李宏梅[1]2006年在《重组鸡白细胞介素18生物学活性检测及其对鸡免疫影响的研究》文中指出白细胞介素18(IL-18)具有广泛的生物学活性,能够促进γ-干扰素(IFN-γ)的产生,刺激淋巴细胞转化,增强NK细胞的杀伤活性,在介导细胞免疫、抵抗微生物感染方面具有重要的作用。对人和哺乳动物IL-18的研究已有许多报道。本研究室在2001年开展鸡白细胞介素18(ChIL-18)的研究,先后构建ChIL-18的重组质粒和原核表达系统、真核质粒及其表达系统,在此基础上,对纯化后的原核表达的重组鸡白细胞介素18产物进行生物学活性检测,对其在生产中的应用做了初步研究,同时对影响ChIL-18原核表达产物生物学活性的因素也进行了探讨。实验一MTT法检测鸡脾和外周血NK细胞杀伤活性方法的建立选取不同日龄的SPF鸡和肉鸡,通过贴壁法从血液和脾脏分离出NK细胞作为效应细胞,选择MDCC-MSB1和MDCC-MSBCU147分别作为靶细胞,二者按比例混合,孵育,利用MTT法检测靶细胞的活力反映效应细胞对靶细胞的杀伤活性,并对效靶比、作用时间进行比较,结果显示MSB-1和CU147均可作为NK细胞良好的靶细胞,但CU147更稳定;效靶比为20:1~50:1,作用时间8~16h杀伤效果稳定;50%DMF- 20%SDS混合物作为裂解液能够对结晶彻底溶解,优于其它溶解试剂如二甲基亚砜等。该方法为检测重组鸡白细胞介素18蛋白对NK细胞杀伤作用这一生物学活性奠定基础。实验二鸡白细胞介素-18(ChIL-18)重组蛋白的生物学活性检测对含有ChIL-18基因的质粒在大肠杆菌内进行诱导表达,经亲合层析法对表达产物进行纯化,用微量细胞病变抑制法——CEF-VSV系统,检测其对SPF鸡脾淋巴细胞诱导产生γ-干扰素(IFN-γ)的活性和其对病毒的抑制效果;用3H-TdR掺入法和MTT法分别检测其对T淋巴细胞诱导转化和NK细胞杀伤活性的作用。结果表明经诱导表达出分子量为44KD的目的蛋白(与GST融合表达),纯化后得到去除菌体蛋白的高纯度目的蛋白;生物学活性检测表明该蛋白能够诱导脾细胞产生IFN-γ,当浓度为250ng/ml时诱导IFN-γ的活性最高,可达1×106U/ml;但该蛋白不能直接抑制VSV在CEF上生长;能够刺激淋巴细胞显着增殖,浓度为250ng/ml时效果最佳;适当浓度的rChIL-18蛋白能促进NK细胞的杀伤活性,浓度为150ng/ml时,作用最强。以上结果表明,利用原核表达的重组鸡白细胞介素-18蛋白具有与天然鸡IL-18蛋白一样较广泛的生物学活性,为进一步研究它在生产中的应用奠定了基础。
韩宗玺[2]2004年在《鸡白细胞介素18成熟蛋白的表达及其部分免疫功能研究》文中指出白细胞介素18（Interleukine-18，IL-18）是1995年由Okmura等发现的一种细胞因子，具有强烈的IFN-γ诱生能力，在机体免疫调控中具有重要作用。鸡IL-18(Chicken IL-18, ChIL-18)则是Schneider等2000年发现的。医学生物学研究证明IL-18在抗微生物感染、抗肿瘤免疫中具有应用潜力。对于ChIL-18的研究尚处于起步阶段，本实验室在前期的研究中克隆到了chIL-18成熟蛋白基因，本研究中，将此基因亚克隆至原核表达载体pPROEXTMHT中，构建重组质粒并进行确证性序列测定。然后将重组质粒转化大肠杆菌DH5α并用IPTG于37℃诱导培养获得表达，表达形式为包涵体。凝胶薄层灰度扫描显示表达的融合蛋白约占菌体蛋白的30%。SDS-PAGE 和Western blot分析显示，表达的鸡IL-18融合蛋白分子量约为23 kDa。包涵体通过6M盐酸胍裂解后，利用镍离子亲和树脂进行纯化。用所获得的重组ChIL-18融合蛋白及其纯化产物经叁次肌肉注射豚鼠，制备豚鼠抗ChIL-18多克隆抗体。琼脂扩散实验表明制备的多克隆抗血清与ChIL-18具有良好的反应性。由于原核表达系统存在蛋白修饰不完全的缺点，本研究中还用昆虫细胞/杆状病毒真核表达系统以期表达在结构和活性上更接近天然chIL-18的重组蛋白。本实验将编码鸡白细胞介素18成熟蛋白的基因亚克隆到杆状病毒转移载体pMelBac B上，构建真核转移载体pMelBacBChIL-18，经限制性内切酶消化、ChIL-18特异引物PCR鉴定和确证性序列测定，证明目的基因正确克隆到载体的预期位点。将纯化的pMelBacBChIL-18质粒与杆状病毒DNA（Bac-N-BlueTM DNA）共转染sf9昆虫细胞，经四轮蓝斑筛选纯化，获得了重组杆状病毒，命名为rBaculovirusChIL-18。提取病毒染色体DNA，经ChIL-18特异引物和重组杆状病毒特异引物PCR鉴定，证明获得了纯化的重组杆状病毒。用该重组病毒接种sf9昆虫细胞，收获接种后不同时间的细胞进行SDS-PAGE。结果表明ChIL-18基因在昆虫细胞中获得了表达，表达的重组蛋白分子量约为23KD。应用在大肠杆菌原核表达系统中表达的重组蛋白制备的豚鼠抗ChIL-18多克隆抗体进行Western blot分析，表明本研究真核系统表达的ChIL-18成熟蛋白和前期原核系统表达的ChIL-18成熟蛋白均具有生物学活性。由于昆虫细胞/杆状病毒真核表达系统表达的蛋白量比较低、成本高且不易纯化，因此，本研究在证明了前期原核表达ChIL-18具有生物学活性的基础上，应用原核表达的重组ChIL-18蛋白作为广谱的免疫制剂研究了其对肉仔鸡增重作用和对IBV的抗病毒作用。本研究将实验动物分为称重组和IBV接种组，每组又设PBS对照、细菌蛋
苏倩倩[3]2012年在《鸡白细胞介素18成熟蛋白的表达、纯化及其单克隆抗体的制备与特性鉴定》文中研究说明白细胞介素18能明显诱导Th1和NK细胞产生IFN-γ，还可诱导IL-2、GM-CSF及TNF-α等多种细胞因子的产生。IL-18不但具有抗病毒、抗肿瘤活性，也可作为加强和改善机体免疫应答的免疫佐剂，与病毒的保护性抗原基因共表达可加强和改善机体的免疫应答。在某些疾病中监测IL-18的水平可以动态观察和了解疾病的发展、转归以及机体的免疫反应规律，所以有必要利用抗IL-18单克隆抗体建立相应的检测方法。到目前为止，国内外已有人、小鼠、猴、猪、牛和羊等种属的IL-18商品化制剂及其相应的单克隆抗体(McAb)或多克隆抗体(PcAb)以及夹心ELISA试剂盒的商品化供应。但目前，国内尚未见鸡IL-18单抗制备方面的报道。本课题对鸡IL-18(ChIL-18)成熟蛋白的单克隆抗体进行了研究。将鸡IL-18的成熟蛋白基因经扩增后亚克隆入原核表达载体pET-28a(+)中，经PCR、双酶切和测序鉴定后，构建了重组质粒pET-28a-mChIL18。将该质粒转化入高效表达菌Rosetta(DE3)的感受态细胞中，利用IPTG诱导表达得到大小为23KDa的融合蛋白，并利用载体上所带有的His标签蛋白这一特点，采用Ni-NTA亲和层析法纯化重组蛋白ChIL-18，从而获得了纯度较高的蛋白，其含量最高可达7.8mg/mL，最低为1mg/mL。利用纯化的重组ChIL-18蛋白对BALB/c小鼠进行免疫，并建立了检测小鼠抗体水平和单抗鉴定的间接ELISA检测方法。经反复试验确定了间接ELISA测定小鼠抗体水平以及筛选阳性杂交瘤细胞株的最佳反应条件，最佳抗原包被质量浓度为4μg/mL，阴阳性血清稀释倍数为1:10~4，羊抗鼠IgG辣根过氧化物酶结合物最佳稀释倍数为1:4000，抗原抗体最佳结合时间是1.5h，血清与二抗最适反应时间是1h。融合前抗体效价达到1:106，满足融合时对小鼠抗体的要求。SP2/0骨髓瘤细胞与加强免疫后的小鼠脾细胞在PEG作用下进行融合，经间接ELISA方法检测融合细胞，经过3次亚克隆筛选出能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株，最终确定两株单抗2E6和1G9作为试验研究对象，并大量制备了单抗腹水。两株单抗亚型鉴定表明，均属于IgM亚型。1G9和2E6的腹水效价分别为1:5.12×10~5和1:3.2×10~4。ELISA迭加试验分析表明，1G9和2E6可分别结合到IL-18不同的抗原位点上，两者具有迭加性。Western blot鉴定结果表明，单抗2E6和1G9只能与重组ChIL-18蛋白发生特异性反应，不能与相同原核表达质粒及相同表达系统表达的新城疫NP蛋白、禽偏肺病毒G蛋白发生特异反应，从而排除单抗对His标签反应。IFA鉴定表明，重组真核质粒pcDNA3.1-mChIL18转染293T细胞，有目的蛋白表达，试验证实单抗可以特异性检测真核质粒在细胞上的表达，且产生特异性明显荧光。
张旭[4]2010年在《卢氏鸡主要白细胞介素的克隆分析与IL-21的原核表达》文中认为白细胞介素(Interleukin,IL)在机体抗感染、炎症和造血等生物学反应中发挥重要作用,在家禽疫病防治中也具有极大的应用价值。近年来,有关禽白细胞介素的研究发展迅速,涉及的禽类品种很多,但各品种所研究的白细胞介素种类并不多,所以其研究并不系统和全面。卢氏鸡是河南地方良种鸡,目前有关其白细胞介素的研究未见报道。故系统的克隆分析卢氏鸡白细胞介素,研究其活性,不但对研究鸡免疫系统及其免疫调节机理具有重要作用,而且在与人类和哺乳动物的比较免疫学、生物发育和进化的研究中具有重要意义。IL-21具有广泛的生物学功能,能够刺激T细胞、B细胞、NK细胞的增殖分化,增强NK细胞的杀伤活性,在免疫防御、抗瘤抑瘤等方面具有重要作用。因此,IL-21作为一种新型的免疫调节剂和免疫佐剂,具有很大的应用前景。本研究采用RT-PCR方法,从ConA诱导的卢氏鸡脾淋巴细胞中扩增了卢氏鸡IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-9、IL-12B、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21共10种白细胞介素全基因,并运用多种软件和在线服务器对各白细胞介素进行了信号肽、分子量、等电点、亲水性和叁级结构分析,为进一步的表达及蛋白功能的研究奠定了良好基础。同时,将卢氏鸡各白细胞介素基因与其它禽类和哺乳动物进行了同源性分析和进化树构建。结果表明,卢氏鸡与其他品种鸡的白细胞介素基因核苷酸和所编码的氨基酸均具有极高的同源性,接近或达到100%,说明禽类白细胞介素基因非常保守。唯有IL-4变化较大,其核苷酸和氨基酸同源性分别为99.3%和97.8%,而IL-1β、IL-15和IL-12B的核苷酸虽有所变化但未导致氨基酸的改变。与哺乳动物相应基因的核苷酸同源性在50%左右,而氨基酸序列同源性有高有低:IL-2、IL-3、IL-4、IL-18的同源性在15%~25%,而IL-9、IL-12B、IL-17的同源性在40%~50%。在此基础上,本研究首次构建了鸡IL-21原核表达载体pET-28a-IL-21,并在大肠杆菌Rosetta(DE3)中实现了高效表达,表达的重组蛋白约占菌体总蛋白的33.9%。重组蛋白经镍柱亲和层析纯化和复性后,分别运用MTT法和ELISA法检测其对鸡外周血淋巴细胞增殖和分泌IL-2、IFN-γ的影响。结果表明,重组鸡IL-21蛋白不仅能明显刺激鸡外周血淋巴细胞的增殖,而且还能促进外周血淋巴细胞分泌IL-2和IFN-γ。本课题了解了卢氏鸡与其它品种禽类和哺乳动物白细胞介素在分子结构上的异同,而且首次构建了鸡IL-21原核表达系统,实现了鸡IL-21重组成熟蛋白的高效表达并初步测定了其生物学活性,为今后研究和利用家禽细胞因子和进一步研究鸡IL-21的结构和生物学功能奠定了良好的基础。
范忠玲[5]2010年在《鸡白细胞介素18成熟蛋白在昆虫杆状病毒系统中的表达及其活性检测》文中研究说明白细胞介素18(Interleukine-18, IL-18)是1995年由Okmura等从小鼠肝脏中克隆获得的一种细胞因子,主要由单核巨噬细胞系统的细胞分泌,具有强烈的IFN-γ诱生能力,对机体起着重要的免疫调节和保护作用,在抗微生物感染、抗肿瘤免疫中具有应用潜力。对人和哺乳动物IL-18的研究已有许多报道,而鸡IL-18(ChIL-18)基因发现得比较晚,由于它具有与人和哺乳动物相似的生物学功能,因此ChIL-18在比较免疫学研究和禽病治疗中具有重要意义。本实验室从2001年开始进行鸡白细胞介素18的研究,已经在原核系统中实现了鸡白细胞介素18成熟蛋白(mChIL-18)基因的高效表达,但由于该系统表达的蛋白存在非糖基化形式等缺陷,使得表达的蛋白分子常失去天然结构,因而对表达的重组蛋白的活性还存在争议。本试验利用昆虫/杆状病毒系统表达鸡白细胞介素18成熟蛋白,进而对该重组蛋白有效地进行了生物学活性检测。参考已发表的mChIL-18的cDNA基因序列,设计一对特异性引物,以pMD18-T-mChIL18质粒为模板,扩增出编码mChIL-18成熟蛋白基因的cDNA片段。再以杆状病毒pFastBac TM HTb为载体,将mChIL-18基因插入到表达载体pFastBacTM HTb的多角体蛋白启动子PPH的下游,构建重组转移载体质粒pFastBacTM HTb-mChIL-18,然后将已构建好的重组转移载体质粒转座入大肠杆菌DH10BacTM感受态细胞中,经过叁次蓝白斑筛选纯化后提取质粒,通过一对通用引物M13(Bacmid含有该引物Forward和Reverse两个引物位点,能够从两侧扩增LacZα互补区域内的mini-attTn7位点,有利于PCR分析)进行PCR扩增鉴定,得到重组Bacmid(Bacmid-mChIL18)。在转染试剂Cellfectin的作用下,通过脂质体介导法将纯化的Bacmid-mChIL-18转染至草地贪夜蛾细胞(Spodoptera frugiperda 9,sf9)获得P1代重组杆状病毒,用P1代病毒反复感染sf9来扩增病毒滴度,将达到一定滴度(107~108pfu/mL)的重组杆状病毒再感染sf9,并在感染后不同时间段收获sf9细胞及培养上清,然后对细胞进行超声波破碎,离心后分别取裂解上清和沉淀,经SDS-PAGE电泳分析、Western blotting和间接免疫荧光(IFA)检测,结果表明,mChIL-18基因在昆虫细胞sf9中获得了表达,表达的目的条带分子量约为23KD。采用鸡脾淋巴细胞增殖试验(MTT法)、IFN-γ诱导实验和水疱性口炎病毒(VSV)抑制试验对表达的蛋白进行生物学活性测定。鸡脾淋巴细胞增殖试验表明,mChIL-18融合蛋白能够明显促进淋巴细胞的增殖,不同浓度的蛋白均可刺激淋巴细胞转化。当浓度为200ng/mL时,刺激转化效果最佳,但随着蛋白浓度的增大,淋巴细胞的增殖指数则会降低;VSV病毒活性抑制试验表明,当蛋白浓度大于100ng/mL时能刺激脾淋巴细胞产生IFN-γ,并且随着mChIL-18蛋白浓度的增加,诱导产生IFN-γ的量随之增加;将不同稀释度的IFN-γ分别作用于VSV,在IFN-γ≥1×102U/mL时,具有较强的抑制效果,当IFN-γ为10 U/mL时,只能达到50%的保护。该结果说明mChIL-18融合蛋白的抗病毒活性是通过IFN-γ实现的,且在一定浓度范围内具有抑制VSV病毒产生细胞病变的作用。
王肖祎[6]2013年在《鸡白细胞介素18双抗体夹心ELISA检测方法的建立及初步应用》文中指出白细胞介素18(Interleukin-18, IL-18)主要由单核-巨噬细胞系分泌，在结构上属于IL-1家族，在功能上与IL-12相似，而且与IL-12有协同效应，是重要的调节先天性免疫和获得性免疫的细胞因子。评价IL-18在机体内的动态变化水平，对于了解传染性疾病的发生、发展、转归情况及其机体保护性免疫反应动态规律有着重要的意义，本课题组也已发现并报道了鸡IL-18的转录水平与家禽肿瘤病毒感染之间存在的相关性。鉴于此，有必要建立检测IL-18蛋白在机体中水平变化的方法。迄今为止，尽管国内外已有多种动物的商品化IL-18夹心ELISA试剂盒，但尚未见有国产的鸡白细胞介素18成熟蛋白(mature chicken interleukin-18, mChIL-18)夹心ELISA试剂盒。本研究旨在利用重组ChIL-18蛋白(recombinant ChIL-18, rChIL-18)和识别不同表位的抗ChIL-18单克隆抗体(mAb)建立ChIL-18双抗体夹心ELISA检测方法，从而为监测鸡体免疫状态和研究鸡体免疫机制提供技术平台。将实验室已构建的含有mChIL-18基因的重组原核表达质粒pET-28a-mChIL18在大肠杆菌中进行高效表达，采用Ni-NTA亲和层析方法纯化重组蛋白，免疫BALB/c小鼠，经融合、筛选制备特异性单克隆抗体，并通过间接ELISA、间接免疫荧光(IFA)和Western-blot等方法对mAb做初步鉴定。结果表明，试验成功表达了mChIL-18蛋白，并最终获得1株持续且稳定分泌抗体的杂交瘤细胞(1B10)，其腹水ELISA效价为1:3.2×104，亚类鉴定结果为IgM。Western-blot结果显示，单抗能特异性识别原核表达的mChIL-18蛋白，IFA分析表明单抗能与真核表达的mChIL-18发生特异性反应。将1B10与实验室已制备的针对不同抗原表位的另外2株单克隆抗体(1G9、2E6)通过ELISA迭加试验进行抗原表位分析，结果表明，1B10与1G9针对同一抗原表位。应用识别不同表位的鸡白细胞介素18成熟蛋白的2株单克隆抗体1G9和2E6，建立检测mChIL-18的单抗包被-单抗检测的双抗体夹心ELISA方法，并利用此方法对禽网状内皮组织增生症病毒(reticuloendotheliosis virus, REV)人工感染SPF鸡体内mChIL-18的分泌水平进行检测。结果显示，包被抗体的最佳质量浓度为8μg/mL，检测抗体的工作效价为1:800，待检样品的最佳稀释度为1:400，检测敏感度可达31.5pg/mL，与其他细胞因子等抗原蛋白无交叉反应；跟对照组相比，REV感染鸡体内mChIL-18的表达量在7d、14d、21d、28d、35d、42d和49d均呈现升高，但只有14日龄时表现差异显着(p<0.05)。同时应用鸡白细胞介素18成熟蛋白的多克隆抗体和单克隆抗体1G9，建立了检测mChIL-18的多抗包被-单抗检测双抗体夹心ELISA方法，并利用此方法对前述临床样品进行了检测。结果显示，包被抗体的最佳质量浓度为20μg/mL，检测抗体的工作效价为1:800，待检样品的最佳稀释度为1:400，与其他细胞因子等抗原蛋白无交叉反应；跟对照组相比，REV感染鸡体内mChIL-18的表达量在7d、14d、21d、28d、35d、42d和49d均呈现升高，但只有42日龄时表现差异显着(p<0.05)。上述结果表明，本试验成功建立了ChIL-18的两种双抗体夹心ELISA，为鸡传染病的细胞免疫学研究提供了可靠方法。
余宁[7]2013年在《重组鸡IL-18复合免疫增强剂对新城疫疫苗免疫增强作用的研究》文中提出白细胞介素-18是一种重要的细胞因子，具有多种生物学活性，在介导细胞免疫、抵御病毒感染、抗肿瘤方面起着非常关键的作用。植物血凝素和2-脱氧葡萄糖分别在刺激淋巴细胞增殖、直接抑制病毒繁殖方面有着显着的效果，在畜禽病毒性疫病治疗方面已有广泛应用。新城疫疫苗免疫失败以及隐性感染使得非典型新城疫常有发生，给养殖业造成了巨大的经济损失。本试验以植物血凝素和2-脱氧葡萄糖的有效剂量和常用剂量，配合不同剂量重组鸡白细胞介素-18，配制成复合免疫增强剂，联合新城疫疫苗免疫雏鸡，研究其对新城疫疫苗的免疫增强效果。应用新城疫弱毒苗对7日龄雏鸡首免，5h后使用不同比例配方的复合免疫增强剂分别经口服、肌肉注射途径免疫雏鸡，分开饲养；21日龄先后用新城疫中等毒力疫苗和复合免疫增强剂二免。首免后每隔7d，每组随机取10只鸡，无菌心脏采血，分离淋巴细胞测定其淋巴细胞转化率；分离血清，ELISA检测试剂盒测定血清中白细胞介素-2和γ-干扰素含量；血凝和血凝抑制试验测定血清中新城疫抗体水平；雏鸡颈椎脱臼处死，称量并记录体重，解剖取其脾脏和法氏囊并称量记录，计算其免疫器官指数；35日龄时使用新城疫F48强毒株对各组剩余雏鸡经点眼滴鼻攻毒，观察并记录鸡群状态和死亡率。结果显示，肌肉注射含重组鸡白细胞介素-18蛋白的复合免疫增强剂能够显着提高鸡血清中γ-干扰素和白细胞介素-2水平，随白细胞介素-18蛋白量的增加，其表达水平有升高趋势，且以注射后第7d-14d表达含量最高，分别为43ng/L和70ng/L，至少在28d仍能维持较高水平；经口服途径免疫，含鸡白细胞介素-18重组菌的复合免疫增强剂也能显着提高鸡血清中γ-干扰素和白细胞介素-2水平，免疫后第7d，其表达水平最高，分别为50ng/L和62ng/L，之后稍有下降，随IL-18重组菌量的增加，γ-干扰素和白细胞介素-2表达水平变化不大。复合免疫增强剂经肌肉注射、口服途径均能显着提高新城疫疫苗免疫鸡群的淋巴细胞转化率、抗体水平和免疫器官指数，且肌肉注射效果较口服效果好，随白细胞介素-18蛋白量的增加，淋转率和抗体水平均有升高趋势，平均抗体滴度在二免7d左右达到最高值10.2(log2)，对免疫器官的早期发育具有显着的促进效果，对脾脏中期发育也有促进作用，能够明显提升免疫鸡群对新城疫强毒株的抵抗力。试验结果表明，由重组鸡白细胞介素-18、植物血凝素和2-脱氧葡萄糖组成的复合免疫增强剂，在诱生白细胞介素-2和γ-干扰素、促进淋巴细胞增殖和转化、提高新城疫抗体水平、促进免疫器官发育、提升对新城疫毒株的抵抗力方面，能够显着增强新城疫疫苗的免疫效果，为新型免疫增强制剂和抗病毒制剂的生产、应用提供了理论基础。
郭小参[8]2008年在《淮南猪IL-2基因的克隆及在大肠杆菌和昆虫细胞中的表达》文中认为白细胞介素2(Interleukin-2, IL-2)主要是由激活的T淋巴细胞产生的一类细胞因子,在机体免疫应答中起重要作用。其最重要的功能是诱导T淋巴细胞增殖(从G0期到S期)和分化,并且具有刺激T辅助细胞和自然杀伤细胞分泌细胞因子等功能。本研究以猪IL-2为研究对象,首次克隆出了淮南猪IL-2全基因,然后分别亚克隆到原核与真核表达载体中,并对其生物学活性进行了初步研究。主要内容包括:1.参照GenBank发表的猪IL-2 cDNA基因序列,设计1对引物,将淮南猪脾淋巴细胞在伴刀豆球蛋白A (ConA)的刺激下体外培养27 h后,提取激活淋巴细胞总RNA,进行反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增,然后克隆到pGEM-T Easy载体上并测序。测序结果显示,克隆的淮南猪IL-2 cDNA全长为516个碱基,开放阅读框(ORF)包含465个碱基,编码154个氨基酸,分子量为17.4 KDa,等电点为5.47,疏水氨基酸34%,亲水氨基酸34%,碱性氨基酸11%,酸性氨基酸23%。此cDNA与已报道的猪IL-2同源性为100%,与猫、牛、鸡、狗、鸭、山羊、马、人、家鼠等的IL-2基因进行比较分析,核苷酸同源性分别为83.7%,82.6%,28.2%,80.6 %,29.6%,83.4%,81.3%,82.0%,61.5%。2.为了在大肠杆菌中表达淮南猪IL-2基因,并鉴定其生物学活性,设计1对引物,将编码淮南猪IL-2的成熟蛋白基因亚克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中,获得重组质粒pGEX-IL2,进而转化BL21感受态细胞中;经IPTG诱导后,通过SDS-PAGE检测淮南猪IL-2基因的表达情况,运用Western-blot和MTT法对表达蛋白进行特异性检测和活性测定。结果表明,淮南猪IL-2基因在大肠杆菌中得到高效表达,其表达蛋白具有特异性和生物学活性。3.为了在杆状病毒表达载体中表达猪IL-2基因,并鉴定其生物学活性,设计1对引物,将编码猪IL-2的成熟蛋白基因亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacDual中,获得重组质粒pFBD-IL2,进而转化含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac,发生转座作用;经抗性及蓝白斑筛选得到含猪IL-2基因的重组质粒rBacmid-IL2。然后将重组质粒转染昆虫细胞,间接免疫荧光表明猪IL-2在Sf-9昆虫细胞中获得了表达,SDS-PAGE可检测到分子质量为20 KDa的重组蛋白,Western blot证实该重组蛋白可与兔抗猪IL-2单克隆抗体发生特异性反应,表达产物经纯化后能明显促进猪T淋巴细胞转化。结果表明,猪IL-2基因在昆虫细胞中得到正确表达,其表达蛋白具有生物学活性。综上所述,本研究成功克隆出了河南优良地方品种淮南猪IL-2全基因,并分别在大肠杆菌表达系统和昆虫杆状病毒表达系统中进行了表达,对其表达产物进行了生物学活性测定,为进一步研究猪IL-2功能性蛋白作为分子佐剂在疫苗免疫中的促进作用及开发研制新型免疫增强剂定了基础。
刘文强[9]2005年在《牛羊白细胞介素-18基因的克隆和表达》文中研究说明牛羊白细胞介素18(Interleukin-18,IL-18)及其受体在家畜养殖业中是一种具有广阔应用前景的新型免疫佐剂和免疫治疗剂,在比较免疫学研究上也具有一定意义。根据已发表的IL-18 成熟蛋白cDNA 序列保守区设计一对特异性引物,应用RT-PCR 技术从山羊肺泡巨噬细胞和LPS/ConA 活化的脾细胞中扩增到编码山羊IL-18 成熟蛋白基因,其大小为480bp。将该基因克隆到pMD18-T 载体中,经序列测定表明山羊IL-18 与奶牛和绵羊的IL-18 基因序列高度同源,而且Caspase-1酶切位点的氨基酸序列没有发生变异,决定IL-18 活性的两个关键氨基酸位点也没有发生变异。将该基因从重组pMD-gIL-18质粒中亚克隆到表达载体pET-32a(+)质粒中。将重组表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)中以1mol/L IPTG 诱导4h 或者更长时间进行表达。经SDS-PAGE 试验检测到了gIL-18 与pET 载体融合表达的重组蛋白。以该重组蛋白与佐剂混合后,免疫小鼠制备多克隆血清,经Western-blotting 试验证实该重组蛋白具有免疫原性。经过包涵体变性、层析柱纯化和复性,证实该蛋白具有诱导MDBK 细胞分泌IFN-γ的生物学活性,这为gIL-18 的实际应用奠定了基础。以β-actin 为内参照,使用半定量RT-PCR 法对来源于山羊肺脏单核巨噬细胞、外周血单核细胞(PBMC)、脾单个核细胞、肝细胞、肾单个核细胞、大脑和心肌组织的IL-18 mRNA 的表达进行了测定。结果表明:不论是否加入刺激剂,肺泡巨噬细胞都可以持续的表达IL-18 mRNA,但是被LPS 活化的PBMC 只是微弱的表达IL-18 mRNA,肝和脾细胞经LPS活化后也可以检测到IL-18 mRNA的表达,其水平明显高于PBMC,其它细胞和组织没有检测到IL-18 mRNA。这种在不同细胞中表达的差异可能反映了其产生成熟IL-18 的能力。IL-18结合蛋白(IL-18BP)具有拮抗IL-18生物学活性的作用,可视为IL-18的拮抗剂。以往的研究发现正痘病毒属的几种病毒基因组都含有编码IL-18BP的基因序列。在羊痘病毒基因组序列中也可能有编码IL-18BP的同源基因。以羊痘病毒作为模板,设计一对特异性引物,经PCR扩增了gIL-18BP基因,将该基因克隆到表达载体pET32a(+)中,经IPTG诱导,在大肠杆菌BL21(DE3)中实现了融合表达。目的蛋白以包涵体形式存在。表达产物经过变性、复性和层析纯化后,具有体外抑制羊IL-18刺激MDBK细胞产生IFN-γ的活性。这为研究IL-18主导疾病发生机制及治疗提供了理论和实践依据。
王新华[10]2008年在《鸡IL-18的原核表达蛋白及真核表达质粒对IBD疫苗的免疫增强作用研究》文中研究表明白细胞介素18(IL-18)具有广泛的生物学活性,能够促进γ-干扰素(IFN-γ)的产生,刺激淋巴细胞转化,增强NK细胞的杀伤活性,在介导细胞免疫、抵抗微生物感染方面具有重要的作用。对人和哺乳动物IL-18的研究已有许多报道。本研究室在2001年开展鸡白细胞介素18(ChIL-18)的研究,先后构建ChIL-18的重组质粒和原核表达系统、真核质粒及其表达系统,在此基础上,对纯化后的原核表达的重组鸡白细胞介素18产物进行生物学活性检测,对其在生产中的应用做了初步研究,同时对影响ChIL-18原核表达产物生物学活性的因素也进行了探讨。试验一不同复性方法对rChIL-18原核表达蛋白复性率和生物学活性的影响研究利用不同的复性方法辅助rChIL-18原核表达蛋白的复性,以提高鸡IL-18重组蛋白复性率,获得更多具有良好活性的蛋白。将重组原核表达质粒pGEX-mChIL-18转化宿主细胞大肠杆菌BL21(DE3),并用IPTG于37℃诱导培养获得表达。表达产物主要以包涵体的形式存在。包涵体经超声波破碎、洗涤后以6 mol/L的盐酸胍溶解,使蛋白彻底变性,然后利用盐酸胍-去离子水透析法、盐酸胍-谷胱甘肽变性复性法和人工分子伴侣系统法分别辅助蛋白复性。复性产物经透析纯化后,利用淋巴细胞增殖试验来检测其活性。经SDS-PAGE分析表明,表达产物是与ChIL-18重组蛋白相符的Mr约44000的蛋白条带。利用人工分子伴侣系统辅助复性的方法获得的复性率最高,复性率为42.54﹪。鸡淋巴细胞增殖试验表明,表达产物对鸡淋巴细胞具有明显诱导增殖作用。由上述试验显示,人工分子伴侣系统能够较好地辅助鸡IL-18重组蛋白复性,获得较高的复性率。其产物具有良好的生物学活性,为下一步鸡IL-18重组蛋白的应用研究奠定了试验基础。试验二人工分子伴侣系统辅助鸡IL-18重组蛋白复性过程中影响因素的研究将重组原核表达质粒pGEX-mChIL-18转化宿主细胞大肠杆菌BL21(DE3),并用IPTG于37℃诱导培养获得表达。表达的包涵体经超声波破碎、洗涤后以6 mol/L的盐酸胍溶解,使蛋白彻底变性。然后按照试验设计,考察不同浓度组成的人工分子伴侣体系对不同浓度鸡IL-18重组蛋白复性率的影响。试验结果表明,利用人工分子伴侣系统辅助鸡IL-18重组蛋白的复性存在最佳的条件,优化该条件能够提高该融合蛋白的复性率,且产物都具有良好的生物学活性,为鸡IL-18重组蛋白的进一步应用研究奠定了试验基础。试验叁鸡IL-18原核表达蛋白及真核表达质粒对IBDV灭活疫苗免疫增强作用的研究将鸡IL-18原核表达蛋白的复性产物和真核表达质粒pcDNA3.1TOPO-mChlL18分别与IBDV灭活疫苗联合应用,通过中和抗体检测和T淋巴细胞对ConA增殖反应试验,研究其对IBDV灭活疫苗的免疫增强作用。结果显示,在接种后第21、28、35及42d时蛋白组和质粒组与单纯疫苗组抗体水平差异显着(P<0.05),且蛋白组比质粒组效果更明显一些;其T淋巴细胞的增殖反应也强于单纯疫苗组,尤其是在免疫14天后增殖效果明显高于单纯疫苗组(P<0.05)。接种42d后进行攻毒保护性试验,结果表明:同时接种鸡IL-18原核表达蛋白复性产物和真核表达质粒的试验组鸡获得93.3﹪的保护率,而单纯疫苗接种组的保护率为73.3﹪。鸡IL-18的原核表达蛋白和真核表达质粒均具有明显的增强IBD灭活疫苗免疫效果的作用。结论人工分子伴侣系统能够较好地辅助鸡IL-18重组蛋白复性,获得较高的复性率。其产物具有良好的生物学活性,为下一步鸡IL-18重组蛋白的应用研究奠定了试验基础。利用人工分子伴侣系统辅助鸡IL-18重组蛋白的复性存在最佳的条件,优化该条件能够提高该融合蛋白的复性率,且产物都具有良好的生物学活性。鸡IL-18的原核表达蛋白和真核表达质粒均具有明显的增强IBD灭活疫苗免疫效果的作用。
参考文献：
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[3]. 鸡白细胞介素18成熟蛋白的表达、纯化及其单克隆抗体的制备与特性鉴定[D]. 苏倩倩. 山东农业大学. 2012
[4]. 卢氏鸡主要白细胞介素的克隆分析与IL-21的原核表达[D]. 张旭. 河南科技大学. 2010
[5]. 鸡白细胞介素18成熟蛋白在昆虫杆状病毒系统中的表达及其活性检测[D]. 范忠玲. 山东农业大学. 2010
[6]. 鸡白细胞介素18双抗体夹心ELISA检测方法的建立及初步应用[D]. 王肖祎. 山东农业大学. 2013
[7]. 重组鸡IL-18复合免疫增强剂对新城疫疫苗免疫增强作用的研究[D]. 余宁. 河南科技大学. 2013
[8]. 淮南猪IL-2基因的克隆及在大肠杆菌和昆虫细胞中的表达[D]. 郭小参. 河南农业大学. 2008
[9]. 牛羊白细胞介素-18基因的克隆和表达[D]. 刘文强. 山东农业大学. 2005
[10]. 鸡IL-18的原核表达蛋白及真核表达质粒对IBD疫苗的免疫增强作用研究[D]. 王新华. 山东农业大学. 2008
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