王稳航[1]2003年在《“活性全骨复合物”的生物学功能及其活性成分分析》文中研究指明“活性全骨复合物”(WBE)是从牛股骨中提取出来的功能性补钙制剂，已获日本专利(WO96／23805)。本研究是利用动物饲养实验和细胞培养实验，验证WBE的壮骨功能，并分析其中活性成分以及从细胞分子水平阐明其功效机制。 将60只昆明系小鼠随机分为叁组：对照组(补加CaCO_3)、实验1组(补加普通骨粉)、实验2组(补加WBE)，然后进行饲养。 钙代谢实验表明，WBE的钙吸收率为86.16±10.24％，钙存贮率为94.12±7.14％，与对照组及实验1组呈不同程度的显着差异(P＜0.01或P＜0.05)。 各组小鼠大、小腿及腰椎的长度呈显着差异。其中，添加WBE组的大、小腿及腰椎分别为16.071mm、17.939mm、19.645mm。 各组小鼠骨质密度差异明显。其中，实验2组的骨质密度为1.24+0.17mg／mm~3。并且，WBE组小鼠骨中有机物含量(27.95±6.25％)与其它两组相比显着增加(P＜0.05)。 WBE组骨中钙含量为230.16±6.5mg／g，与对照组差异极显着(P＜0.01)；并且锌、镁含量也较其它两组为多，分别为6.66±1.47mg／g、290.48±41.76 μg／g。 添加WBE小鼠的大腿骨的生物力学指标(材料力学与结构力学)与其它两组相比，均呈显着性差异(P＜0.05或P＜0.01)。 骨组织形态检测结果表明，添加WBE小鼠骨小梁数目增多，变粗，骨髓腔减小；而其它两组骨小梁变稀，骨质脆弱，易于断裂。 实验2组中鲜骨游离钙、磷含量在48h时为3300μg／g、4050μg／g，其明显低于其它两组。 实验2组血钙、血磷及AKP含量分别为7.78±0.17mg／dL、6.37±0.19mg／dL、145.52±25.16IU／dL，与其它两组相比，呈不同程度的显着差异。 另外，对WBE进行蛋白提取并纯化，然后SDS电泳。电泳结果出现叁个主要蛋白区带，分别约为14、16、30kDa，此结果充分证明了WBE中活性成骨因子-成骨蛋白(BMP)的存在。 添加WBE组的细胞培养皿中，DNA量达到12.3μg／dish、10.2μg／FGM，胶原蛋白量达到85μg／dish，82μg／FGM。与未加BMP组有极大差异。对玻璃纤维膜(FGM)的光学及电镜观察结果显示，BMP能显着促进成骨细胞的分裂增殖，增强骨的形成。 此研究结果充分表明活性全骨复合物是一种优良的补钙制剂，它在提高钙的吸收率及存贮率，促进骨骼生长，增强骨的生物力学性质，以及预防骨质疏松方面发挥着重要的作用。
潘家义[2]2012年在《miRNA-290族对MSC的SDF-1/CXCR4信号轴调节作用及对其生物学功能的影响》文中研究指明目的：通过两种分离培养方法所得MSCs的生长特征和微环境的比较,选择一种可以快速、安全、高效地为临床和试验提供大量优质MSCs的方法。方法：提取C57BL/cA、鼠的骨髓,分别作密度梯度离心法和全骨髓贴壁培养分离法分离培养MSCs,并比较各自所得细胞的生长曲线、培养液中的VEGF、SDF-la浓度,评价方法优劣,也对所得细胞作了成脂、成骨分化,和流式细胞仪鉴定其表面抗原。结果：与密度梯度离心法相比,全骨髓贴壁分离法所得原代细胞有较快的生长速度,较短的生长周期；培养液中VEGF和SDF-1α浓度也稍高于密度梯度离心法；两种方法所得细胞均可成脂成骨分化,细胞表面表达CD29+、CD31-、CD34-、CD45-结论：全骨髓贴壁培养法可以快速、方便、有效地为临床和实验提供大量MSCs,这种方法所得细胞的培养为环境优于密度梯度离心法,减少了对细胞功能的损害。目的：寻找干细胞特异性miRNAs调节CXCR4?,提高MSCs的迁移能力。方法：生物信息分析miRNA-290族可能靶向作用于CXCR4,利用miRNA-290族模拟物、抑制物瞬时转染MSCs,检测CXCR4的mRNA表达和蛋白水平,发现miRNA-290族可已上调或下调CXCR4表达；作重组基因双荧光报告法检测靶基因；miRNA-290族模拟物、抑制物瞬时转染MSCs,作Transwell实验检测其迁移能力,PI单染色法、MTT实验检测细胞增殖情况。结果：miRNA-290族模拟物可以抑制CXCR4表达,抑制物可以上调CXCR4表达；miRNA-290族可以靶向作用于CXCR4; miRNA-290族模拟物促进MSCs增殖,miRNA-290族抑制物抑制了MSCs增殖；miRNA-290族模拟物抑制了MSCs迁移能力,miRNA-290族抑制物提高了MSCs迁移能力。结论：miRNA-290族可以调节CXCR4的表达,通过靶基因双荧光报告体系说明miRNA-290是直接靶向作用于CXCR4的;1niRNA-290族可以调节MSCs的迁移能力；miRNA-290族对MSCs生长增殖产生了一定影响目的：探讨下调MSCs的miRNA-290族的表达后对SDF-1/CXCR4轴的下游P13K/akt的影响,以及对MSCs表达VEGF、MMP-9和抗凋亡能力产生的影响,方法：在同一浓度SDF-1α、P13K特异抑制物或CXCR4抑制物干预miRNA-290族抑制物瞬时转染的MSCs; western blot检测SDF-1α/CXCR4信号轴下游的P13K/akt、和VEGF、MMP-9的表达情况；在无胎牛血清的情况下培养上述细胞,利用Annexin V/PI双染检测MSCs周亡情况结果：SDF-1可以促进SDF-1/CXCR4下游P13K/AKT的表达,这一作用在iti-miRNA-290组表现更加明显,且被CXCR4拮抗剂所抑制；SDF-1处理组的VEGF和MMP-9的表达高于未处理组,anti-miRNA-290转染组的VEGF和MMP-9的表达高于SDF-1P13K处理组,而P13K抑制物处理组VEGF和MMP-9的表达较anti-miRNA-290转染组明显下降。SDF-1处理组的抗凋亡能力优于无处理组；anti-miRNA-290转染组的抗凋亡能力进一步提高,而P13K抑制物处理组抗凋亡能力大幅下降结论：anti-miRNA-290上调SDF-1/CXCR4信号,通过激活下游PI3K/AKT途径促进VEGF, MMP-9表达,并提高了MSCs抗凋亡能力
车向新[3]2008年在《诱导型人工骨材料修复兔颅骨缺损的实验研究》文中提出研究背景颅骨缺损是神经外科中的一个常见问题,其形成的原因主要见于烧伤、创伤、肿瘤等。修复骨缺损,重建其生物学特性是神经外科急需解决的重要课题之一。颅骨缺损的修复主要包括修复材料的选择和修复方式的优化。为了避免传统的材料所带来的问题,人们开发了许多种人工骨修复材料。其中,“诱导因子+载体缓释系统”模式已成为骨组织工程学研究的一个热点。一种良好的诱导型人工骨材料应具有以下特性:①良好的生物相容性及生物降解性;②骨传导及与其他活性分子复合共同诱导骨发生;③能负载大量细胞,支持骨细胞生长和分化;④合适的机械强度与可塑形性;⑤原料来源广,生产价格廉,便于消毒保存。纵观国内外骨组织工程材料研究可发现,以下几种天然或人工材料逐渐被大多数研究者认可。例如:骨形态发生蛋白(bone morphogenetie protein,BMP)是一种多功能生长因子,其特征是有较强诱导成骨活性,且无种属特异性;胶原(collagen, COL)是骨基质的主要有机成分,COL与BMP复合可延缓BMP释放,可降低BMP的诱导剂量,令其维持较长的作用;羟基磷灰石(Hydroxyapatite,HA)是一种生物相容性和免疫原性都很理想的骨修复材料,纳米级羟基磷灰石(Nano-sized hydroxyapatite,n-HA)因其晶体尺径与人体骨矿中磷灰石相当,骨修复效果更佳;磷酸钙骨水泥(Calcium Phosphate Cement,CPC)具有可塑型性、吸收性和等温自固化等优良性能。到目前为止,上述各种材料单独使用或复合应用,均因存在塑形性、孔隙率、机械强度等不同问题而至实际成骨效果欠佳。为了找到一种可供临床用来修复骨缺损的组织工程材料,我们经过反复实验对CPC进行改良。合成α-磷酸叁钙(α-TCP)体系的CPC作为附加载体(Accessional Delivery,AD),利用仿生矿化技术将天然骨胶原与无机晶核(HA)自组装构建成纳米级核心载体(Nucleus Delivery,ND),借助AD与ND的内在联系与特性有机地构建成双载体系统(Double Delivery System,DDS);以提取天然活性蛋白为诱导核心与DDS进行有机组合,在满足材料强度的前提下在DDS上预制出活性生长通道(Active Growth Channel,AGC)的空间结构。把AD、ND和bBMP复合物制备成bBMP/ND/AD释放系统,用真空负压技术将释放体系有效地填充至AGC预制空间,最终制备出在成份、空间构型和生物活性上与正常人骨极其相似的人造骨主体部分,试图解决现有众多单一载体材料的缺陷。基于这种认识,我们进行了以下方面的工作:(1)活性蛋白异位诱导成骨评估;(2)载体材料的物性评估;(3)诱导型人工骨材料修复兔颅骨缺损实验。一、活性蛋白异位诱导成骨实验目的:检验自制备的牛骨形态发生蛋白(bovine bone morphogenetic proteins,,bBMPs)异位诱导成骨性。方法:取昆明小鼠40只,随机分成2组,将bBMPs材料植入小鼠右大腿后内侧肌袋内,术后2周、3周、4周、8周分别行放射学检查、组织学方法评价骨组织生长情况。结果:术后4周x线片显示材料植入区有小条状密度增高,8周见小块状密度增高。组织学显示2周有大量细胞集聚;3周有较多的骨细胞,有骨基质生成;4周有明显骨样组织形成;8周见明显完整的骨组织形成。而对照组没有上述结果。结论:本研究提取纯化的bBMPs在小鼠肌袋中具有良好得生物相容性和异位诱导成骨能力。二、载体材料的制备与物性评估目的:检测核心载体(ND)、附加载体(AD)以及双载体系统(DDS)的微观结构、机械强度与可塑性等。方法:①湿法制备ND,经X线衍射(XRD)、电子显微镜扫描(SEM)测其粒度与微观形态;②马弗炉煅烧法制备α-磷酸叁钙(α-TCP)体系的CPC(AD),用国产多功能压力测试机检测其机械强度,XRD测其TCP纯度,能谱检测钙磷比,SEM观察微观结构;③DDS检测方法同上。结果:①ND材料:ND的粒度为98纳米(nanometer,nm),与人骨接近;样品经SEM显示微观结构呈花瓣样,具有HA与胶原的共同特征。②AD材料:材料水化72h时平均承压力5000牛顿/cm3(约170Mpa),水化7d压力为8800牛顿/cm3;受试者工作曲线(ROC)显示结果呈正态分布;XRD测定其TCP含量为92.7%(标样的TCP含量为94%,Fluka公司产品,编号:50553);材料水化14d后,原料成份已全部水化成HA,XRD显示材料中未见有害基团,孔隙率为45%,能谱分析其成份中钙磷比为1.52;随着水化时间的延长(24h、72h、7d、14d),SEM显示该材料的结晶先为针状,最终形成板状,呈低结晶状态。③DDS:叁组材料样品分别加入0.25%、0.5%、1%ND后,压力测试显示加入0.25% ND的复合材料压力下降至4200牛顿/cm3左右;动态水化过程XRD测试显示添加0.25%ND,水化产物未见明显异常;材料的孔隙率为55%,钙磷比1.6,SEM显示其微观形态与ND相同。结论:本研究所制备的AD材料,添加ND会造成复合材料承压能力下降,压力下降数值与ND加入量呈正相关。加0.25%ND复合材料的压力下降程度符合本实验研究作为支撑(载体)材料的压力强度。复合材料在保持水化产物的稳定条件下,钙磷比更接近人骨,机械强度下降、孔隙率增加,有利于材料降解,是一种理想的骨缺损修复材料。叁、诱导型人工骨材料修复兔颅骨缺损实验目的:观察诱导型人工骨材料在修复兔颅骨缺损中的作用效果。方法:选取健康成年新西兰大白兔51只,随机分成实验材料组(复合材料,M组)、实验对照组(同种异体冻干骨,B组)和空白对照组(N组);M组材料采用固化成型的圆“纽扣”状样品,预制含释放系统(ND、bBMP)的活性生长空间(AGC);制备双侧颅顶骨8mm的骨膜与骨缺损模型,分别植入相应材料后固定。术后按2周、4周、8周、12周、16周时程分别取材,进行大体观察、外周血液检验、X线影像检查、荧光双标示踪、组织学与免疫组化观察,比较各组材料修复兔颅骨缺损效果。结果:①大体观察:手术后,各组均有3-4只动物术后头顶缝线处轻度肿胀,在3天内消失;2周时,M组与B组植入材料在缺损表面清晰可见,材料与宿主骨之间有组织长入,N组缺损表面有薄层组织覆盖。4周时,M组表面见薄层组织覆盖,但材料仍可见;从顶骨内面见一侧材料的AGC位置有透明黄色组织微突;8周时, M组表面有外骨痂出现,其它各组少量结缔组织覆盖。12周和16周各组骨缺损表面均有组织交织因而不易分辨。②外周血液检查:手术前与术后1周、2周,M组、B组、N组动物的血LYM%值结果统计分析显示:M组LYM%分别与B组、N组间的差异有统计学意义。而叁组动物手术前与取材时的血总蛋白、谷丙转氨酶、尿素氮、碱性磷酸酶、钙离子等结果统计分析显示,各组间以及同组5个时间点之间的差异均没有显着意义。③X线影像观察:术后2周M组材料密度高于周围松质骨,植入材料清浙可见;4周时可见左侧材料上已有骨痂形成,8周时轮廓已分辨不清,材料中央区密度较4周时有所下降,12周材料中央区密度下降明显,接近周围组织,边缘均有连续性骨痴,材料降解。16周时材料降解明显,已与周边连成一体B组术后2周与周围松质骨近似,8周周围有骨痴生长,边界不清;16周B组中央已部分吸收,边缘硬化。N组2-8周缺损区明显,12周、16周边缘模糊似有新骨,但骨缺损区明显大于B组。④骨磨片组织形态观察:术后8周、12周,M组4倍光镜下可见缺损区边缘已不规则,内部出现较多不规则蓝色骨小梁和类骨质,其中可见暗红色钙质沉着,提示为新生骨小梁;而B组材料不完整,呈小片分散状,仅边缘有少量新生骨小梁与类骨质。N组大部缺损仍存在,中心部位无新生骨小梁。⑤骨磨片组织荧光双标观察:术后8周、12周、16周,M组植入区边缘和中央可见较多绿色和金黄色荧光带;有散点状、不规则环形、“双轨征”,提示有新骨长入,且生长活跃;绿、黄荧光带间距接近20微米(2种示踪济相隔7天),提示新骨生长速度较快。B组荧光以边缘区为主,缺损区中央可见1-2条状荧光,较M组少。N组只在边缘区见少量荧光。⑥组织形态学观察:M组术后2周植入材料区大量细胞聚集为主;4周边缘区有新骨生长,活性生长空间(AGC)内见骨样组织、小血管和大量细胞聚集,材料已部分降解吸收,剩余人工骨裂解成颗粒状晶体散在其中;8周时材料AGC部位骨细胞增殖活跃,新骨相互连接成片状;12周缺损区新骨进一步重建,纵切面见新骨样组织形成“框”形架,呈向“框”架内延伸;16周见AGC区形成髓腔样结构,周围大量新生骨样组织和血管。B组术后各时程新骨形成量较M组少,缺损区材料逐渐分离成片状,4周以后宿主骨缺损端见新生骨组织;N组4周后边缘见少量新骨,但缺损中央未见新骨生长,代之以大量纤维结缔组织填充。各组各时间点均未见植入区周围有炎性细胞聚集。⑦免疫组织化学观察:实验中取M组叁个时间点(4周、8周、12周)取样,免疫组化分析M组材料与缺损交界区BMP2含量变化,结果显示叁个时间点在边界区均有内源性BMP2分布,同时在材料中央孔区均有外源性BMP2着色。利用Motic Images Advanced3.2图像分析软件,对各组样本免疫组化结果通过灰度扫描进行半定量分析,数据经统计学处理显示:叁个时间点的BMP2含量的灰度值均无显着差异。结论:①在体实验显示该复合材料生物相容性较好,能复合活性骨生长因子缓慢释放;②在复合材料中AGC的构建使诱导成骨呈多点生长趋势,有利缩短新骨生长距离,加速骨缺损修复;③复合材料植入机体后可降解并持续促进新骨生长,诱导成骨效果强于同种异体冻干骨。
程功, 张国财, 马玲, 田树新, 张星耀[4]2016年在《基于反向分子对接的虫草素和叁磷酸虫草素的生物活性》文中认为分别采用idTarget、Pharm Mapper在线反向分子对接软件预测虫草素和叁磷酸虫草素的靶标蛋白(药效团匹配蛋白),用Ledock分子对接软件模拟虫草素、叁磷酸虫草素与靶标蛋白的结合构象,用Lig Plus软件分析结合构象活性口袋内残基与配体的相互作用。反向分子对接结果表明:叁磷酸虫草素与靶标蛋白的自由结合能比虫草素与靶标蛋白的自由结合能低。分子对接结果表明:与虫草素相比,叁磷酸虫草素与靶标蛋白活性口袋内的氨基酸残基可形成更多的氢键,且叁磷酸虫草素和靶标蛋白有较好的几何匹配,其自由结合能也较低,其结合构象更稳定。根据正向、反向分子对接结果,认为叁磷酸虫草素是虫草素进入人体内发挥生物活性的主要物质。
王佃亮[5]2018年在《脐带间充质干细胞制剂生产及相关要求——《脐带间充质干细胞》连载之叁》文中进行了进一步梳理中国生物工程杂志 ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１８，３８（１０）：１０３１０７ＤＯＩ：檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪殏殏殏殏１０．１３５２３／ｊ．ｃｂ．２０１８１０１２讲 座脐带间充质干
王佃亮[6]2018年在《脐带间充质干细胞制剂生产及相关要求——《脐带间充质干细胞》连载之叁》文中研究指明中国生物工程杂志 China Biotechnology，2018，38( 10) : 103-107DOI:檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪殏殏殏殏10． 13523 / j． cb． 20181012讲 座
参考文献：
[1]. “活性全骨复合物”的生物学功能及其活性成分分析[D]. 王稳航. 河北农业大学. 2003
[2]. miRNA-290族对MSC的SDF-1/CXCR4信号轴调节作用及对其生物学功能的影响[D]. 潘家义. 中南大学. 2012
[3]. 诱导型人工骨材料修复兔颅骨缺损的实验研究[D]. 车向新. 南昌大学. 2008
[4]. 基于反向分子对接的虫草素和叁磷酸虫草素的生物活性[J]. 程功, 张国财, 马玲, 田树新, 张星耀. 湖南农业大学学报(自然科学版). 2016
[5]. 脐带间充质干细胞制剂生产及相关要求——《脐带间充质干细胞》连载之叁[J]. 王佃亮. 中国生物工程杂志. 2018
[6]. 脐带间充质干细胞制剂生产及相关要求——《脐带间充质干细胞》连载之叁[J]. 王佃亮. 中国生物工程杂志. 2018
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