蔡筱彦[1]2002年在《凋亡素基因转入人类肝癌细胞诱导细胞凋亡研究》文中研究说明目的：本研究旨在探讨凋亡素基因表达对人类肝癌细胞的影响。 方法：将凋亡素基因连接到增强型绿荧光蛋白(EGFP)基因C末端的终止密码前，并使两者读框不移位，构建成pEGFP-VP3载体。通过核酸内切酶酶切分析及测序鉴定载体结构。用非脂质体脂质转染法将pEGFP-C2和pEGFP-VP3分别转染两组HepG2细胞，以使EGFP和EGFP-VP3(凋亡素-绿荧光蛋白融合蛋白)得到瞬时表达，同时设立未转染组进行空白对照。通过荧光显微镜观察EGFP和EGFP-VP3在HepG2中的定位、表达量及在细胞生长、凋亡过程中的动态变化，用Annexin V-藻红素(PE)检测细胞凋亡。 结果：EGFP均匀分布于细胞浆和细胞核，细胞形态无变化，细胞能分裂增殖，与未转染组对比细胞凋亡无增加。EGFP-VP3主要定位于HepG2细胞核，呈颗粒状，在六天观察期间，核内的EGFP-VP3颗粒逐渐凝集、变粗，细胞变小、变圆，最后成为无细胞结构和形态的颗粒。同时，转染pEGFP-VP3细胞凋亡明显增加，p值小于0.01，与其它两组比较有显着性差异。转染pEGFP-VP3的HepG2在48小时细胞凋亡率50％。少数转染细胞的EGFP-VP3没有向细胞核聚集、荧光较弱，用Annexin V-PE染色显示无细胞凋亡。 结论：(1)凋亡素基因连接到增强型绿荧光蛋白基因C末端，构建成pEGFP-VP3载体，可以表达凋亡素-增强型绿荧光蛋白融合蛋白；(2)在荧光显微镜下，通过EGFP-VP3可以显示调亡素在细胞中的表达定位、表达量及动态变化；(3)在肝癌细胞HepG2中，凋亡素主要定位于细胞核，呈颗粒状，并随细胞凋亡的过程而逐渐聚集，最后裂解成碎片；(4)凋亡素基因转染HepG2后能诱导该细胞凋亡，核定位是诱导HepG2细胞凋亡的必要条件；(5)凋亡素需达到一定量后才能诱导肝癌细胞HepG2凋亡。
徐晓红[2]2010年在《抗肿瘤双特异免疫导向治疗制剂CAtin的表达及其体内外抑瘤作用》文中认为由抗体介导的免疫靶向治疗是肿瘤生物治疗的主要组成部分,但其发展仍面临诸多挑战,如作为靶向工具的抗体分子量比较大、侵透性差、稳定性弱；所应用抗体多为鼠源抗体,免疫原性较高；所应用抑癌分子特异性较低,存在损伤正常细胞的隐患等。癌胚抗原(carcinoembryonic antigen, CEA)是一种广泛存在于结直肠癌、乳腺癌等多种肿瘤细胞表面的高度糖基化癌胚蛋白。人源化的抗CEA单链抗体(single chain Fv fragment, scFv) T84.66对CEA具有较高特异性,已普遍应用于结直肠癌、乳腺癌等多种肿瘤的诊断和免疫治疗,其疗效已为临床Ⅰ期试验所证实。且scFv T84.66具有结合活性高、侵透性强、免疫原性低和廓清快等优点。scFv T84.66同其它单链抗体一样具有先天缺陷,如较亲本抗体亲合力有所下降；在体温条件下稳定差较差；特定情况下会出现聚集倾向等,这可能与scFv的轻、重链可变区存在非共价键有关,但这种现象会通过引入链间二硫键而有所改观,即将scFv改构为稳定性较高的二硫键稳定型单链抗体(disulfide stabilized single chain Fv fragments, scdsFv)。Apoptin基因来源于鸡贫血病毒(chicken anemia virus, CAV),能够特异性地诱导肿瘤细胞凋亡,而对正常细胞无细胞毒作用。另外,肿瘤的放射治疗和多数化学治疗药物通过p53发挥作用,一旦p53突变即会形成耐药,而Apoptin的凋亡诱导作用不依赖p53,也不受凋亡抑制分子bcl-2等因素的影响,bcl-2分子的存在反而能够增强其作用。因此,Apoptin基因已广泛应用于肿瘤基因治疗研究领域。本研究通过生物信息学方法设计scdsFv T84.66,并利用人工合成方法,将Apoptin基因通过柔性肽序列连接至scdsFv T84.66下游,构建并表达了具有特异性识别／结合CEA功能和特异性杀伤肿瘤细胞功能的抗肿瘤双特异免疫导向治疗制剂CAtin,并在体内、外对其抑瘤作用进行了分析。
李银鹏[3]2009年在《Mcl-1特异性shRNA联合凋亡素治疗肝细胞癌的实验研究》文中指出原发性肝癌是全球第5大恶性肿瘤，在肿瘤相关死亡中排在第3位。手术切除和肝移植仍是当前可能治愈肝癌的主要方法，但绝大多数患者被确诊时已是晚期，失去手术时机。此外，现有的化疗药物并不能提高肝癌患者的生存率，因此，探求新的更有效的肝癌治疗方法是当前迫切需要解决的问题。髓细胞白血病基因-1(myeloid cell leukemia-1 mcl-1)是bcl-2家族成员，其主要作用是促进细胞生存，抑制细胞凋亡。Mcl-1在肝癌组织中明显呈高表达状态，被认为与肝癌的发生密切相关。凋亡素(apoptin)是鸡贫血病毒VP3基因编码的蛋白，能选择性地诱导人转化细胞和肿瘤细胞凋亡，但对正常细胞无诱导凋亡作用。RNA干扰(RN Ain terference，RNAi)技术是一种能够有效抑制目的基因表达的基因治疗工具，已被广泛应用于目的基因功能研究和肿瘤的基因治疗中。本研究针对mcl-1mRNA设计、构建并筛选出表达小发卡状RNA(short hairpin RNA，shRNA)的重组表达质粒，观察mcl-1特异性shRNA对肝癌细胞凋亡的影响，以及与凋亡素联合对肝癌增殖和凋亡的作用，为肝癌的治疗提供新的策略。第一部分靶向mcl-1基因的shRNA真核表达质粒的构建与鉴定目的设计并构建靶向mcl-1基因并含有EGFP基因的shRNA表达质粒。方法根据shRNA的设计原则、载体pGenesil-1.1的酶切位点以及Gengank中mcl-1mRNA序列，设计并合成3对编码shRNA的寡核苷酸链，将寡核苷酸链退火形成互补双链，再克隆至载体pGenesil-1中，构建重组质粒mcl-1.1～mcl-1.3，将质粒转化DH5α菌株，提取质粒，行酶切鉴定和DNA测序鉴定。结果所构建的重组质粒mcl-1.1～mcl-1.3经酶切鉴定及DNA测序证实符合设计要求，证实质粒mcl-1.1～mcl-1.3构建成功。结论成功构建了靶向人mcl-1基因shRNA表达质粒，为一步利用shRNA表达质粒进行肝细胞癌治疗研究奠定了基础。第二部分Mcl-1特异性shRNA的筛选及其对肝癌细胞凋亡的影响目的从所构建的3个shRNA质粒中筛选出对mcl-1基因抑制作用最强的质粒，并观察该质粒对肝癌细胞HepG2凋亡的影响。方法经Lipofectamine 2000介导将所构建的重组质粒mcl-1.1～mcl-1.3及阴性对照质粒HK转染HepG2。转染后48 h于荧光显微下观察并计算质粒的转染率，并分别利用RT-PCR和western blot检测细胞内mcl-1 mRNA和蛋白，确定3种质粒对mcl-1基因的抑制效率，筛选出对mcl-1基因抑制作用最强的质粒。采用Hoechst染色观察所选质粒转染HepG2细胞48 h后的凋亡形态学改变，及PI单染行流式细胞仪检测HepG2的凋亡率。结果重组质粒mcl-1.1～mcl-1.3和阴性对照质粒HK对HepG2的转染率分别为64.00％±3.77％、64.20％±2.10％、63.70％±3.34％和62.5％±2.42％，各组间转染率无明显差异(P=0.59)。质粒mel-1.1～mcl-1.3组mcl-1 mRNA的相对含量分别为0.61±0.02、0.56±0.02和0.46±0.01，mcl-1蛋白的相对含量分别为0.54±0.01、0.48±0.03、0.36±0.01，与HK(mRNA：0.95±0.00，蛋白：0.88±0.01)和空白对照组(mRNA：0.97±0.01，蛋白：0.90±0.03)相比均存在显着性差异(均P=0.00)。质粒Mcl-1.3对mcl-1mRNA和蛋白的抑制率分别为52.27±0.00％和58.98±0.01％，均高于mcl-1.1(mRNA：36.26±0.12％，蛋白：38.80±0.02％)和mcl-1.2(mRNA：41.47±0.13％，蛋白：45.70±0.02％) (均P=0.00)。转染mcl-1.3的细胞经Hoechst染色出现明显凋亡核形态学表现。经流式检测，mcl-1.3转染组HepG2的凋亡率明显高于HK组(7.74％±0.97％VS 2.81％±0.46％P=0.00)结论成功筛选出靶向mcl-1基因的shRNA真核表达质粒，其对肝癌细胞HepG2内的mcl-1基因表达具有明显抑制作用，并可直接导致肝癌细胞凋亡。利用shRNA沉默Mcl-1基因可能是肝癌基因治疗的有效途径之一。第叁部分Mcl-1特异性shRNA联合凋亡素对肝癌细胞增殖和凋亡的影响目的观察mcl-1特异性shRNA与凋亡素联合作用对肝癌细胞增殖和凋亡的影响。方法利用质粒mcl-1.3和pGensil-1.2构建靶向mcl-1基因但不含有EGFP基因的shRNA表达质粒pmcl-1，然后将质粒pmcl-1和pcDNA3.0-vp3转入肝癌细胞HepG2内，利用RT-PCR和western blot检测细胞内mcl-1和vp3的mRNA与蛋白含量及细胞色素C含量，采用MTT法测定细胞增殖情况，Annexin V-FITC／PI双染检测细胞的凋亡率。结果所构建的重组质粒pmcl-1经酶切及DNA测序证实符合设计要求，证实构建成功。经RT-PCR和western blot检测显示，pmcl-1+pcDNA3.0-vp3转染组和pcDNA3.0-vp3转染组vp3阳性，pmcl-1转染组及阴性对照组和空白对照组vp3均为阴性。pmcl-1+pcDNA3.0-vp3组的vp3 mRNA含量为0.83±0.02，蛋白含量为1.48±0.06，与pcDNA3.0-vp3组相比无明显差异(mRNA：0.78±0.37，P=0.20；蛋白：1.40±0.08，P=0.81)。质粒pmcl-1、pcDNA3.0-vp3及pmcl-1+pcDNA3.0-vp3均可明显下调细胞内mcl-lmRNA和蛋白水平，促进线粒体细胞色素C的释放。其中pmcl-1+pcDNA3.0-vp3组的mcl-1 mRNA含量为0.34±0.05，蛋白含量为0.38±0.02，与pmcl-1组(mRNA：0.46±0.03，蛋白0.44±0.03)和pcDNA3.0-vp3组(mRNA：0.43±0.01，蛋白：0.43±0.01)相比，差异均有显着性(均P＜0.05)。pmcl-1+pcDNA3.0-vp3组的细胞色素C含量为1.21±0.09，明显高于pmcl-1组(0.96±0.03，P=0.01)和pcDNA3.0-vp3组(0.98±0.02，P=0.01)。与阴性对照及空白对照相比，质粒pmcl-1、pcDNA3.0-vp3和pmcl-1+pcDNA3.0-vp3处理组的HepG2细胞在转染后1～5天的生长均明显受到抑制，其中质粒pcDNA3.0-vp3对HepG2的生长抑制作用在各时间点均强于pmcl-1(均P=0.00)，pmcl-1联合pcDNA3.0-vp3对HepG2生长的抑制作用较两者单独作用时均强(均P＜0.05)。质粒pmcl-1、pcDNA3.0-vp3及pmcl-1+pcDNA3.0-vp3均可诱导HepG2的凋亡，其中质粒pcDNA3.0-vp3转染24h、48h和72h的凋亡率分别为12.00±1.57％、22.1±2.82％和41.80±3.37％，均高于相应时间pmcl-1组的凋亡率(分别为8.60±0.78％，P=0.03；11.07±0.95％，P=0.03；15.00±1.44％，P=0.00)，而pmcl-1联合pcDNA3.0-vp3转染HepG2 24h、48h和72h的凋亡率分别为17.10±1.04％、29.87±4.59％和52.40±1.73％，均较两者单独作用时均高(均P＜0.05)。结论Mcl-1特异性shRNA与凋亡素有协同作用，两者联合可增强对肝癌细胞生长的抑制，增加肝癌细胞的凋亡，是治疗肝癌的有效方法之一。凋亡素诱导的肝癌细胞凋亡与其抑制mcl-1基因，促进线粒体细胞色素C的释放有关。
陈立刚[4]2006年在《含新城疫病毒HN基因重组核酸疫苗抗肿瘤作用研究》文中进行了进一步梳理本研究将新城疫病毒HN基因与人白细胞介素18基因融合表达并与凋亡素VP3基因共同克隆入真核表达载体pIRESneo,构建了能够同时表达上述3种外源基因的重组真核表达质粒,并对重组质粒进行了表达鉴定。将重组质粒pIRVP3IL-18HN转染胃癌细胞BGC-823,采用各种细胞生物学方法观察了重组质粒pIRVP3IL-18HN转染致BGC-823肿瘤细胞的死亡方式及通路。实验结果表明,重组质粒pIRVP3IL-18HN转染最终导致肿瘤细胞凋亡,主要是通过线粒体途径诱导肿瘤细胞凋亡。复制了C57BL/6小鼠荷H22肿瘤模型,瘤内注射所构建的重组质粒pIRVP3IL-18HN,电镜及病理组织学切片显示肿瘤细胞存在凋亡现象,对实验组小鼠脾淋巴细胞亚群分类检测结果显示,重组质粒可不同程度地提高CD4+、CD8+ T淋巴细胞数量,推测重组质粒pIRVP3IL-18HN主要通过恢复机体的细胞免疫水平来提高其抑制肿瘤的作用。本研究提示,重组质粒pIRVP3IL-18HN在动物体内发挥了抗肿瘤作用,并且HN基因、IL-18基因和VP3基因具有协同抑瘤效应。
王春艳[5]2010年在《组蛋白H4融合蛋白载体用于肿瘤基因治疗的研究》文中指出作为一类新型的非病毒基因转运工具,蛋白或多肽介导的基因转运越来越表现出强大的基因转运效率。在当前的研究中,一些研究人员发现,组蛋白能有效的介导基因转运(组蛋白转染)。小麦组蛋白H4是构成核小体的核心组蛋白,由103个氨基酸组成,它的基因序列和蛋白的空间结构最初是由Tabata等人1983年发表的。它与人的组蛋白H4及其它真核生物的组蛋白H4有着高度的同源性,基因内部均不含内含子序列。在氨基酸组成上来讲,与人的组蛋白H4氨基酸序列相比,只有第61和78两个位点的氨基酸差异。这个分子量大约在11.0 kDa小分子蛋白,由于它的低毒性和低免疫原性,是一个较好的基因转运工具的候选分子。基于此,我们构建了组蛋白H4融合蛋白基因转运载体。蛋白跨膜结构转导域(PTDs)是一类能穿越哺乳动物细胞质膜的小分子多肽类物质,这类物质已经被广泛应用于蛋白质治疗的各个领域。研究人员可以通过基因工程的方法将PTDs的基因与细胞毒作用的蛋白进行融合与表达,借此将异源目的蛋白携入细胞内。PTD-tat是研究比较透彻的一个穿膜肽。它是来源于HIV-1病毒的TAT蛋白的一个多肽结构域,由11个氨基酸组成。它的组成序列,YGRKKRRQRRR,由几个强碱性的氨基酸序列组成的,并且是完成穿膜作用的关键肽段。考虑到PTD-tat在药物运输中起到的重要作用,很多人利用此分子作为治疗性分子或粒子进入哺乳动物细胞的重要工具。尽管有报导称,四种核心组蛋白都有蛋白跨膜转运的能力,但是在研究表明,与单纯的组蛋白相比较,引入PTD-tat融合组蛋白作为DNA转运工具,在很大程度上能够提高组蛋白转染细胞的效率。正是因为此多肽能够高效的介导小分子和大分子的细胞内摄,在本研究中,我们将此肽整合进入小麦组蛋白H4的C末端,以保证小麦组蛋白H4能通过PTD-tat的途径高效的将治疗基因携入细胞内。除此之外,靶向性药物专一地用于治疗癌症有着许多优点,例如可以维持一个较低的给药浓度,就能将药物从血清中运送至靶细胞,还可以减少药物的副作用,并且可以提高抗肿瘤的效率。一个成功的靶向性药物传输系统必须能够获得很高的细胞穿膜效率并能停滞于特异性的细胞类群上。这种特异性是通过将靶向性的基序与药物传输系统相结合,而这些基序也必须能够精确的与癌症细胞表面的受体相结合。这样才能有效的降低药物对正常的健康组织的副作用。促黄体素释放素(LHRH)的受体在人乳腺癌、卵巢和子宫内膜肿瘤以及前列腺癌细胞等肿瘤细胞表面过量表达,而在正常内脏组织细胞表面没有表达,因此,我们利用LHRH作为靶向性的基序转运抗肿瘤药物至特定的癌症细胞,起到了很好的效果。本研究构建了一个异源性的、有组氨酸标签的重组小麦组蛋白H4,命名为H4TL。在小麦根尖组织中提取了小麦基因组,目标基因H4TL包含小麦组蛋白H4基因,蛋白跨膜转导肽TAT基因以及靶向性配体分子LHRH的基因序列。通过PCR方法在小麦基因组中扩增H4基因,利用重迭延伸PCR方法对基因进行改造。经过6次PCR,每次PCR片段均克隆进pMD18T载体中进行鉴定,鉴定正确后的片段进入下一次延伸反应,最后得到了编码完全正确的基因片段,将此片段插入改造过的原核表达载体pET28a (++)中,得到重组pET28a(++)-H4TL质粒。将鉴定正确的质粒转入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中,利用IPTG诱导表达。此目的蛋白在大肠杆菌中获得高效表达。目的蛋白是一个含有141个氨基酸,分子量为15.5 kDa小分子蛋白。利用抗His标签的单克隆抗体对目的蛋白进行了Western blot鉴定。将表达阳性的细胞通过摇瓶进行发酵培养,通过改变诱导条件,优化了最佳表达条件,培养基PH为6.8-7.6,诱导剂IPTG浓度范围0.6-1.0mM,诱导温度25-30℃,诱导时间>10h,得到了高效可溶性表达,表达量占菌体总蛋白的35%以上。收集发酵瓶中细胞,用超声波破碎后离心,上清过滤后冷冻保存。用质量分数为30%的硫酸铵溶液盐析沉淀目的蛋白,随后用6M盐酸胍变性结合亲和层析分离和纯化融合蛋白H4TL,亲和纯化的介质为Ni~+-葡聚糖。100-200mM的咪唑进行梯度洗脱,收集到峰期的洗脱液,用凝胶层析脱盐柱快速脱盐,纯化后的样品经超滤柱或PEG20000进行浓缩,于超净工作台用0.22μm滤膜过滤后冷冻保存。最终建立了一种有效的纯化方法,对重组蛋白进行了高效的分离和纯化,高效液相色谱分析其纯度达到了95%以上。用SmartSpecTM plus分光光度法测定纯化后蛋白浓度,分别按蛋白/质粒DNA质量比0-8进行凝胶电泳阻滞试验,凝胶电泳阻滞结果证明重组蛋白H4TL可以有效的结合质粒DNA。在凝胶电泳阻滞试验的基础上,我们对结合后的蛋白/DNA复合物进行了降解试验。核酸降解试验结果证明了重组蛋白与DNA形成的复合物有很强的稳定性,并且可以有效的防止DNA酶的降解。更重要的是,此蛋白成功地将报告基因pEGFP/C1转染进入人乳腺癌细胞MCF-7,人卵巢癌细胞HO8910,人前列腺癌细胞LNCap,人肺癌细胞A549以及人宫颈癌细胞HeLa中,转染效率与细胞类型、复合物浓度、蛋白与质粒DNA的配比、细胞密度及Ca~(2+)浓度有关。我们确立的最佳的转染条件为蛋白与质粒DNA质量比4:1,转染前细胞为60-70%丰度,Ca~(2+)浓度为2-4mM。凋亡素,是一个来源于鸡贫血病毒的小分子蛋白质,之所以受到人们关注,是因为它可以选择性的杀死肿瘤细胞而对正常细胞无毒性作用。凋亡素的亚细胞定位是肿瘤特异性的关键因素,在正常细胞中,它位于细胞质中,而有肿瘤细胞中它可以转运进入细胞核中。凋亡素的这种核定位机制主要是由自身的磷酸化水平控制的。在肿瘤细胞中,凋亡素引起活细胞内包括Akt等激酶物质的核聚集,并且可以被CDK2磷酸化。因此,凋亡素可以间接地在活细胞内传递细胞凋亡信号。此外,凋亡素也会以多聚物的形式与DNA分子相结合,通过与几个核靶分子相互作用,例如与促细胞后期复合物相互作用,导致G2/M期逃逸。这种促凋亡信号由信号分子Nur77经核传递给细胞质,激活非p53依赖的线粒体途径,诱导肿瘤细胞凋亡。我们利用靶向性的蛋白H4TL作为载体,进行凋亡素基因的转染研究,来评价H4TL的转染效率及其凋亡素转入细胞后的释控及表达,同时检测凋亡素基因对人乳腺癌细胞MCF-7及人卵巢癌HO8910两种肿瘤细胞的凋亡作用。我们构建了凋亡素真核表达载体pcDNA3.1(+)/apoptin,利用重组蛋白H4TL将其转染进入受试细胞中。利用经典的RT-PCR和western blot分析其在受试细胞中的表达情况;MTT法检测了转染凋亡素后细胞的增殖抑制情况,利用Annexin V–FITC /PI双荧光染色法对转染后的细胞进行细胞凋亡的检测,得到了较高凋亡率,对阴性的对照细胞系-正常人肺胚二倍体细胞2BS的凋亡率不超过20%,MCF-7细胞的凋亡率达到了42%(对照组为9.18%); HO8910细胞的凋亡率为44%(对照组为3.31%)。此外,我们利用DNA ladder法检测了凋亡后细胞中的基因组DNA的片段化,利用罗丹明123作为荧光染料检测了处于凋亡状态的细胞的线粒体膜电位的缺失情况,这些试验帮助我们进一步验证了重组蛋白H4TL作为基因转运载体和凋亡素作为治疗基因的有效性。同时,这些结果说明了靶向于肿瘤特异性受体的非病毒载体为基因转运提供了一个廉价的、简单高效的工具。
朴秉国[6]2011年在《表达NDV HN基因重组腺病毒对BEL-7402细胞及转移模型的抑制作用》文中指出本研究对具有肿瘤特异性复制和肿瘤靶向性杀伤功能的重组腺病毒Ad-HP和Ad-HT的肝癌(BEL-7402)抑制作用进行了探讨。本研究首先利用MTT染色等方法,探讨了Ad-HT和Ad-HP对体外培养的人肝癌细胞BEL-7402的抑制作用。结果表明,Ad-HT和Ad-HP均可有效抑制BEL-7402细胞的增殖,且其作用在一定条件下呈现剂量和时间依赖关系。本研究利用台盼蓝染色、AO/EB染色、Annexin V染色和DAPI染色对Ad-HT和Ad-HP抑制BEL-7402细胞的方法进行了探讨。结果表明,Ad-HT和Ad-HP均可造成BEL-7402细胞的细胞膜通透性增加、细胞核凝聚、磷脂膜外翻。虽然不同检测方法所得到结果不尽相同,但仍可推断,Ad-HT和Ad-HP能够通过诱导细胞凋亡抑制BEL-7402肿瘤细胞的增殖。本研究利用流式细胞术、Western blot等方法探讨表达NDV HN基因重组腺病毒对细胞凋亡信号转导系统内线粒体膜电位、活性氧水平和Caspase酶活性等关键控制点信号分子的影响。实验结果表明,Ad-HP和Ad-HT均可不同程度的上调BEL-7402细胞Caspase酶活性和活性氧水平,并不同程度的降低BEL-7402细胞线粒体膜电位。可以推断,表达NDV HN基因重组腺病毒通过线粒体途径诱导BEL-7402细胞发生凋亡,从而体现其对BEL-7402细胞的抑制作用。本研究利用小鼠肝癌的肺转移和实体肿瘤模型探索了Ad-HP和Ad-HT在体内的抑瘤作用。结果表明,Ad-HP和Ad-HT具有减缓肿瘤组织生长速度、延长模型动物平均生存期和刺激免疫的作用。
方小勇[7]2014年在《光动力治疗与VP3基因联合治疗鼻咽癌的疗效研究》文中指出光动力治疗(Photodynamic therapy, PDT)是采用一定波长的光照射蓄积于肿瘤细胞内的光敏剂,发生光物理化学反应,产生单态氧和自由基等其他活性物质、破坏肿瘤微血管、增强机体免疫力,促进细胞凋亡以杀伤肿瘤细胞的一种非手术治疗方法。然而PDT是对氧的依赖性及治疗深度的局限性限制其在肿瘤治疗中的广泛应用。近年来,随着基因治疗日益成为治疗肿瘤的最有前景的手段之一,PDT与基因治疗有机结合形成的PDT/基因治疗可能是一种治疗肿瘤的崭新策略。本文将分章讨论自杀基因VP3对鼻咽癌细胞的杀伤作用及体外体内实验验证PDT联合自杀基因VP3治疗鼻咽癌的疗效。第一章自杀基因VP3对鼻咽癌CNE-2细胞生长、增殖及凋亡的影响目的体外实验研究VP3基因其对鼻咽癌细胞CNE-2生长、增殖、凋亡的影响,以求证实VP3对鼻咽癌细胞的凋亡诱导效应。方法采用脂质体转染法将构建的PcDNA3.1(-)VP3-Myc(PVP3)及对照空载体质粒PcDNA3.1(-)转染鼻咽癌CNE-2细胞。通过荧光显微镜观察质粒转染效率,CCK-8法检测细胞生存率,RT-PCR、Western blot法检测VP3表达效果,通过Annexin V检测VP3对细胞凋亡的影响。结果1.VP3mRNA在野生型及空载体质粒转染组细胞中均无明显表达,在PVP3质粒转染组中有明显表达,相对表达量约1.27±0.24。VP3蛋白(apoptin)在野生型及空载体质粒转染组细胞中均无明显表达,在PVP3质粒转染组中有明显表达,相对表达量约0.22±0.06。2.空载体质粒转染组在24h、48h、72h细胞存活率分别为97.6±1.4%,94.2±1.7%、92.3±2.1%；PVP3质粒转染组在24h、48h、72h细胞存活率分别为79.7±3.6%,61.5±2.3%、52.4±3.8%。PVP3质粒转染与空载体质粒转染组比较有明显统计学差异(P<0.001)。3.空载体质粒转染组在24h、48h、72h细胞凋亡率分别为4.5±1.2%、5.1±0.8%、5.7±1.4%；PVP3质粒转染组在24h、48h、72h细胞凋亡率分别为11.6±2.4%、17.8±1.4%、27.3±3.3%。PVP3质粒转染与空载体质粒转染组比较有明显统计学差异(P<0.001)。结论成功建立了VP3基因稳定表达的鼻咽癌CNE-2细胞株,体外实验证实了VP3能明显抑制鼻咽癌CNE-2细胞的生长增殖,并能促进CNE-2细胞的凋亡,为后续实验提供了研究依据第二章光动力治疗联合VP3基因治疗对鼻咽癌CNE-2细胞的体外实验研究目的拟对VP3联合PDT对鼻咽癌CNE-2细胞进行体外实验研究,以证实VP3联合PDT对鼻咽癌CNE-2细胞的杀伤效果。方法稳定表达VP3基因的鼻咽癌细胞CNE-2及对照组细胞分别接受不同能量密度的PDT治疗,CCK-8法检测细胞生存率,Annexin V法、Tunnel法检测细胞凋亡。结果1.不同能量密度的PDT处理后,PVP3组细胞存活率明显低于空载体质粒转染组细胞,实验组细胞在1、3、6.25J/cm2能量密度下生存率分别为0.533±0.036、0.312±0.027、0.171±0.032；对照组细胞在1、3、6.25J/cm2能量密度下生存率分别为0.816±0.058、0.570±0.044、0.308±0.047,两组比较有明显统计学差异(P<0.001)。2.Annexin V检测显示PVP3组细胞凋亡率明显高于空载体质粒转染组细胞,实验组细胞在1、3、6.25J/cm2能量密度下凋亡率分别为0.363±0.025、0.672±0.043、0.741±0.039；对照组细胞在1、3、6.25J/cm2能量密度下凋亡率分别为0.266±0.027、0.568±0.055、0.671±0.046,两组比较有明显统计学差异(P<0.001)；Tunnel法检测显示实验组细胞中大部分细胞膨胀,细胞核碎裂,对照组细胞膜较完整,部分细胞呈空泡状,细胞核浓缩,呈块状,少量细胞细胞核碎裂。结论细胞实验研究发现与单纯PDT相比,PVP3+PDT联合治疗能显着抑制鼻咽癌CNE-2细胞的生长增殖,并且能显着增强鼻咽癌CNE-2细胞的凋亡。第叁章VP3联合光动力治疗对鼻咽癌CNE-2细胞裸鼠移植瘤作用的实验研究目的动物实验中比较VP3联合PDT与单纯PDT或VP3基因治疗对鼻咽癌的疗效,以进一步证实VP3联合PDT对鼻咽癌的高效杀伤效果。方法构建裸鼠人鼻咽癌移植瘤模型,PDT处理后,测量并记录肿瘤的大小、重量;HE染色比较各组移植瘤病理学特点；免疫组化检测移植瘤中apoptin的表达。结果1.空载体质粒组、PVP3质粒组、CNE2/Mock+PDT和CNE2/VP3+PDT处理后0、3、7、14天时分别比较四组肿瘤体积,经ANOVA方差分析,四组间肿瘤体积差异有显着性意义,经两样本独立t检验方法进行两两比较,结果显示CNE2/VP3+PDT处理组肿瘤体积与其他各组相比明显减小(P<0.001)；且CNE2/VP3组肿瘤体积较CNE2/Mock组明显减小(P<0.001)。2.四组移植瘤重量差异有显着性意义,经LSD方法进行两两比较,CNE2/VP3+PDT处理组移植瘤重量与各对照组相比明显减小(P<0.001); CNE2/VP3组移植瘤重量较CNE2/Mock组明显减小(P<0.001)。3.HE染色检查发现CNE2/Mock组移植瘤肿瘤细胞形态正常,瘤体内见毛细血管丰富,未见明显坏死组织；CNE2/VP3组移植瘤肿瘤细胞形态正常,可见少许坏死区域；CNE2/Mock+PDT组移植瘤见大量肿瘤细胞变性及核固缩,伴有部分片状坏死区域；CNE2/VP3+PDT组移植瘤见大片状坏死区域,仅少量癌细胞岛残留。4.免疫组化检查发现CNE2/Mock组及CNE2/Mock+PDT组未见明显apoptin蛋白表达；CNE2/VP3组及CNE2/VP3+PDT组apoptin蛋白强表达,且其主要在细胞核中表达。结论利用基因治疗或者光动力治疗均能抑制鼻咽癌裸鼠移植瘤生长,而光动力治疗联合基因治疗较单纯的光动力治疗或基因治疗对鼻咽癌裸鼠移植瘤有更好的杀伤效果。光动力治疗联合基因治疗为鼻咽癌的临床治疗提供了实验基础。
陈漉[8]2009年在《特异性抗肿瘤重组腺病毒抑癌作用研究》文中研究指明为更好的研究重组腺病毒抗肿瘤制剂在临床应用过程中存在的安全性和有效性,本研究利用分子生物学、病毒学和免疫学等技术和手段,通过同源重组方法构建了分别含有特异性抑癌基因HN、Apoptin的特异性抗肿瘤重组腺病毒;同时构建了对照重组腺病毒,Ad-EGFP。通过一系列实验研究证明,所获得重组腺病毒性状稳定,形态完整。通过MTT染色、AO/EB染色、流式细胞术等方法检测了重组腺病毒感染对HepG-2人肝癌细胞的抑制作用。证明了,Ad-Apoptin和Ad-HN重组腺病毒可不同程度地抑制体外培养的HepG-2肿瘤细胞。利用Annexin V染色、DAPI染色、Caspase活性检测等方法探讨了所构建重组腺病毒致HepG-2细胞死亡的方式。证实了,Ad-Apoptin、Ad-HN重组腺病毒主要以诱导凋亡的方式抑制体外培养的HepG-2肿瘤细胞。通过在C57BL/6小鼠荷小鼠肝癌(H22)肿瘤模型上的体内实体肿瘤抑制试验,发现Ad-Apoptin、Ad-HN均可不同程度地抑制实体肿瘤的生长,提高荷瘤动物模型生存率,延长荷瘤动物模型生存期。另外,Ad-HN还可以刺激机体产生抗肿瘤免疫效应。上述研究为揭示HN、Apoptin的抑瘤和免疫调控机理提供了有价值的参考数据。
韩苏夏[9]2008年在《SP-TAT-VP3融合基因表达对肝癌治疗作用的实验研究》文中研究指明近年来,随着分子生物学研究的进展和对肿瘤发病分子机制认识的深入,通过将人的正常基因或有治疗作用的基因以一定的方式导入人体靶细胞的肿瘤基因治疗手段开始进入临床。基因治疗针对的是疾病的根源——异常的基因本身,其理论基础和强大生命力显而易见,因此具有重大的医用价值和巨大的社会价值。肝癌被称为“癌中之王”,是肝胆外科最常见的恶性肿瘤。全世界半数左右的患者集中在我国,每年约有11万人死于肝癌,主要是由于适用于手术切除的病例很少。对于不能手术切除的肝癌,其非手术疗法首选经肝血管化疗栓塞和超声引导经皮穿刺瘤内无水酒精注射,但目前的疗效并不令人满意。上述基因治疗方法可望为肝癌的治疗提供一条新途径。VP3是一种来源于鸡贫血病毒的小蛋白,能特异性诱导肿瘤细胞和转化细胞凋亡,而对正常细胞无凋亡诱导作用。VP3的肿瘤细胞特异性与其在细胞中的亚细胞定位有关,在转化或肿瘤细胞中VP3定位于细胞核,而在正常细胞中定位于细胞质。VP3的磷酸化决定其核定位,在肿瘤细胞中VP3被磷酸化,磷酸化的VP3进入细胞核,并诱导细胞凋亡。VP3诱导的细胞凋亡不依赖p53,不为Bcl-2、Bcl-xL的过表达所抑制,但VP3诱导的快速凋亡效应需要caspase3的活化。VP3具有很强的形成聚合体的倾向,在细胞内表达的VP3以多聚体形式存在,但多聚体的形成和解聚并不是其诱导凋亡所必需的。VP3此种特性向我们展示了其在肿瘤治疗领域诱人前景。HIV-TAT是近年来发现的一种新型的高效运输载体—蛋白质转导结构(proteintransductⅠ-on domains,PTDs)或称细胞穿膜肽(cell penetrating peptides,CPP)。HIV-TAT能穿透细胞膜、细胞核膜,携带肽、蛋白质和DNA分子等进入胞质和胞核发挥生物效应,具有高效性、无须耗能或通过受体转运的特点,为提高靶细胞在体内外的基因转移效率和蛋白质表达提供了一个高效、简便的方法。目前的体内及体外试验显示HIV-TAT可以穿过包括神经元细胞在内的所有组织细胞,且未观察到明显毒副作用。本研究是探寻有效的、安全的和特异的治疗恶性肿瘤的生物学方法。我们选用了鸡贫血病毒的VP3蛋白作为治疗肿瘤的特异分子,使用信号肽序列来实现非肿瘤细胞转导后的长期持续分泌表达。采用TAT-VP3融合表达方式,保证治疗分子可以进入未转染的残余肿瘤细胞和已经转移的肿瘤细胞,并确保治疗分子导入肿瘤细胞核内的靶部位。通过以上设计来实现对肝癌等实体瘤安全有效的特异性治疗。在研究过程中,我们以人肝癌HepG_2细胞作为研究对象。通过DNA重组技术,用pCDNA3.1/VP3质粒为模板,构建SP-TAT-VP3融合基因plenti6-V5-D-TOPO~(?)载体。然后用MTT法、Annexin V-FITC/PI染色和流式细胞术分别检测细胞增殖、凋亡活性和细胞周期,并制作动物模型系统研究重组SP-TAT-VP3对HepG2细胞及动物模型的治疗作用。本实验主要结果及结论为:1.成功构建了稳定表达SP-TAT-VP3融合基因的真核表达载体。2.SP-TAT-VP3融合基因的表达可有效的抑制人肝癌HepG2细胞的生长。3.体外实验表明SP-TAT无明显的细胞毒性。4.成功证明SP-TAT-VP3融合基因转染后可有效的分泌至细胞外,并通过旁观者效应起作用。5.体内实验结果表明,SP-TAT-VP3融合基因的表达可以降低人肝癌HepG2细胞的体内成瘤能力,瘤体缩小。因此,SP-TAT-VP3融合基因的表达,能引起肿瘤细胞增殖活性降低、细胞凋亡,并引起细胞周期G1期阻滞,有望成为一种新的肿瘤辅助治疗方法。
林敏[10]2014年在《载基因靶向高分子超声微泡递送系统的构建及相关性能研究》文中研究表明目的:本实验拟采用高分子材料为成膜材料,包裹惰性气体制备载质粒DNA的超声微泡造影剂,并对微泡进行靶向修饰,为乳腺癌靶向基因治疗提供一种高稳定性的超声微泡治疗方法,同时为基因转染提供一种新型的非病毒载体。方法:1.采用免疫荧光法鉴定叁种不同乳腺癌细胞株BT474、SK-BR-3、MDA-MB-231细胞表面HER-2抗原的表达情况;采用碱裂解法抽提前期实验成功构建的重组质粒pGPU6/GFP/Neo-survivin,并检测纯度及浓度;用X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent体外转染乳腺癌细胞,比较不同乳腺癌细胞株基因转染效率。2.阳离子脂质DC-Chol与质粒DNA溶液按照+/-电荷比5:1,2:1,1:1,1:2,1:5混合,制备具有不同+/-电荷比例的DC-Chol/DNA复合物,琼脂糖凝胶电泳阻滞试验检测不同电荷比时DC-Chol包裹质粒DNA的能力。3.选取mPEG-PLLA及DC-Chol做为微泡外壳材料,采用单乳化法制备包裹气态全氟戊烷的高分子微泡,利用静电作用将碘化丙啶(PI)标记的质粒DNA连接到微泡上,观察微泡的形态、密度、粒径、分布范围及与质粒DNA的连接情况。4.合成成膜材料PLGA-PEG-COOH,并选取mPEG-PLLA、PLGA-PEG-COOH及DC-Chol做为微泡外壳材料,采用单乳化法制备包裹气态全氟戊烷的高分子微泡,利用静电作用将PI标记的质粒DNA连接到微泡上,并采用碳二亚胺法活化微泡上的羧基,与Herceptin抗体偶联,观察微泡的形态、密度、粒径、分布范围,并分析微泡与质粒DNA及靶向抗体同时连接率,及其与HER-2(+)乳腺癌BT474细胞的特异性结合能力。结果:1.免疫荧光法鉴定结果显示,乳腺癌BT474细胞可与生物素化的Herceptin结合于细胞表面发出绿色荧光,且荧光强度最高,SK-BR-3细胞次之,而MDA-MB-231细胞及PBS阴性对照均未见荧光;提取的重组质粒DNA纯度高,符合基因转染要求;X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent体外转染BT474、SK-BR-3、MDA-MB-231细胞后,BT474细胞转染率最高,MDA-MB-231细胞次之,而SK-BR-3细胞最低,叁种细胞绿色荧光强度均随时间延长呈增高趋势。2.当DC-Chol/DNA复合物电荷比为2:1时,质粒DNA在琼脂糖凝胶上呈现完全阻滞;当电荷比为1:1时,泳道上开始出现DNA条带,并且随着电荷比减小,泳道上DNA条带越明显。3.采用单乳化法制备的载质粒DNA高分子超声微泡造影剂分散良好,平均粒径为(3.2±1.2)μm,密度为4.23×108/ml;荧光显微镜观察,微泡表面均带有红色荧光(DNA-PI),表明载基因高分子超声微泡构建成功。4.PLGA-PEG-COOH经核磁共振波谱特征分析,证实合成成功;采用单乳化法制备的载基因靶向HER-2抗原的高分子微泡形态完整,平均粒径为(3.0±1.5)μm,密度为8.8×107/ml,碳二亚胺法活化羧基后与抗体偶联,荧光显微镜观察微泡表面均带绿色荧光,未活化组未见绿色荧光,表明抗体与高分子超声微泡连接成功;流式细胞仪检测同时表达IgG-FITC绿色荧光及PI红色荧光的微泡比例为96.28%,且制备的载基因靶向微泡可与HER-2(+)的细胞特异性结合。结论:1.乳腺癌BT474细胞株表面HER-2抗原表达量最多且体外转染率最高,是进行超声介导载基因靶向HER-2抗原高分子微泡递送系统体外细胞转染的较理想的研究对象。2.以mPEG-PLLA、PLGA-PEG-COOH及DC-Chol为成膜材料成功制备出包裹气态全氟戊烷的载基因靶向HER-2抗原的高分子超声微泡造影剂,且稳定性高,在体外可与HER-2(+)的人乳腺癌BT474细胞特异性结合,为下一步乳腺癌基因治疗提供了一种新型的基因载体。
参考文献：
[1]. 凋亡素基因转入人类肝癌细胞诱导细胞凋亡研究[D]. 蔡筱彦. 暨南大学. 2002
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[3]. Mcl-1特异性shRNA联合凋亡素治疗肝细胞癌的实验研究[D]. 李银鹏. 华中科技大学. 2009
[4]. 含新城疫病毒HN基因重组核酸疫苗抗肿瘤作用研究[D]. 陈立刚. 吉林大学. 2006
[5]. 组蛋白H4融合蛋白载体用于肿瘤基因治疗的研究[D]. 王春艳. 吉林大学. 2010
[6]. 表达NDV HN基因重组腺病毒对BEL-7402细胞及转移模型的抑制作用[D]. 朴秉国. 吉林大学. 2011
[7]. 光动力治疗与VP3基因联合治疗鼻咽癌的疗效研究[D]. 方小勇. 中南大学. 2014
[8]. 特异性抗肿瘤重组腺病毒抑癌作用研究[D]. 陈漉. 吉林大学. 2009
[9]. SP-TAT-VP3融合基因表达对肝癌治疗作用的实验研究[D]. 韩苏夏. 西北大学. 2008
[10]. 载基因靶向高分子超声微泡递送系统的构建及相关性能研究[D]. 林敏. 福建医科大学. 2014
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