UC模型大鼠中,IL-6作为炎症因子大量表达,TGF-β1、IL-2、IL-10、Foxp3、STAT5等与Treg分化相关的因子表达降低,溃结灵能抑制IL-6的表达,提高TGF-β1的表达,高浓度的TGF-β1可促进Treg细胞的分化；溃结灵又能促进IL-2的表达,通过IL-2信号通路,激活下游的STAT5信号,促进Foxp3表达,提高Treg功能,促进分泌IL-10发挥免疫抑制功能,这可能是其治疗UC的作用机制之一。
项电巅[5]2009年在《溃结灵Ⅰ号治疗湿热型溃疡性结肠炎的临床观察》文中研究表明1.目的溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)是一种原因不明的直肠和结肠非特异性炎症性疾病,被世界卫生组织列为难治病之一。中药治疗溃疡性结肠炎有显着的优势,有突出的开发价值和广阔的前景。本文总结了中医学对该病的认识和现代医学的研究进展,并通过临床研究评价溃结灵Ⅰ号的疗效,为治疗UC提供新的有效药物。2.方法本课题以溃结灵Ⅰ号为治疗药物,以湿热型溃疡性结肠炎患者为观察对象。课题的观察指标是临床症状、体征、结肠镜肠粘膜变化、大便常规和免疫学指标。课题选择60例病人,这些病人符合入选标准。采用随机、平行对照、多中心的临床试验方法,按照随机原则将病人分为溃结灵Ⅰ号组(治疗组)和柳氮磺胺吡啶(对照组)。治疗组30例,溃结灵Ⅰ号口服30ml,每日3次,餐后2小时服。对照组30例,每日口服SASP 1.5g qid,疗程均为为7d,连续治疗二个疗程。治疗期间停服其它药物,忌食生冷油腻及辛辣刺激性饮食。3.结果本试验表明:溃结灵Ⅰ号治疗溃疡性结肠炎(湿热型)临床总有效率为83.3%,对照组临床总有效率为66.6%。治疗组有效率明显优于对照组。临床证候学表明:溃疡性结肠炎(湿热型)的临床症状经溃结灵Ⅰ号治疗后能够有效得到改善。如腹泻、腹痛、脓血便、里急后重、发热、肛门灼热、舌质红、苔黄腻、脉滑数、濡数等。4.结论本试验表明,溃结灵Ⅰ号治疗溃疡性结肠炎(湿热型)的临床作用优于柳氮磺胺吡啶。
祁燕[6]2013年在《溃结灵对原代大鼠结肠上皮细胞ITF表达及MAPK/ERK通路的影响》文中指出一、研究背景溃疡性结肠炎是一种病变部位主要位于结肠及直肠的慢性非特异性炎症反应。临床治疗多以抗炎、调节免疫为主。近年研究发现,肠道损伤后,除炎症损伤因素外,修复因素在病程的发展中同样具有非常重要的作用,两者的相互作用决定了UC病情的转归,许多生长因子参与肠黏膜修复过程。随着研究的发展,一些生长因子新制剂已逐渐应用于炎症损伤的治疗,并且取得不错的效果。肠叁叶因子(ITF)是近年发现的一种由肠道杯状细胞分泌新型细胞生长因子,与其它肠道保护修复因子(MUC-2、EGF、TGF-α等)可一起共同作用,具有很强的细胞保护作用,可明显减轻多种损伤因子介导的肠黏膜损伤。因此,研究中药复方对这些特异保护因子的调节作用,有望为UC治疗提供新的思路。经验方溃结灵以清热健脾活血为治则,临床研究表明其对UC疗效较好。前期研究采用叁硝基苯磺酸灌肠复制UC大鼠模型,发现溃结灵可明显减轻UC大鼠肠黏膜炎症反应,可下调炎症因子如Toll样受体、IL-1β、TNF-α、NF-κB等的表达,改善肠黏膜超微结构,上调造模3、7、14天模型大鼠肠黏膜ITFmRNA、MUC-2蛋白的表达及14天TGF-α和pERK1/2的蛋白表达；对UC血清致Caco-2细胞损伤模型的研究发现,溃结灵含药血清可促进Caco-2细胞损伤模型细胞增殖,增加ITF基因、MUC-2蛋白的表达以及上调pERK、pMEK蛋白的表达。本研究拟继续从促黏膜修复角度入手,观察溃结灵含药血清对大鼠结肠上皮细胞ITF表达及其信号转导通路相关蛋白ERK、MEK磷酸化变化的影响,进一步探讨溃结灵治疗UC的作用机理,和前期的实验互为佐证。二.研究方法与结果1.原代大鼠结肠上皮细胞分离培养方法的建立原代大鼠结肠上皮细胞来源于正常大鼠结肠组织,能真实反映机体生理和病理变化,然而分离培养技术是一个难题,限制了其应用。在参考国内外文献的基础上,本研究建立了大鼠原代结肠上皮细胞分离培养方法。可为结肠上皮形态及功能研究提供理想的细胞模型。方法：采用6-15日龄乳鼠,取结肠剪碎、反复清洗后,弃上清,加10ml、0.1%Ⅰ型胶原酶和透明质酸酶联合配制的消化液,37℃消化25min,分离上皮细胞团；吹打消化液,取上清,加入培养基重悬反复离心3次后,细胞沉淀接种于含10%胎牛血清的完全培养基中,37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。采用差速贴壁法及相差消化法去除成纤维细胞,细胞贴壁长满瓶80%-90%后用2.5g/L的胰酶消化液消化并传代。结果：成功分离结肠上皮细胞团且活力较高。24h后可见部分细胞团贴壁,贴壁细胞为多角形,4-8d逐渐融合成片,呈现明显的“铺路石”样。细胞经传代处理后成纤维细胞明显减少。第2代细胞在生长过程中逐渐生长成性似IEC-6上皮细胞,状态较好,增殖较快。细胞经免疫荧光染色及透射电镜观察鉴定为上皮细胞。冻存处理复苏后细胞状态较佳。2.大鼠结肠上皮细胞ITF/EGF、MUC-2/TGF-α及pERK/pMEK表达的研究胃肠黏膜保护及促修复因子ITF、MUC-2、EGF、TGF-α在肠黏膜损伤修复及肠黏膜屏障重建过程中具有重要的作用。本研究对结肠上皮细胞是否有以上生长因子的表达进行了检测。为后续开展药物对肠上皮细胞作用的指标选择提供基础及参考。方法：采用荧光定量PCR (Real-Time PCR)检测结肠上皮细胞ITF、EGFmRNA的表达；采用Elisa的方法检测MUC-2/TGF-α蛋白表达；采用Western bolt方法检测pERK/pMEK蛋白表达。结果：结肠上皮细胞表达ITF/EGFmRNA、MUC-2/TGF-α蛋白及pERK/pMEK蛋白。可用于肠黏膜损伤修复的相关实验研究。3.溃结灵含药血清对UC模型血清致损的结肠上皮细胞超微结构的影响本课题整体实验研究发现,溃结灵可明显减轻TNBS灌肠复制的UC大鼠的炎症反应,可促进肠道上皮杯状细胞的分泌,减轻结肠组织超微结构损伤,进而促进肠黏膜修复及重建。本实验在此基础上,观察溃结灵含药血清对UC大鼠血清致结肠上皮细胞损伤模型细胞超微结构的影响。进一步从细胞形态学方面探讨溃结灵的作用。方法：叁硝基苯磺酸灌肠法复制溃疡性结肠炎大鼠模型,3天后腹主动脉采血,分离获取血清,作为损伤剂作用结肠上皮细胞24h模拟细胞损伤模型,透射电镜法观察结肠上皮细胞超微结构的改变。结果：正常对照组及空白对照组细胞可见丰富的微绒毛,有的呈小片状。细胞内可见丰富的线粒体,还可见核糖体、内质网及高、中、低等电子密度分泌颗粒；UC模型血清造模组可见较少微绒毛,胞质内可见粗面内质网扩张,少量线粒体及线粒体肿胀,空泡样变甚至溶解,有大量的胞质内空泡形成,微绒毛较少或消失,分泌颗粒较少,为中低等电子密度。给予溃结灵含药血清组细胞形态较好,细胞微绒毛及线粒体等细胞器丰富,可见较多高、中、低等电子密度分泌颗粒。4.溃结灵含药血清对正常大鼠结肠上皮细胞增殖的影响结肠上皮细胞在肠黏膜损伤修复中具有重要的作用,UC发病时,促进结肠上皮细胞的增殖、移行、分化,可加速受损黏膜的修复以及肠黏膜屏障功能的恢复。本实验采用溃结灵含药血清干预结肠上皮细胞,探讨溃结灵含药血清对结肠上皮细胞增殖的影响。方法：采用血清药理学方法制备溃结灵含药血清；MTT法测定溃结灵含药血清干预大鼠结肠上皮细胞12、24、48h后细胞增殖情况。结果：空白大鼠血清对大鼠结肠上皮细胞(CEC)生长无影响,溃结灵中剂量(5%含药血清)作用24h、48h均明显促进CEC增殖(p<0.05)5.溃结灵含药血清对TNF-α致结肠上皮细胞损伤模型细胞增殖的影响TNF-α为公认的UC致病因子,是肠道上皮细胞增殖和凋亡的主要促炎因子,UC发病时,TNF-α大量分泌,可使结肠上皮细胞凋亡,肠黏膜屏障的通透性增加,NF-κB被激活,进一步扩发炎症反应,损伤肠黏膜。本实验观察不同浓度TNF-α对大鼠上皮细胞增殖的影响,以确定TNF-α合适的作用浓度及作用时间建立结肠上皮细胞损伤模型,并测定溃结灵含药血清对TNF-α干预下结肠上皮细胞增殖的情况,从细胞增殖的方面,进一步探讨溃结灵对受损结肠上皮细胞的保护作用。方法：以25,50,100,150,200ng/ml的TNF-α干预结肠上皮细胞,MTT法测定不同干预时间(3h,6h,24h)细胞的增殖情况,同法测定预先给予溃结灵含药血清对50ng/mlTNF-α干预结肠上皮细胞6h细胞增殖的影响。结果：①50ng/ml TNF-α干预结肠上皮细胞6h后可明显抑制细胞增殖(p<0.05)；②24h时,各浓度TNF-α均明显抑制结肠上皮细胞增殖(p<0.01)③与模型组比较,溃结灵含药血清各剂量组均有一定的促进TNF-α干预下结肠上皮细胞增殖的作用,但无统计学意义(p>0.05)。6.溃结灵含药血清对TNF-α干预下大鼠结肠上皮细胞ITF、EGFmRNA表达的影响ITF、EGF在胃肠道上皮保护和促进黏膜愈合方面发挥着重要的作用,与UC的修复愈合关系密切。本研究观察溃结灵含药血清对TNF-α干预下结肠上皮细胞EGF及ITFmRNA表达的影响,以进一步在离体细胞水平探讨溃结灵促进肠黏膜损伤修复的作用靶标。方法：以50ng/mlTNF-α干预结肠上皮细胞6h,造成细胞损伤模型,采用荧光定量PCR (Real-Time PCR)法检测不同浓度溃结灵含药血清对此细胞损伤模型ITF及EGFmRNA的表达的影响。结果：①模型组EGF、ITFmRNA表达较空白对照组减低；②溃结灵各剂量组(?)GFmRNA相对表达量与模型组相比,无统计学意义(p>0.05)；③溃结灵高(10%含药血清)、中剂量组(5%含药血清)ITFmRNA表达量明显高于模型组(p<0.05,p<0.01)。7.溃结灵含药血清对TNF-α干预下大鼠结肠上皮细胞MUC-2、TGF-α蛋白表达的影响MUC-2、TGF-α在黏膜保护和肠道疾病修复机制中占有重有地位,且在肠道黏膜修复中MUC-2、TGF-α、EGF、与ITF具有协同作用,保护和促进黏膜修复。本研究进一步观察了溃结灵含药血清对TNF-α干预下结肠上皮细胞MUC-2及TGF-α蛋白表达的影响,探讨溃结灵促进肠黏膜损伤修复的又一可能作用靶标,以进一步揭示溃结灵治疗UC的分子作用机理。方法：TNF-α(50ng/ml)干预结肠上皮细胞生长6h造成结肠上皮细胞损伤模型,采用Elisa方法检测不同浓度溃结灵含药血清对此细胞损伤模型MUC-2及TGF-α蛋白含量的影响。结果：①TNF-α作用于细胞后,与空白对照组比较,模型对照组MUC-2含量增加(p<0.01), TGF-α含量降低,但无统计学差异；②与模型对照组比较,溃结灵含药血清高剂量组MUC-2含量增加(p<0.05),溃结灵含药血清高剂量组TGF-α含量显著升高(p<0.01)。8.溃结灵含药血清对TNF-α干预下大鼠结肠上皮细胞pERKl/2、pMEK1/2蛋白表达的影响ERK信号转导通路参与调节细胞的增生、分化、凋亡等过程。其在真核细胞内广泛存在,许多因子通过ERK通路发挥作用。而细胞信号中传递丝裂原信号的关键激酶是胞外信号调节蛋白激酶(ERK1/2), ERK被激活后,可诱导细胞产生分裂、增殖等效应。本研究观察溃结灵含药血清对结肠上皮细胞损伤模型pERK1/2、pMEK1/2蛋白表达的影响。以期进一步揭示溃结灵治疗UC的作用机理。方法：TNF-α(50ng/ml)干预结肠上皮细胞生长6h造成结肠上皮细胞损伤模型,提取细胞全蛋白,采用WesternBlot法检测溃结灵含药血清对此上皮细胞损伤模型pMEK1/2, pERK1/2蛋白表达水平的影响,内参蛋白为β-actin,目的蛋白的相对含量为目的蛋白与β-actin密度的比值,结果进行组间比较分析。结果：①50ng/ml TNF-α作用于结肠上皮细胞6h后,细胞内pMEK1/2、pERK1/2蛋白表达均有增加；②溃结灵高剂量(10%含药血清)、中剂量(5%含药血清)明显促进pMEK1/2蛋白表达(p<0.05),溃结灵中剂量(5%含药血清)明显促进pERK1/2蛋白表达(p<0.05)。提示溃结灵含药血清对TNF-α法干预下结肠大鼠上皮细胞pERK1/2、 pMEK1/2蛋白表达有上调作用,ERK信号通路可能是溃结灵保护及修复肠黏膜损伤的转导途径之一叁、研究结论1.本研究建立了大鼠结肠上皮细胞原代培养体系,为结肠上皮生理、病理及药物作用机制提供了体外研究平台。对研究肠上皮细胞与炎症性肠病病因学的相关性及其中药对炎症性肠病的防治具有重要的意义。2、本研究结果显示,结肠上皮细胞表达ITFmRNA, EGFmRNA, MUC-2、TGF-α蛋白,ITF,MUC-2由肠道杯状细胞分泌,证明,此细胞可用于肠黏膜损伤修复的相关实验研究。3.溃结灵含药血清能够促进正常大鼠结肠上皮细胞的增殖,改善UC大鼠血清致结肠上皮细胞损伤模型的超微结构,对TNF-α干预下的结肠上皮细胞具有一定的促增殖作用。提示,促进结肠上皮细胞增殖是该方的疗效机理之一4.溃结灵含药血清能上调TNF-α干预下的结肠上皮细胞ITF基因、MUC-2、TGF-α蛋白表达以及pERK1/2、pMEK1/2蛋白表达。提示,溃结灵可通过激活ERK通路,促进上皮细胞的增殖移行,进而加速肠黏膜损伤修复。也可能是其作用的分子机制之一
参考文献：
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[4]. 溃结灵对UC大鼠Treg细胞分化相关因子的作用[D]. 王凤. 广州中医药大学. 2016
[5]. 溃结灵Ⅰ号治疗湿热型溃疡性结肠炎的临床观察[D]. 项电巅. 黑龙江中医药大学. 2009
[6]. 溃结灵对原代大鼠结肠上皮细胞ITF表达及MAPK/ERK通路的影响[D]. 祁燕. 广州中医药大学. 2013
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